1、 本科毕业论文 （ 20 届） 玉筋鱼群体遗传变异研究 所在学院 专业班级 农业资源与环境 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 目录 中文摘要 . 1 英文摘要 . 2 1. 前言 . 1 1.1 玉筋鱼渔业生物学研究进展 . 1 1.2 玉筋鱼种群遗传学研究进展 . 2 1.3 线粒体 DNA 及其作用 . 2 1.4 研究目的及意义 . 3 2. 材料与方法 . 3 2.1 实验来源 . 4 2.2 样本组 DNA 提取 . 4 2.3 PCR 扩增与序列测定 . 4 2.4 数据分 析 . 4 3 结果 . 5 3.1 单倍型及核苷酸多样度 . 5 3.2 遗传分化指数 F
2、ST 及 NJ 系统树 . 17 4 小结 . 20 致谢 . 错误 !未定义书签。 参考文献 . 22 摘要 玉筋鱼 (Ammodytes personatus Giraid)属玉筋鱼亚目、玉筋鱼科、玉筋鱼属，俗称面条鱼、沙钻 ,为冷温性小型鱼类，分布于我国的渤海、黄海北部及朝、韩、日俄远东海区。目前玉筋鱼是我国北方沿海重要的经济鱼类，为阐明玉筋鱼不同地理群体的遗传结构和遗传变异，对玉筋鱼中国青岛群体 (38 尾 )、日本青森群体 (19 尾 )和日本福冈 (12 尾 )群体，共 69个个体的线粒体 DNA (mitochondrial， mtDNA)控制区片段序列进行测定和分析，共获得长度
3、为 530bp 的控制区片断的一致序列。在所获得的 69 个个体中总共检测到 69 个单倍型，各单倍型间的变异有一定的插 入和缺失。三个群体的单倍型多样性指数均为 1.00。核苷酸多样度以青森群体最高 ,0.0266 0.0041， 其它两个群体较低，福冈群体则只有 0.0105 0.0031，最低的为黄海群体，指数为 0.0123 0.0007。在平均碱基差异数方面，青森群体的数值最大，为 13.819 0.512；其次是黄海群体，数值为 6.492 0.520；最小的是福冈群体，数值为 5.561 0.337。根据控制区序列构建的 NJ 系统树显示所有玉筋鱼个体分为 A、 B 两支， A
4、支在 3 个群体中都检测到， B 支只在青森群体中检测到。玉筋鱼 3 个群体 间 成对 的 FST值 表明 玉筋鱼的群体有显著的遗传结构分化，青森群体有了一定的独立性，同其他两个群体有显著的遗传差距 。 本研究结果 有力地表明 玉筋鱼种群在中日海域距离较近的地方存在基因交流，但距离黄海较远的太平洋海域的青森群体同青岛群体间的基因交流存在非常有限 。 关键词 玉筋鱼 遗传多样性 控制区序列 Abstract The sandeel (Ammodytes personatus Giraid) belongs to the Ammodytoidei, Ammodytidae. It is a kin
5、d of small fish in cold water, which widely distributes among the Bohai Sea, Yellow Sea, the North and South Korea, Japan and Russia Far East. At present it is the important economical fish of coastal in north part of our country. For the exposition of geography communitys heredity structure and the
6、 hereditary change, we detected and analysed the ammodytes community(38) in Qingdao of China, the Japanese aomori community (19) and the Japanese Fukuoka (12) community, altogether 69 individuals line plastochondria DNA (mitochondrial, mtDNA) control region . Then we obtained the length is the 530bp
7、 control area piece consistent sequence. Among 69 individuals altogether, 69 Haplotype was examined, and variation between various Haplotype had certain insertion and the missing. The dibersity index of three communitys Haplotype is 1.00. Nucleotide diverse is highest by the aomori community, at 0.0
8、2660.0041, two others communities are lower. Fukuoka community is only 0.01050.0031, while the lowest index is 0.01230.0007 of the Yellow Sea community. At the average basic group different number aspect, the aomori communitys value is biggest, and it is 13.8190.512. Next is the Yellow Sea community
9、 with the value of 6.4920.520 and What is smallest is the Fukuoka community with the value of 5.5610.337. According to the control region constructions NJ genealogical tree ,it demonstrated that all launce individual divided into A&B two kind. A was examined in 3 communities, bur B was only examined
10、 in the aomori community. Ammodytes pairs of FST values among the three communities indicates that there is a significant genetic structure differentiation. Aomori groups have a certain independence, with the other two groups having significant genetic difference. This findings indicates powerfully
11、that the sandeel exists gene exchange which is close to the Sino-Japanese sea area, but gene exchange existence is limited between Pacific Ocean sea areas aormori community which is far away from the Yellow Sea and Qingdao community . Keywords Ammodytes personatus Genetic variation Control region 1
12、1. 前言 1.1 玉筋鱼渔业生物学研究进展 玉筋鱼 (Ammodytes personatus Giraid)属玉筋鱼亚目、玉筋鱼科、玉筋鱼属， 在 我国的渤海、黄海北部及朝、韩、日俄远东海区 有分布 1。玉筋鱼 俗称面条鱼、沙钻，为冷温性小型鱼类， 是目前我国黄渤海春季的主要捕捞对象。 玉筋鱼体 型 细长， 身体 侧扁， 具 小圆鳞， 但 头部 与 鳍无鳞。 在身体 腹缘两侧有 明显 纵皮褶。玉筋鱼上下颌无齿，颌 较为 突出，无腹鳍，侧线近背缘位高 ， 背 鳍条在 47-57 间 ，臀鳍 鳍条数为 22-31，尾鳍 呈 叉形，侧线鳞 数为 146-1672。 玉筋鱼群体 年龄结构 组成 较
13、为 简单，仅为 1-3 龄 鱼，寿命较短 。 1 龄 玉筋鱼的 体长 通常在100mm 以下， 2 龄鱼 的 体长 通常 在 100-130mm 之间 ， 3 龄鱼 的 体长 在 130-160mm 之间 。玉筋鱼的生长 时间一般 主要集中 于 上半年， 在 春季生 长 最快，当年幼鱼 的 体长 1 月份 为 10mm 左右， 2月份为 30mm左右， 3月份为 50mm左右， 4月份 体长 在 60-89mm之间 ， 5月份 则在 65-95mm之间 ， 6 月份为 70-100mm，多数到达成体鱼的规格， 7 到 8 月份进入夏眠期，将完全停止生长 3-5。 玉筋鱼为冷温性的小型鱼类，我国
14、的渤海、黄海北部及朝、韩、日俄远东海区都有分布。黄渤海是玉筋鱼分布的南限。玉筋鱼具有潜沙性， 当 夏季 的 水温升到 20-24 时， 玉筋鱼进入深水 处 ，潜沙 进入 夏眠。 但不同群体进入夏眠时间不一致，在日本北海道周围玉筋鱼无夏眠现象， 在 每年的 秋末冬初， 受 北方南下冷空气 的影响 ， 在 水温下降到 13-15 时， 玉筋鱼 则由深水向沙硕底质的浅水产卵 6。 图 1-1 玉筋鱼 Fig.1-1 Ammodytes personatus Giraid 产卵的玉筋鱼群体由 1-3 龄鱼组成， 其中 雌雄性 的 比例为 1： 1。 1 龄鱼 只有 部分性成熟，而 2 龄鱼 则 全部性
15、成熟 7。每年 的 10 月下旬 玉筋鱼的 产卵群体开始集群， 即 渔汛 的 开始， 一直持续到 次年的三月下旬 才 结束。 12 月到次年 的 2 月 份 为产卵期 8。 11 月到 12 月上旬为黄海北部的产卵场 玉筋鱼的 产卵盛期， 产卵 到次年的 2 到 3 月停止 。在 产卵前期 2-3 龄鱼 在产卵群体中占多数 ， 到 11 月下旬以后，产卵的鱼 群则是 以 1 龄鱼偏多 9。 相关学者的研究结果表明玉筋鱼的卵径一般为 0.85-0.95mm，围卵腔 较 大，卵膜较薄 且 透明，无龟裂， 程 鲜黄色。卵子出现时间是 12 月上旬到 2 月上旬，盛期为 12 月下旬到 1 月中旬。玉
16、筋鱼个体的怀卵量，由于分布的不同，采样的个体大小及计数起算标准的不同，其结果不尽相同，玉筋鱼 1-3 龄鱼的2 个体绝对繁殖力为 0.45-5.10 万粒，一般在 0.6-4.2 万粒，平均为 1.79 万粒。 由近几年黄渤海鱼类资源调查和渔业数据统计结果显示，玉筋鱼的资源量大幅度上升，捕捞量由 1998 年的 15 万吨迅速上升到 1999 年的 50 万吨，成为该海域继鳀鱼之后最大的渔业资源。玉筋鱼是摄食浮游生物的小型 冷温性 鱼类， 主要 摄食的浮游生物， 同时玉筋鱼 又是重要饵料 生物 ， 它 在食物网结构中 占据重要地位 。 由此 可见，有关 于 玉筋鱼的研究 ， 对于 定量黄渤海
17、的 食物网 结构的了解 、能流动力学过程 的构建 和生态系统动力学模型 的建立 ， 都有重要意义 10。 1.2 玉筋鱼种群遗传学研究进展 目前国内外有关学者利用形态学标记、同工酶标记和微卫星标记对玉筋鱼种群遗传多样性开展了相关的研究。纪毓鹏等对采自西北太平洋 6 个玉筋鱼群体样本进行了形态特征比较和同工酶分析。形态学 研究结果显示，玉筋鱼群体在分节特征上表现出不同程度的差异。 11个量度特征分析结果表明，北海道和青森群体间的相似性高，与其它 4 个群体存在显著差异，聚类分析把玉筋鱼分为南北两个种群 11。同工酶分析结果表明，在检测的 279 个玉筋鱼个体中，香川、爱知和青岛 3 个玉筋鱼群体
18、均没有出现多态位点，根据同工酶数据计算了各群体的遗传距离并构建了聚类树，结果表明玉筋鱼也分为南北两个种群，形态学结果和同工酶结果一致，但同工酶计算的两支的遗传距离同其他鱼类遗传距离相比较少，认为是种内不同种群间的水平。 Hashimoto 采用形态 学标记 对采自于日本沿海 20 个地理群体的玉筋鱼标本进行了分类比较，根据形态学特征（鳍条数、脊椎骨数）将采集样本划分为 3 个群，其中 I 群是太平洋玉筋鱼 , II 群和 III 群是玉筋鱼 12。此外， Hashimoto 还进行了日本沿海玉筋鱼种群同工酶进行了分析，研究认为日本沿海分布的 3 个玉筋鱼群体可能是 3 个亚种 13。根据相关研
19、究结果，一般认为玉筋鱼在日本存在南北两个种群，任桂静等利用其中的的 6 对微卫星引物对青岛、爱知、福冈、礼文岛和石狩湾 5 个玉筋鱼群体的遗传多样性进行了研究，五个群体的平均观测杂合度在 0.60-0.86 之间，根据聚类关系树将 5 个群体分为 2 大支。福冈，爱知，青岛群体聚为一支，礼文岛与石狩湾群体聚为一支，支持存在南北两个组群，但认为南北两个组群分化还处于种群水平 14。日本学者 Hiroaki 利用同工酶标记 研究了日本沿海玉筋鱼的种群遗传结构，认为日本沿海分布的三个玉筋鱼群体可能是三个独立的亚种。但是 Tanaka 在对日本北海道水域分布的两个玉筋鱼群体进行比较分析和研究后，认为仅
20、从脊椎骨数等特征还不能将这 2个种区分开来，通过对耳石轮纹宽度的鉴别才是鉴别这 2 个玉筋鱼种的有效方法 15。 1.3 线粒体 DNA 及其作用 DNA 是遗传物质的载体 ， 拥有丰富的变异 ，其 特异性 由 碱基顺序构成， DNA 序列的多态性和差异为遗传分析提供了 重要 信息 16。在进化 过 程中，在 DNA 的 分子 之 上首先发生变异，然后 才是在 蛋白质分子上 的 表达，最后 才会显现 在 外部 形态上。研究遗传多样性最 直接 有效的方法 是 直接分析 DNA 核苷酸组成上的 差异 ，以 DNA 分子序列提供的信息 做 为依据 ，因为DNA 的每一个碱基都是一个相对独立的特征 1
21、7。 再则， PCR 技术的 逐渐成熟和 广泛应用 配合上 全自动测序仪和高灵敏度的荧光检测手段，使 DNA 序列分析 变得简单易行 。近年 来 DNA 序列用于群体水平的研究也逐渐增多。 分子标记 方法中 中最重要的是表达序列标定、核 DNA 片段序列多态 性以 及线粒体DNA(mtDNA)多态性标记。 从 80 年代 开始 ，线粒体 DNA(mtDNA)在 分析遗传多样性领域得到了广泛 的 应用 18。 同其它脊椎动物一样 ， 鱼类 的 线粒体基因组包括 了 13 个蛋白质编码基因 ，3 22 个 tRNA， 2 个 rRNA 和 1 个非编码区 序列，并且鱼类线粒体不同基因进行速度存在很
22、大的差异，不同基因适合不同的遗传学研究。 鱼类线粒体 DNA 大小 一般 在 15.2Kb-19.8Kb 之间 。同核 DNA 相比 较， mtDNA 编码 效率较高 且 基因组结构非常紧凑 ， 进化速度快 ，控制区是线粒体 DNA 的非编码区，不编码蛋白质序列，但认为同线粒体 DNA 的复制有关，该区域不受选择压力影响，广泛应用群体水平的遗传学研究 19-20。 在海洋鱼类中 研究中已 广泛应用利用 线粒体 DNA的研究来检验生物遗传进化的假说 的方法 ， 获得了许多研究成果 ， 这对于我们认识海洋鱼类的遗传进化具有重要的作用 。 目前普遍认为海洋中不存在明显的阻隔海洋生物扩散的障碍证据，但
23、线粒体分子标记的方法为检测海洋生物群体之间的隔离屏障提供了可能。中日海域间一般不认为存在显著的地理隔离屏障，但 Han等利用线粒体 DNA对白姑鱼的研究结果表明，中日间可能存在影响该该种群地理隔离的屏障。 Han等对白姑鱼 (Pennahia argentata)中日 12个群体的遗传结构进行了研究，发现白姑鱼中日分成两个完全分化的种群，在控制区上有 3%的差别，结果显示中日间存在影响鱼类地理分布的隔离屏障 21。 Taylor and Hellberg（ 2006）对加勒比海的 一种鲰虎鱼科 Elacatinus evelynae的幼体时期和种群遗传结构的关系 进行了研究 。尽管 E. ev
24、elynae有较长的幼体浮游期（ 21天），但 该种有强烈的遗传分化：不同颜色类型间在细胞素色素 b基因上有 1.36-3.04%的差异，同一颜色类型不同岛屿群体间遗传分化系数为 70%。这些结果表明，即使幼体浮游期延长，海洋生物种群仍能保持其庞大的种群数量，此外这些结果还可以说明当地理隔离不明显时，颜色类型可以促进种群的分化 22。 以上结果提示了加勒比海地区在生物地理格局上可能存在不同的区系，在长期影响加勒比海洋海洋生物的生物地理学障碍中 Mona Passage可能就是其中一个。 1.4 研究目的及意义 目前，过度捕捞、海洋环境污染和海洋生态环境的不断恶化 已经使玉筋鱼种群资源面临枯竭的
25、危险。近年来，玉筋鱼的渔获量急剧下降， 1998 年至 1999 年，玉筋鱼资源最好，产量最高，各渔场资源密度最大。从荣成市历年玉筋鱼产量表可以看出 1998 年产量猛增 12 万吨，1999 年产量持续猛增到 25 万吨，创历史最高水平。 2000 年以后，玉筋鱼的资源开始显著衰退，到 2003 年产量仅为 6.5 万吨 3。 控制区 ( D- loop)为 mtDNA 非编码区，是线粒体 DNA 进化速率最快的序列，已被广泛应用于鱼类群体遗传学和分子系统学研究 23。此前的研究多集中于玉筋鱼种群的能量生态学、生物 学特征和资源管理方面 24-29，而对玉筋鱼基因序列分析的研究报道尚无，玉筋
26、鱼不同种群的分类地位尚未解决，因此迫切希望开展玉筋鱼线粒体序列研究。控制区序列为测定生物种群遗传结构、判别种群归属的方法之一，已经在多种海洋鱼类上开展过研究，研究表明相同水域间的种群基因结构分化可能会因为洋流影响和个体迁徙而随时间的推移慢慢降低，或者遗传分化的影响会随着时间的推移而得到强化。从海洋自身的深度和广度来看，海洋鱼类的遗传分化水平较低。海洋鱼类的浮性卵、仔鱼和成鱼的广泛分布性和在水体中自由迁移的特性大大方便了基因在种群内 部的流动。然而，中日海洋鱼类种群的显著遗传差异正被不断发现，例如鲈鱼、梭鱼等。本研究主要通过控制区序列研究了玉筋鱼青岛、福冈、青森三个种群的基因结构和遗传分化，实验
27、结果将有助于对玉筋鱼种群资源的保护和管理。 2. 材料与方法 4 2.1 实验来源 实验所用的样品于 2005 年 4 6 月采自青岛 38 尾、日本福冈 12 尾和日本青森 19 尾，共69 个个体。并搜集同期的采样海域温度、盐度等海洋环境数据。 日本群岛两侧采样地点的温盐和洋流数据通过日本海洋数据中心获得（ http:/www.jodc.go.jp/）。黄海、渤海区环 境数据通过国内相关水产科研机构获得。 进行简单形态学鉴定后，取鱼体背部肌肉立刻冷冻，并运至实验室保存。 图 2-1 玉筋鱼群体采样地点 Fig.2-1 The sampling sites of Ammodytes pers
28、onatus 2.2 样本组 DNA 提取 取玉筋鱼鱼体背部肌肉样品约 20mg，用传统的酚 /氯仿抽提法从肌肉中提取基因组 DNA,将 DNA 的 样品 ,加入适量 TE 溶解， 采用分光光度计对 DNA 质量进行检测，选取高质量样品进行分析， DNA 样品 置 4C 冰箱待用。 2.3 PCR 扩增与序列测定 使用 本实验室设计的特异性引物扩增玉筋鱼控制区序列基因，引物序列如下： DL-S: CCCACCACTAACTCCCAAAGC， DL-R: CTGGAAAGAACGCCCGGCATG。 PCR 反应液总体积为 25L。在 Eppendorf Mastercycler 5333 扩增
29、仪上进行 PCR 反应。 PCR 反应的条件是：先在 94 预变性 3 分钟 ，之后再进行 40 次循环，每次循环包括 94 45 秒 ， 50 45 秒 ， 72 1分钟 ，最后在 72 延伸 10 十分钟 。反应均用阴性对照的方法来检查 DNA 是否有污染。然后再取扩增产物 1.5L 使 用琼 脂糖凝胶进行电泳检测。在回收时仍用 1.5%的琼脂糖 凝 胶电泳 分离，用小量胶回收试剂盒进行回收和纯化， PCR 产物由上海桑尼生物公司进行双向测序，以保证序列的正确性。 2.4 数据分析 用 DNAStar 软件 （ DNAStar,Madison,WI， 美国） 对测得 序列 进行 编辑 、排
30、序比对。通过MEGA5.0 软件统计所测序列的碱基组成，计算不同个体间的遗传距离，并构建 NJ 系统树。用 DNASP 软件进行多态位点数（ S）、核苷酸多样性（ Pi）、平均核苷酸差异数（ K）等遗传多样性参数的计算 ,利用 Arlequin 软件计算玉筋鱼两两 群体的 FST值。 5 3 结果 3.1 单倍型及核苷酸多样度 测序得到玉筋鱼的控制区片段长度在 521-528bp 之间，经比对同源序列长度为 530bp（图3-1） ， 在 玉筋鱼 69 个个体中总共检测到 69 种单倍型 。 各单倍型 间的 变异 有一定的 转换或颠倒以及 插入和缺失。 三个群体的单倍型多样性指数较高，均为 1
31、.00。核苷酸多样度以青森群体最高 ,为 0.02660.0041；其它两个群体较低，福冈群体则只有 0.01050.0031，最低的为黄海群体，核苷酸多样性指数为 0.01230.0007。在平均碱基差异数方面，青森 群体的数值最大，为 13.8190.512；其次是黄海群体，为 6.4920.520；最小的是福冈群体，数值为 5.5610.337。 h1 TAAGATTCTG AACTAAACTA TTCTTTGCTG GGCTGCGCG- -TCATGACGC GCAGACATAC A-TATATGT 70 h2 . . . .C A.G. .A. .-. 70 h3 . . . .C
32、A.G. . .-. 70 h4 . . . .C A.G. . .-. 70 h5 . . . .C A.G.G. .C. .-. 70 h6 . . . .C A.G.G. . .-. 70 h7 . . . .C A.G. . .-. 70 h8 . . . .C A.G. . .-. 70 h9 . . . .C G.G. . .-. 70 h10 . .T. . .C G.G.G. . .-. 70 h11 . . . .A.C A.G. . .-. 70 h12 . . . .C A.G. .A. .-. 70 h13 . . . .C A.G. . .-. 70 h14 . .
33、. .C A.G. . .-. 70 h15 . . . .C G.G. . .-. 70 h16 .T. . . .C A.G. . .-. 70 h17 . . . .C A.G. . .-. 70 h18 . . . .C G.G. . .-. 70 h19 . . . .C A.G. . .-. 70 h20 . . . .C G.G. . .-. 70 h21 . . . .C A.AG. .A. .-. 70 h22 . . . .C A.G. . .-. 70 h23 . . . .C A.G. . .-. 70 h24 . . . .C A.G. . .-. 70 h25 .
34、. . .C A.G. . .-. 70 h26 . . . .C A.G. . .-. 70 6 h27 . . . .C G. . .-. 70 h28 . . . .C G.G. . .-. 70 h29 . . . .C A. . .-. 70 h30 . . . .C A.G. . .-. 70 h31 . . . .AC G.G. .T. .-. 70 h32 . . . .C A.G. .T. .-. 70 h33 . . . .C A.G. . .-. 70 h34 . . . A.C A.G. . .-. 70 h35 . . . .C A.G. . .-. 70 h36 .T. . . .C A.G. . .-. 70 h37 . . . .C CAT.ACG. . .-. 70 h38 . . . .C CATGACG. . .-. 70 qs1 . . .TCA A.AC A.TC.G. .- -CA. 70 qs2 . . .TCA A.C A.TC.G. .- -CA. 70 qs3 . . .TCA A.C A.TC.G. .- -CA. 70 qs4 .
