1、 本科毕业论文 （ 20 届） 南美白对虾大棚养殖池细菌总数检测与分析 所在学院 专业班级 水产养殖学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 目录 中文摘要 1 英文摘要 2 1. 前言 3 1.1 南美白对虾生物学性状 3 1.2 南美白对虾经济价值 3 1.3 南美白对虾养殖状况 3 1.4 大棚集约化养殖概述 3 1.5 养殖水环境细菌检测 4 1.6 实验 目的意义 5 2. 材料与方法 5 2.1 实验时间和地点 5 2.2 水样采集 5 2.3 实验步骤 5 3. 结果与分析 6 3.1 实验数据记录表 6 3.2 实验结果分析 7 4. 小结 9 4.1 细菌总数变化
2、指标 9 4.2 细菌总数作为参考指标在实际生产中的应用 10 致谢 10 参考文献 11 1 南美白对虾大棚养殖池细菌总数检 测与分析 摘要 南美白对虾是当今世界上养殖产量最高的三大优良虾种之一。南美白对虾具有生长快、适应性广、抗病能力强、肉味鲜美、加工出肉率高等优点，是集约化高产养殖的优良品种。 南美白对虾引进初期， 生长 主要受到细菌性疾病的影响，后来逐步发展为受到病毒性疾病影响。目前，南美白对虾养殖过程中的细菌性 疾病 和病毒性疾病共存，同 时 影响着南美白对虾的生长。 在南美白对虾养殖的不同阶段，养殖池中细菌总数会发生改变，其菌种组成也会有显著变化。本实验通过对大棚养殖南美白对虾的水
3、样（沉积物）进行定时定点抽检，运用梯度稀释平板涂 布法计算样品中的单位细菌总数，从而得到在不同养殖阶段目标养殖池内所含细菌总数这一数据，并结合采样实时环境因子对该数据进行分析，论证细菌总数这一生物因子可以作为南美白对虾大棚养殖的重要参考指标，对这一指标如何在生产活动中用商品化表现形式加以利用提出合理化建议， 为对虾高密度健康养殖水环境的优化调控提供 有效技术手段。 关键词 南美白对虾 大棚养殖 细菌总数 疾病防控 2 The Detection And Analysis Of Total Bacteria In Penaeus Vannamei Greenhouse Farming Ponds
4、 Abstract Penaeus Vannamei is one of the three kind of worlds highest yield farming on fine shrimp. Penaeus Vannamei has fast growth, wide adaptability, disease-resistant ability, meaty delicious, processing yield higher advantages, it is a fine breeds of high-yielding aquaculture intensive. The ear
5、ly introduction of Penaeus Vannamei, growth mainly impact by the bacterial disease, viral disease was affected in the gradual development. Currently, the Penaeus Vannamei culture affected by the process of bacterial diseases and viral diseases coexist, while affecting the growth of Penaeus Vannamei.
6、In different stages of Penaeus Vannamei breeding, bacteria in the pond can make a change, its spawn there will also be significant change composed. This experiment through the canopy breeding Penaeus Vannamei periodically (interval of samples for 15 days) sampling inspection, get the data of the tot
7、al bacterial count from the pond during different breeding stage, and analysis the result, to make demonstration that total number of bacteria demonstrated that biological factors can be important used as Penaeus Vannamei reference for greenhouse farming, and how this indicator used in the commercia
8、l form of production activities to be used to make reasonable suggestions for high-density shrimp culture health optimal regulation of water environment provide effective technical means. Keywords Penaeus Vannamei Greenhouse Farming Total Bacteria Disease Control And Prevention 3 南美白对虾大棚养殖池细菌总数检测与分析
9、 1 前言 1.1 南美白对虾生物学性状 南美白 对虾 （ Penaeus Vannamei Boone， 1931）学名凡纳对虾，属 节肢动物门 （ Arthropoda）、甲壳 纲（ Crustacea）、十足目（ Decapoda）、游泳亚目（ Natantia）、对虾科（ Penaeidae）、 对虾属 （ Penaeus）、 Lito-penaeus 亚属，是广温 广盐性 热带虾类。俗称：又称白肢虾（ white leg shrimp）、白对虾（ white shrimp），以前翻译为万氏对虾，外形酷似中国对虾、 墨吉对虾 ，平均寿命至少可以超过 32 个月。成体最长可达 24cm，
10、甲壳较薄，正常体色为浅青灰色，全身不具斑纹。步足常呈白垩状，故有白肢虾之称 1。 1.2 南美白对虾经济价值 通过多年推广养殖，证明南美白对虾具有适应性强、生长快、产量高、抗病能力强等优点，适合我国内陆地区淡水条件下的规模化养殖，并完全能获得高产。因此南美白对虾是一种较有生产潜力的海虾淡养品种。在摸索和掌握了南美白对虾健康高产养殖技术的同时，为规模化养殖打下了良好的技术基础。同时，南美白对虾对加快农业产业结构的调整和效益渔业的发展起到了积极作用。为了促进南美白对虾养殖业可持续发展，除了提高和完善养殖技术、增加单产外，还可以拓展市场空间，积极发展对虾加工业，并不断地提高加工的水平和质量， 开拓南
11、美白对虾的国外市场，进一步提高经济效益 2。 1.3 南美白对虾养殖状况 在 20 世纪 80 年代，对虾养殖业的发展曾给我国的 水产 养殖业写下辉煌的一笔，极大地带动了 沿海地区 的经济发展。可是，进入 90 年代，特别从 92 年起，由于对虾 病毒病 在全国各地的蔓延，水产工作者一时又找不出合适的对策，导致对虾养殖业大伤元气，经济效益一落千丈。因此，水产工作者们一方面刻苦钻研对虾病毒病，另一方面探索对虾养殖业新的替代品种、新的经济增长点，于是南美白对虾的养殖浮出水面 3。 南美白对虾是当今 世界 养殖产量最高 的三大虾类之一 ,原产于南美洲 太平洋 沿岸海域， 中国科学院海洋研究所 张伟权
12、教授率先由 美国 引进此虾，并在一九九二年突破了育苗 关，从小试到中试直至在全国各地推广养殖。 1988 年 7 月，南美白对虾由中国科学院海洋研究所从 美国夏威夷 引进我国， 1992 年 8 月人工繁殖获得了初步的成功， 1994 年通过人工育苗获得了小批量的虾苗， 1999 年深圳天俊实业股份有限公司与美国三高海洋生物技术公司合作，引进 SPF南美白对虾养殖技术，在南美白对虾 SPF 培养上取得成功 4。其中，南美白对虾塑料大棚养殖技术使用简单，具有繁殖 周期短，产量高，管理方便等特点。与传统的养殖模式年养殖两到三岔相比，产量提高了数倍 ;交错的上市季节，虾的价格较高，因此，温室养殖模式
13、的好处是比传统效益高。近几年，许多地区如东县苴镇大规模应用的对虾温室养殖技术，水产养殖产量和效率都有了很大的提高 5。 1.4 大棚集约化养殖概述 大棚养殖也称暖棚养殖 。 暖棚养殖是指在寒冷的季节给开放式或半开放式畜禽圈舍上扣盖一层塑料薄膜，充分利用太阳能和畜禽自身所散发的热量，提高舍内温度，减少热能损耗，4 降低维持需要，提高畜禽生产性能和养禽经济效益。暖棚养殖是一项先进、成熟、 适用的技术，用较少的投入可获得与周密封闭式圈舍饲养畜禽相同的效果，可降低畜禽死亡率 2.713.5，提高肉 (蛋 )率比 12 25，节约饲料 11以上；可促进良种和新技术推广应用，推进适度规模养殖的发展，实现畜
14、禽产品均衡供应，是发展高产优质畜牧业的一项重要技术 6。 大棚养殖可以针对很多动物，如肉鸡、肉鸭、肉牛、白鹅、鱼、虾、黄鳝等很多动物，大棚养殖的最大好处是，能够克服环境因素对动物饲养造成的影响，使动物能够在更短的时间内成长，同时保证一定的质量。大棚养殖从经济效益上来说，可谓是翻倍的提高。大棚养殖 其实质是提供合适的温度、湿度、光照度以及水和环境卫生 7。 1.5 养殖水环境细菌检测 我国较为常见的对虾疾病有红腿病（红肢病）、烂眼病、烂鳃病、褐斑病（甲壳溃疡病）、弧菌病等。其病原体主要有革兰氏阴性杆菌：鳗弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌等 8。芽孢杆菌是一类在虾类的健康养殖中发挥重要作用
15、的有益微生物，弧菌是一种水产养殖系统中的重要致病细菌，弧菌虾病是一个的主要因素，粪大肠菌群（后进先出粪合作室）是水质监测的一个重要生物指标，污染主要来自人类和动物粪便，粪大肠菌群对养殖水体结合因子试验和化学分 析， 为 集约化农业生产条件和水污染评价度提供了科学依据 9。 病原传播途径多为水质恶化，光线过强等 8。此外 ,通过合理施肥 ,繁殖小球藻等单细胞藻类 ,应用光合细菌、净水 EM 菌等进行生态调控 ,净化水质。整个养殖期间水质始终保持 “ 肥、爽、活、嫩 ”,可明显减少虾病 ,避免虾池发生大批死亡的现象 5。 南美白对虾引进初期，主要受到细菌性疾病的影响，后来逐步发展为受到病毒性疾病影
16、响。目前，南美白对虾养殖过程中的细菌性 疾病 和病毒性疾病共存， 一 同影响着南美白对虾的生长。 近年来 , 我国沿海地区的南美白对虾室内塑料大棚池高 密度养殖发展非常迅速 , 养殖规模、产量和经济效益都有显著提高 , 在对虾养殖业中占居重要位置。然而，由于相对封闭的环境，水产养殖生态系统是相对简单的，狭窄的缓冲区， 导致 养殖过程出现微生态环境易变和养殖系统难以平衡调控的特点，给健康高产带来很多困难。在养殖环境上，包括各种有机物质和人为的改造，而且这些细菌可以分解物质和储存能量。海洋细菌可以直接使用期间和之后的各种碎片中生物大分子和氨基酸的营养，它包含了海洋植物的光合作用 、分 解死亡的动物
17、和植物的生命活动，并释放必需营养物质。异养细菌和微生物 同样 是非常重要的， 由于它 们 在海水养殖生态系统中的地位和作用显著提 高，已成为海水养殖环境与生态学研究中不可缺少的重要内容 , 也是正确评价海水养殖生态系统结构与功能的重要组成部分 9。 徐晓津，王军于 2001 年发表我国养殖对虾细菌性疾病，研究了对虾养殖过程中的几种常见致病细菌 8。 Yossi Tal, Joy E. M. Watts, Harold J. Schreier 于 2005 年 8 月发 表 Anaerobic Ammonium-Oxidizing (Anammox) Bacteria and Associate
18、d Activity in Fixed-Film Biofilters of a Marine Recirculating Aquaculture System，研究海水养殖系统中微生物的活动情况 10。中国水产科学研究院南海水产研究所 、 暨南大学水生生物研究所 ,水体富营养化与赤潮防治广东省教育厅重点实验室 , 自 2008 年 4 月至 8 月 , 在广东省汕尾市红海湾凡纳滨对虾 ( Lito-pen- aeus Vannamei) 高位池养殖基地全程采集养殖池塘水样 , 检测水体细菌类群和理化因子 , 分析养殖过程中细菌类群的数量 变化规律及其与环境因子的关系 9。靳明建 ,季小敏 ,
19、周亚文于 2010年发表塑料大棚养殖南美白对虾技术要点，在饲养管理中阐述了大棚养殖水体细菌控制对南美白对虾生长的影响 5。 5 大棚养殖南美白对虾是一种新兴、有前景的集约化养殖方式，其水环境控制是养殖过程中的一个重要环节。只有在营养物质含量充分、各项理化因子相对稳定的情况下，才能达到高产稳产的养殖目标 10-14。 1.6 实验目的意义 本实验 以南美白对虾大棚养殖过程中的一个重要生物指标 细菌总数为主要研究对象，通过对大棚养殖南美白对虾的水样 （沉积物 ） 进行定期抽检，得到在不同养殖阶段养殖池内所含细菌总数这一数据，并对该结果进行 数理 分析， 结合生产状况以及实时水温、 PH、盐度，对虾
20、生长状况等指标， 探索南美白对虾高密度养殖周期中细菌总数的动态变化 ,研究细菌变动与理化因子的 关联 , 论证室内大棚养殖池细菌总数 和 南美白对虾生长 存在对应关系， 进而为对虾高密度健康养殖水环境的优化调控提供 有效手段与指标 15-20。 2. 材料与方法 2.1 实验时间与地点 本实验从 2010 年 8 月中旬开始， 到 2011 年 1 月结束，历时 五 个月 。实验地点选在浙江省舟山市小沙镇旭旺养殖场。 在实验场选定两个南美白对虾大棚养殖池以及一个南美白对虾室外露天养殖池作为采样对象，对大棚养殖池进行水样采集，对露天养殖池进行水样和沉积物的采集。 2.2 水样采集 样品的采集工作
21、是以十五天为周期进行的。考虑到细菌的活性与环境温度的关系，每次采样时间定为当天气温最高的 10： 00 14:00，并将采集到的水样在密闭、恒温的状态下于一个小时内送回实验室进行检测。鉴于养殖池内水体的流动性和相对稳定性，可以认为用采样瓶随机取得的水样中单位细菌含量与整个养殖水体内是相一致的。 采集样品时需要测定并记录 南美白对虾大棚养 殖池 和露天养殖池的温度、 PH、盐度、 虾生长状况 等数据。 2.3 实验步骤 2.3.1 实验前的准备工作 制备牛肉膏蛋白胨普通细菌培养基，并将其制成若干平板培养基和斜面试管培养基，消毒备用。此外，将采样瓶以及温度计、盐度计等工具消毒封口备用。 2.3.2
22、 水样及沉积物的采集 定时定点采集目标池内的水样和沉积物样品，记录实时水温、 PH、盐度，并观察记录水色及养殖池内 虾生长状况 。 2.3.3 细菌的接种 将采集来的样品于一个小时内运回实验室，按梯度稀释原样并各取 0.2ml细菌溶液涂布接种至平板培养基上，每个浓度的 样品设置三个平行组及一个空白对照组，之后将涂布好的带菌平板置于恒温箱内 30恒温培养 24h-48h。 2.3.4 实验数据处理 选取稀释梯度组菌落数在 30-300之间的平板作为总样，在细菌计数器上进行菌落计数，获得该组平均值减去空白组平均值，换算出原水样和原沉积物样本的细菌总数。对于菌落数的增长， 48h培养与 24h培养无
23、显著性差异。制表记录下全部数据，结合采样时间制作细菌总数随时间变化趋势图，直观分析实验结果。 6 3. 结果与分析 3.1 实验数据记录表 采集样品的次数与时间对照情况列于表 1。 表 1 实验次 数与日期对照表 Table 1 Experiment Number And Date Comparison Table 次数 1 2 3 4 5 6 日期 8.16 9.1 9.16 10.1 10.16 11.1 采集样品的实时环境及南美白对虾生长状况指标列于表 2。 表 2 环境指标记录表 Table 2 Records Of The Environmental Indicators Table
24、 日期 池号 环境数据 对 虾 状 况 温度 PH 水色 盐度 虾长 状态 1 1# 33.4 7.7 黄绿 1.018 1cm 生长良好 2# 33.3 7.7 浅绿 1.018 1cm 生长良好 3# 33.5 7.7 浅绿 1.017 2cm 生长良好 2 1# 30 7 黄绿浑浊 1.018 3cm 生长良好 2# 30 7 黄绿清澈 1.017 3cm 生长良好 3# 30.8 7.2 黄绿清澈 1.018 3.5cm 生长良好 3 1# 29 7.2 黄棕色 1.018 5cm 生长良好 2# 29 7.2 黄棕色 1.018 5cm 生长良好 3# 29 7.2 黄棕色 1.01
25、7 5cm 生长良好 4 1# 患病 死亡 2# 21 7.1 黄褐 1.017 7cm 生长良好 3# 21.2 7.2 墨绿 1.018 6cm 生长良好 5 1# 2# 26 7.2 黄绿 1.018 8cm 生长良好 3# 19 7.2 黄褐 1.017 7.5cm 生长良好 6 1# 2# 22 7.0 黄绿 1.018 10cm 生长良好 3# 全池 收获 1#池、 2#池为南美白对虾大棚养殖池， 3#池为南美白对虾室外露天养殖池。三个养殖池放苗时间均为 2010 年 8 月 16 日前后，其中 1#池南美白对虾于 9 月 20 日全池死亡， 3#池南美白对虾于 10 月 25 日
26、养成捕捞， 2#池南美白对虾于 11 月 10 日养成捕捞。在养殖前两个月，塑料大棚池内水温与室外露天池内水温相近。其后由于气温下降明显，塑料大棚保温效果得以体现，平均水温高于室外露天池。整个养殖过程中， PH 值相对稳定在 7.0-7.7 之间。从水色分析，整个养殖过程 当中水体所含藻类丰富，水质优良。盐度变化不大，在 1.017-1.018 之间波动。塑料大棚养殖池内南美白对虾养成捕捞时平均体长达到 10cm 左右，室外露天养殖池内南7 美白对虾体长达到 9cm 左右 时养成收获 。 分次计算细菌总数结果列于表 3。 表 3 细菌总数随时间变化表 Table 3 Bacteria Chan
27、ges Through The Time Table 对比上述数据，大棚养殖由于定期排污，沉积不明显，环境相对稳定，池内细菌总数呈 均匀上升趋势；室外露天养殖模式虽然是水泥底，但是水排放方式不同，池底有一定沉积物，水环境不稳定，细菌总数指标变化情况没有明显规律。 3.2 实验结果分析 运用 Excel 作出各池细菌总数变化趋势折线图。 1#池细菌总数变化情况列于图 1。 1#池0.0E+001.0E+042.0E+043.0E+044.0E+045.0E+046.0E+047.0E+041 2 3 4 5 6实验次数细菌总数图 1 1#池细菌总量变化图 Figure 1 The Total V
28、ariation Of Bacteria In NO.1 Pond 1#池中细菌总数呈在整个养殖进程中 呈现 急剧上升状态，于放苗半个月时达到了 5.4105个 /ml，养殖时间一个月时升高到了 6.35105个 /ml，最终该池南美白对虾全池死亡。由于养殖环境非生物因子较为稳定，且未检测出该池内含有致病病毒，因此说明南美白对虾养殖过程日期 池号 细菌总数 (个 /ml) 池编号 细菌总数 (个 /ml) 1 1#水样 1.4103 3#水样 5.8103 2#水样 5.6102 3#沉积物 1.09106 2 1#水样 5.4105 3#水样 4.1103 2#水样 3.0103 3#沉积物
29、 1.285106 3 1#水样 6.35105 3#水样 4.5103 2#水样 5.65103 3#沉积物 7.6104 4 1#水样 3#水样 8.0103 2#水样 6.45103 3#沉积物 3.55104 5 1#水样 3#水样 5.5103 2#水样 6.5103 3#沉积物 3.2104 6 1#水样 3#水样 2#水样 1.06104 3#沉积物 8 中的重要生物因子 细菌总数徒增并超过某一数量时，与南美白对虾患病死亡有对应关系。 2#池细菌总数变化情况列于图 2。 2#池0.0E+002.0E+034.0E+036.0E+038.0E+031.0E+041.2E+041 2
30、 3 4 5 6实验次数细菌总数图 2 2#池细菌总量变化图 Figure 2 The Total Variation Of Bacteria In NO.2 Pond 2#池中细菌总数随养殖进程逐渐上升，峰值出现在养殖末期，但始终保持在 1.2104个 /ml指标 以下，由于大棚养殖环境相对稳定，池内有机质、营养物质的逐渐增加导致池内细菌总数稳定上升。养殖过程中各理化因子相对稳定，未检测出致病病毒，池内南美白对虾至养成收获未发生疾病。表明当养殖水体细菌总数变化平稳且低于 1.2104个 /ml指标以下时，南美白对虾生长不会受到明显影响，能够顺利养成收获。从测定数据与养殖进程对应分析，生长可以
31、在正常状态下进行。 3#池细菌总数变化情况列于图 3。 3#池0.0E+001.0E+032.0E+033.0E+034.0E+035.0E+036.0E+037.0E+038.0E+039.0E+031 2 3 4 5 6实验次数细菌总数图 3 3#池细菌总 量变化图 Figure 3 The Total Variation Of Bacteria In NO.3 Pond 3#池细菌总数变化情况与 2#池相比较呈现一定程度波动，这与其室外露天养殖模式有关。由于室外露天养殖水体易受到光照、气温和降水等自然理化因素影响，水环境不稳定，导致水体中细菌总数变化不稳定，整个过程细菌总数升降交替，峰值出现在养殖中末期。细菌总数始终低于 1.2104 个 /ml，养殖池内南美白对虾未发生疾病，直至顺利养成起捕。该池细菌
