1、http:/1酶解双醛淀粉固定化脲酶性质的研究 1罗志刚，扶雄华南理工大学轻化工研究所碳水化合物研究室，广州（510640）E-mail：摘要：采用酶解双醛淀粉固定化脲酶并对其固定化脲酶性质进行了研究。结果表明， 酶解双醛淀粉固定化脲酶以后，载体之 间形成较大的团状。 酶解双 醛淀粉载体固定化脲酶量达到24.3%。对固定化脲酶的性质研究表明，酶解双醛淀粉固定化脲酶的最适 pH6.0，最适温度为70，具有很好的储存稳定性和较高的米氏常数，固定化 脲酶 重复使用 10 次后，活力下降了约 25%。以上结果表明酶解双醛淀粉能有效固定化脲酶，是一种新型高效的固定化酶载体。关键词：酶解双醛淀粉；脲酶；固
2、定化；性质中图分类号：TS2361. 引言脲酶（EC3.5.1.5）是一种来源广泛的植物蛋白酶，能催化尿素水解为氨和二氧化碳，广泛应用于农肥科学、分析化学、临床医学、医学检验和环保监控等领域。但酶的价格昂贵，溶液中酶很不稳定，容易变性和失活，反应后酶难以分离回收，无法重复使用，限制了酶的应用。为提高脲酶在溶液中的稳定性，使之能够重复利用，人们常常制成各种固定化脲酶。目前已经有多种材料用于脲酶的固定化，如聚乙烯醇 1、醋酸纤维素膜 2、海藻酸钙/ 黄原胶微球 3、接枝共聚膜 4、多孔壳聚糖微球 5等。淀粉来源广泛，廉价易得，可再生，无毒，具有适合酶反应的天然微环境，而且淀粉经改性制成各种性能的变
3、性淀粉，可满足不同酶固定化的需要，因此淀粉及其衍生物成为一种较为理想的酶固定化载体。目前，淀粉做载体固定化酶主要集中在磁性淀粉微球、淀粉接枝共聚物和双醛淀粉载体等几种淀粉衍生物 6,7。本作者基于脲酶的性质，已制备出一种新的高效变性淀粉酶载体酶解双醛淀粉 8，其综合了双醛淀粉和酶解淀粉两种淀粉的特性。由于其自身携带的大量醛基，可以直接与酶中的氨基通过共价结合成为 SCHIFF 碱，而且由于淀粉表面粗糙，比表面积大，可以物理吸附固定酶，整个载体达到物理吸附化学交联固定化酶。基于此，本文研究了酶解双醛淀粉固定化酶量及固定化酶后淀粉载体形貌，对酶解双醛淀粉固定化后脲酶的酶学特性即最适作用温度、最适作
4、用 pH、热稳定性、米氏常数 Km 等进行了系统探索，以期开辟环保高效的固定化酶载体的新途径2. 材料和方法2.1 材料和仪器酶解双醛淀粉（水解率 48.76%，醛基含量 80%），实验室自制 8；脲酶（Sigma.公司），酶活力为 70400u/g；尿素、硫酸铵、二水合磷酸二氢钠、十二水合磷酸氢二钠、碘化钾、氯化汞、氢氧化钠、硫酸锌、酒石酸钾钠，均为分析纯。KDN-2C 型凯式定氮仪，上海晖创化学仪器有限公司； LEO 1530 VP 型扫描电镜，德本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金（项目编号：20070561078）的资助。http:/2国 LEO 公司；722 光栅分光光度计，上海
5、手术器械厂；PHS-25 数显酸度计，上海第三分析仪器厂；ASAP2010 比表面自动分析仪，美国 Micromeritics 公司。2.2 方法2.2.1 酶解双醛淀粉固定化脲酶的制备称一定量的淀粉载体，分散于给定的水溶液中，在特定温度下预热一定时间后加入脲酶，在恒温培养箱中恒温反应一段时间，取出分离，用蒸馏水洗涤至无游离酶 9。2.2.2 脲酶酶活力的测定脲酶酶活力的定义: 在 37下，每分钟催化产生 l umol 铵的酶量为一个活力单位，以U 表示。脲酶酶活力的测定采用 奈氏试剂法 10,11。2.2.3 固定化酶含量测定采用凯氏定氮法测定固定化酶中的氮含量，然后用下式计算固定化酶含量：
6、固定化酶量（% ）=N%6.252.2.4 扫描电子显微镜将待测样品充分分散于无水乙醇中，取适量涂于玻璃片上，晾干后用导电双面胶将附有样品玻片固定在载物台上，真空条件下进行镀金处理，然后将处理好的样品台放入LEO1530VP 型扫描电子显微镜中观察。2.2.5 载体比表面积的测定称取 0.20.3g 样品，先在 100下脱气 4 小时，将脱气后的样品所在的样品管装入样品分析端口，于 77K（液氮温度）下使用氮气物理吸附容积方法测定。3. 实验及结果分析3.1 酶解双醛淀粉载体固定化脲酶工艺条件及固定化酶量的确定通过对酶解双醛淀粉固定化脲酶工艺的研究，以脲酶酶活力为指标，通过单因素实验确定其固定
7、化脲酶的最佳条件为：载体醛基含量 80%的，反应 pH 值 6.0，温度 25 ，反应时间 25h，载体与酶的配比为 1:2（mL/g） 8。采用凯氏定氮法对两种载体固定化脲酶的酶固定化量进行测定，结果见表 1。表 1 载体固定化脲酶量的比较 Table 1 Comparison on content of urease in different carriers载体种类 酶解双醛淀粉 原淀粉固定化脲酶量 24.3% 1.03%从表中数据可以看到，采用酶解双醛淀粉载体固定化脲酶量达到 24.3%，比原淀粉固定化量高很多。这主要是因为酶解双醛淀粉载体即含有醛基，又具有较大的比表面积，在进行固定化
8、时，其综合了双醛淀粉和酶解淀粉两种淀粉的特性，一方面醛基的化学交联固定化酶，另一方面酶解后淀粉粗糙的表面和多孔的内部又有很强的物理吸附和包埋作用，使载体对脲酶的固载量大大增加。3.2 酶解双醛淀粉固定化脲酶的扫描电镜分析http:/3(a)酶解双醛淀粉 (b) 固定化脲酶的酶解双醛淀粉图 1 淀粉的扫描电镜照片（1000）Fig.1 SEM photos of starches（1000）从图 1 可知淀粉经过酶解及双醛改性后，表面变得粗糙，而且出现了一些凹坑，采用比表面自动分析仪对酶解双醛淀粉（醛基含量 80%）和相同醛基含量的双醛淀粉的比表面积进行分析，得出酶解双醛淀粉 3.3833 m2
9、/g，双醛淀粉为 0.1605 m2/g。可见淀粉经过酶解及双醛改性后比表面积增大。酶解双醛淀粉固定化脲酶以后，颗粒表面布满很多细小粒子，载体之间发生了粘结现象，形成较大的团状，可见制备的淀粉载体确实固定了脲酶。关于淀粉固定化脲酶的进一步证实还可结合红外光谱等性能表征，在今后的研究中将逐步深入研究。3.3 酶解双醛淀粉固定化脲酶性质的研究3.3.1 固定化脲酶的最适作用温度当反应温度升高时，酶活力会增加，但是随着温度的升高，酶蛋白会逐步变性，从而导致酶活力下降，在这个过程中，酶活力会有一个最大值，这个时候的温度就是酶的最佳反应温度。酶的最适作用温度的测定按照 2.2.2 的方法，其它条件不变，
10、改变反应的温度，测定在不同温度条件下游离脲酶和固定化脲酶的酶活力值，测定结果如图 2。从图中可以看出，游离脲酶的最适温度为 60，酶解双醛淀粉载体固定化脲酶的最适作用温度为 70，而且在最适温度左右酶活曲线峰变的平坦，说明固定化酶具有更宽的适宜反应温度范围。50560657075780590510510酶活力/umol/L 温 度 /游 离 酶酶 解 双 醛 淀 粉 固 定 化 脲 酶5.6.06.57.07.58.0670580590510510酶活力/umol/LpH 游 离 酶酶 解 双 醛 淀 粉 固 定 化 脲 酶http:/4图 2 脲酶的最适作用温度 图 3 脲酶的最适作用 pH
11、 值Fig.2 Optimal temperature of urease Fig.3 Optimal pH of urease3.3.2 固定化脲酶的最适作用 pH 值pH 值对酶活性的影响很大， pH 值偏高或偏低都可能导致酶活性降低甚至失活，只有在其最佳 pH 值条件下酶才会发挥出最大的活力。游离脲酶和固定化脲酶最适作用 pH 值的测定按照 2.2.2 的方法，其它条件不变，使用不同 pH 值的 0.3mol/L 的尿素溶液，测定在不同 pH 值条件下游离脲酶和固定化脲酶的最适作用 pH 值，结果如图 3。0123456859051051051205酶活力/umol/L时 间 /周游 离
12、 酶 酶 解 双 醛 淀 粉 固 定 化 脲 酶 0123456204608102酶活力/umol/L时 间 /周 游 离 酶酶 解 双 醛 淀 粉 固 定 化 脲 酶图4脲酶在4的储存稳定性 图5 固定化脲酶在室温下的储存稳定性Fig.4 Storage stability of urease at 4 Fig.5 Storage stability of urease at room temperature从图中可以看出，游离脲酶的最适作用 pH 值为 7.5，而酶解双醛淀粉固定化脲酶的最适作用 pH 值为 6.0，由此可见，酶解双醛淀粉载体得到的固定化脲酶的最适作用 pH 向酸性条件下偏
13、移。3.3.3 固定化脲酶的储存稳定性将游离脲酶和固定化脲酶分别在 4和室温下放置，每隔一周按照 2.2.2 的方法测定它们的酶活力，测定温度选择最适作用温度 70。测定结果如图 4 和 5。从图中可以看出，在 4条件下放置 4 周后，游离脲酶的酶活力有一点下降，而载体固定化脲酶的酶活力基本上没有变化。在室温条件下放置 4 周后，游离酶的活力已经下降了 65%，酶解双醛淀粉载体固定化脲酶的活力没有太大变化，放置 6 周后，游离脲酶基本上失活，而固定化脲酶的酶活仍然没有太大变化，这就改善了游离酶必须在低温下保存的缺陷。3.3.4 固定化脲酶的重复使用率http:/5246810708901012
14、3014酶活力/umol/L使 用 次 数图6 固定化脲酶重复使用率 图7 脲酶的Km值Fig.6 Use ratio of immobilized urease Fig 7 Km of urease重复使用性的测定是通过连续测定固定化酶活力的方法实现的 10。称取 1.0g 固定化脲酶，按 2.2.2 方法测定活力，反应后取 0.25m1 反应液。反应完后纱布过滤取出固定化酶，用蒸馏水冲洗数次除去留在上面的底物溶液和铵离子，然后再用 2.2.2 方法测活性。重复以上步骤，得到图 6 所示的重复使用次数与固定化酶活力关系图。由图中可以看出，酶解双醛淀粉载体在使用 5 次以后酶活力最大，这可能是
15、由于酶解双醛淀粉载体对脲酶有包埋作用，经过多次使用以后被包埋的脲酶才会被完全释放出来，从而使底物溶液中尿素更易与脲酶接触。实验表明，重复使用 10 次后，酶解双醛淀粉载体固定化脲酶的活力下降了约 25%，这表明酶解双醛淀粉载体所制得的固定化脲酶重复使用性好，其主要原因可能是酶解双醛淀粉即有醛基对载体的交联，又有包埋作用，多次使用后仍保留较高的活力。3.3.5 固定化脲酶的 KmKm 值是酶的重要物理指标，Km 值越大表明酶与底物的亲和力越小 10。按 2.2.2 方法测定固定化脲酶催化 0.01，0.02，0.04，0.06，0.08mo1/L 尿素-0.05mo1/LpH7.0 磷酸盐缓冲溶
16、液水解尿素的反应速率，用尿素浓度的倒数和反应速率的倒数作图得 L-B 图，图中横截距的负倒数就是 Km 值。游离的酶经固定化后，产生了酶性质上的某些变化。固定化酶的表观米氏常数随载体的带电性能变化，带电载体和底物之间的电荷-电荷作用会引起底物分子在扩散层和整体溶液之间不均一的分布。从图中数据，可以求出游离脲酶和酶解双醛淀粉固定化脲酶的 Km值分别为 0.013mo1/L 和 0.0143mo1 /L，表明脲酶经酶解双醛淀粉固定化后与底物的亲和力有所减弱。这可能是由于一方面固定化后酶蛋白的结构变得更加紧密，另一方面载体与底物所带电荷相同，从而降低了和尿素的亲和性。国内相关文献报道了其它多糖类载体
17、固定化脲酶的效果，如腈尿酰氯二乙氨乙基纤维素醚载体固定化脲酶，该固定化脲酶的活力收率为 72%， Km 值升高，最适反应 pH 为7.5，和游离酶相同 12。戊二醛交联壳聚糖固定化脲酶的比活为 10.83U/g 载体，重复使用http:/610 次后活力下降了 40%，湿态固定化酶在 4下贮存 35d 后保留初始活力的 46%13。接枝共聚淀粉固定化脲酶的活力收率为 70，重复使用 7 次后保留初始活力的 60 14。和文献报道的载体相比，采用酶解双醛淀粉载体固定化脲酶，具有良好的贮存稳定性和重复使用性，效果更好。4. 结论通过扫描电子显微镜观察发现，酶解双醛淀粉固定化脲酶以后，颗粒表面布满很
18、多细小粒子，载体之间发生了粘结现象，形成较大的团状。凯氏定氮法进一步测定出酶解双醛淀粉载体固定化脲酶量达到 24.3%，比原淀粉固定化酶量高很多。对固定化脲酶的性质研究表明，酶解双醛淀粉固定化脲酶的最适 pH6.0，比游离酶的最适 pH 低；最适温度为70，比游离酶高；在室温条件下放置 4 周后，游离酶的活力已经下降了 65%，酶解双醛淀粉载体固定化脲酶的活力没有太大变化，放置 6 周后，游离脲酶基本上失活，而固定化脲酶的酶活仍然没有太大变化；酶解双醛淀粉载体固定化脲酶重复使用 10 次后，酶解双醛淀粉载体固定化脲酶的活力下降了约 25%，具有较好的重复使用性；固定化脲酶的 Km 比游离脲酶高
19、。参考文献1Rejikumar S,Devi S J. Preparation and characterization of urease bound on crosslinked poly(vinylalcohol)J. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic,1999,(4)：61-66.2王杰，宋锡瑾，伍明，等.醋酸纤维素膜固定化脲酶的研究J.高等学校化学学报，1998，19(7):1104-1106.3Elcin Y M. Encapsulation of urease enzyme in xanthan alginate sphere
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21、urnal of Biotechnology，2007,129(4)：674-680.6于九皋,刘峰,于璟琳.包覆包醛氧淀粉固定脲酶制备及对尿素吸附 J.天津大学学报,2003, 3(2):197-200.7钱斯日古楞，王红英.磁性淀粉微球固定化脂肪酶的研究J.食品科学，2004，25（4）：47-50.8杨景峰.淀粉基酶固定化载体的构建及应用研究D.广州：华南理工大学轻工与食品学院，2008.9刘锋. 氧化淀粉固定化脲酶及其吸附性能研究D. 天津大学理学院，2001.10熊杰. 脲酶的固定化研究D. 南京：南京理工大学化学工程学院，2005.11蒋樱华. 微生物脲酶的固定化研究D. 南京：南
22、京理工大学化学工程学院，2006.12Fahmy A S, Bagos V B. Mohammed.Immobilazation of citrullus vulgaris urease on cyanuric chloride DEAE-cellulose ether:preparation and propertiesJ.Bioresource Technology,1998,64(6):121-129 13梁足培,桑明心,李建等.戊二醛交联壳聚糖球固定化脲酶的制备J. 青岛科技大学学报, 2006, 27(2):123-126 14Dung N A, Huyen N d, Hang N
23、D.Immobilization of urease on grafted starch by radiation method J.Radiation Physics Chemistry,1995,46(6):1037-1042http:/7Study on Properties of Urease Immobilized on Enzymic Dialdehyde StarchLuo Zhi-gang, Fu Xiong Carbohydrate Lab, Light and Chemical Industry Institute, South China University of Te
24、chnology,Guangzhou, PRC, (510640)AbstractThis paper studied the immobilization and properties of urease on enzymic dialdehyde starch. The results showed starch carriers formed bigger congeries after immobilizing urease. The content of urease immobilized on enzymic dialdehyde starch was 24.3%. The op
25、timum pH of immobilized urease was 6.0.The optimum temperature of immobilized urease was 70. The immobilized urease had better storage stability and higher Km comparing with free urease. The activity of immobilized urease decreased 25% after using ten times.The foregoing data showed the enzymic dialdehyde starch can effectively immobilize urease and is a better carrier.Keywords: enzymic dialdehyde starch; urease; immobilization; properties作者简介：罗志刚，男，1975 年生，博士，副教授，主要研究方向是功能碳水化合物化学与工程。
