1、 本科毕业论文 （ 20 届） 南美白对虾大棚养殖池弧菌检测与分析 所在学院 专业班级 水产养殖学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 目录 中文摘要 1 英文摘要 2 1.前言 3 1.1 南美白对虾 3 1.2 大棚水产养殖的特点 4 1.3 弧菌对水产养殖的关系 5 1.4 本研究的目的和意义 5 2.材料与方法 6 2.1 实验地点与时间 6 2.2 样品采集 6 2.3 培养基 6 2.4 培养和计数 6 2.5 实验数据的处理与分析 6 2.6 菌种的鉴定 6 3.结果与分析 7 3.1 环境因数及 对虾生长的关系 7 3.2 弧菌总数及其变化 8 3.3 弧菌的种类
2、组成 11 4.小结 11 4.1南美白对虾大棚养殖池弧菌总数变化情况 11 4.2大棚养殖池与室外养殖池弧菌数量的比较 12 4.3 TCBS 培养基在虾病治监测中的应用 12 致谢 12 参考文献 13 本科毕业论文中文摘要 1 南美白对虾大棚养殖池弧菌检测与分析 摘要 南美白对虾是当今世界上养殖产量最高的三大优良虾种之一。南美白对虾是集约化高产养殖的优良品种具有适应性广、抗病能力强、生长快、加工出肉率高、肉味鲜美等优点。南美白对虾引进初期，生长主要受到细菌性疾病的影响，后来逐步发展为受到病毒性疾病影响。目前，南美白对虾养殖过程中的细菌性疾病和病毒性疾病共存，同时影响着南美白 对虾的生长。
3、 弧菌是南美白对虾养殖池中的自然菌群之一，当对虾健壮、环境条件优良时，一般不会引起发病。但当环境条件对病原菌的生长适宜时，病原菌大量滋生繁殖，表现致病性。2010 年 8 月至 2010 年 11 月期间，对集约化大棚养殖南美白对虾室内和室外养殖池水样及底部进行弧菌检测 。通过对南美白对虾大棚养殖池弧菌的检测数据进行研究与分析，将实验数据与养殖状况相比较，当弧菌数量在 1.2 103 个 /ml 的范围内， 南美白对虾大棚 集约化养殖可以正常进行，当弧菌数量达到 1.5 103 个 /ml 以上时， 南美白对虾大棚集约化 养殖潜在疾病爆 发的可能。 关键词 南美白对虾 大棚养殖 弧菌检测 疾病
4、防控 本科毕业论文英文摘要 2 Detection And Analysis Of To Vibrio InPenaeus Vannamei Greenhouse Farming Ponds Abstract South American white shrimp is one of the world top three most productive elite shrimps. The South America white shrimp has a lot of advantages, such as outgrowing, adaptability, good anti-virus
5、ability, well-tasted, and the higher percentage of the process; it is the intensive, high productive elite breed. When South American white shrimp were at initial stage, the main effect factor of the shrimps growth is the bacterial disease, and then the viral disease take influence later. Currently,
6、 South American white shrimp survive together with the bacterial disease and the viral disease in the shrimp breed process, meanwhile, which make influence on the growth of the South American white shrimp.Vibrio is one of the natural floras in the pond culture, and it is also the general flora in th
7、e shrimps pond, when the shrimp become well and under the good condition, it wont get sick generally. But when the circumstance become more suitable for the pathogenic bacteria, the pathogenic bacteria will increase largely, and it will show the pathogenicity. During the period of August 2010 to Nov
8、ember 2010, I do the vibrio test for the south America white shrimp which is feed in the intensive canopy culture pond, compared with data form lab, we got a range that when the vibrio in the range of 1.2*103/ml, the south American white shrimp in the intensive canopy culture can do the normal proce
9、ss, when the mount of the vibrio is more than 1.5*103/ml, the possibility of the potential disease break out will increase for the south American shrimp intensive canppu culture. Keywords Penaeus vannamei Trellis breeding Detection of Vibrio Disease Control and Prevention 本科毕业论文正文 3 南美白对虾大棚养殖池弧菌检测与分
10、析 1. 前言 1.1 南美白对虾 1.1.1 南美白对虾生物学性状及分布 南美白对虾（ Penaeus vannamei Boone， 1931）学名凡纳对虾，属节肢动物门（ Arthropoda）、甲壳纲（ Crustacea）、十足目（ Decapoda）、游泳亚目（ Natantia）、对虾科（ Penaeidae）、对虾属（ Penaeus）、 Lito-penaeus 亚属，是广温广盐性热带虾类 1。俗称：又称白肢 虾（ white leg shrimp）、白对虾（ white shrimp），以前翻译为万氏对虾，外形酷似中国对虾、墨吉对虾，平均寿命至少可以超过 32 个月。成体最
11、长可达 24cm，甲壳较薄，正常体色为浅青灰色，全身不具斑纹。步足常呈白垩状，故有白肢虾之称。额角尖端的长度不超出第 1 触角柄的第2 节，其齿式为 5-9/2-4；头胸甲较短，与腹部的比例约为 1： 3；额角侧沟短，到胃上剌下方即消失；头胸甲具肝刺及鳃角剌；肝剌明显；第 1 触角具双鞭，内鞭较外鞭纤细，长度大致相等，但皆短小（约为第 1 触角柄长度的 1/3）；第 l-3 对 步足的上肢十分发达，第 4-5 对步足无上肢，第 5 对步足具雏形外肢；腹部第 4-6 节具背脊；尾节具中央沟，但不具缘侧剌。南美白对虾原产于美洲太平洋沿岸水域，主要分布秘鲁北部至墨西哥湾沿岸 3,25，以厄瓜多尔沿岸
12、分布最为集中。 1.1.2 南美白对虾的经济价值 南美白对虾具有生长快、个体大、抗病力强、营养需求低等优点，对水环境因子变化的适应能力较强，离水存活时间长、对饲料蛋白含量要求低、出肉率高达 65%以上等优点，是集约化高产养殖的优良品种，也是目前世界上三大养殖对虾中单产量最高的虾种 4。南美白对虾壳薄体肥， 含肉率高，肉质鲜美，营养丰富。收成后其耐活力较差，所以大多是速冻上市的。南美白对虾人工养殖可以采取纯淡水、半咸水、海水多种养殖模式，且其生长速度快， 60 天即可达上市规格；适盐范围广（ 0 40），从自然海区到淡水池塘均可生长，从而打破了地域限制，且具耐高温，抗病力强；食性杂，对饲料蛋白要
13、求低， 35%即可达生长所需。是“海虾淡养”的优质品种，使其养殖地域范围扩大。 1.1.3 南美白对虾的养殖现状 据农业部渔业局统计： 2005 年南美白对虾养殖面积 lO 16 万公顷，产量 4O 76 万吨，占对虾养殖面积、产量分别为 44 10、 65 30。海水养殖南美白对虾，主要集中在南海的广东、广西、海南三省 (区 )， 2005 年养殖面积 5 92 万公顷，产量 36 5O 万吨， 占全国南美白对虾养殖面积、产量分别为 58 27、 89 55。仅广东省海水养殖南美白对虾面积就达 3 43 万公顷，产量 l3 95 万吨，占全国南美白对虾养殖面积、产量的 33 76、34 23
14、，说明其单产是很高的。我国淡水养殖南美白对虾发展很快， 2005 年淡水养殖产量达 44 O8 万吨，为海水养殖产量的 108 15。全国海、淡水养殖南美白对虾产量达 84 84万吨， 从南至北、从东至西都在养殖，新疆高原地区养殖南美白对虾也获得成功，我国不愧是南美白对虾养殖的大国 2。内陆水域养殖南美白对虾，改变了养殖品种结构，大大提高了本科毕业论文正文 4 水产养殖的经济效益，但是内陆大力发展南美白对虾养殖，对生态的影响是喜忧参半。主要存在问题有 ： （ 1） 南美白对虾苗种退化 （ 2） 养成规范化操作有待提高 （ 3） 受疾病威胁严重 4。 1.2 大棚水产养殖的特点 传统养殖模式对天
15、气、海域和季节的依赖性强，市场需求、疾病暴发和受自然灾害影响等因素增加了产业管理的难度。生产率低是传统养殖模式的症结。而新型的大棚集约化养 殖呈现出其综合性的优势。在人为控制比较高的情况下，其稳定性和可控性很强。第一，完全摆脱了对海域和天气的依赖性，变室外露天养殖为封闭式室内养殖。第二，养殖行为发生在人工的小环境中，具有很强的人为操作性和可控性，通过调整和改变养殖对象的放养时间或收获时间，可以进行反季节性生产，做到产品全年供给市场。达到增产增值的目的。第三，通过全天候的生产控制，大棚集约化养殖可进行循环式养殖，一年内可进行多茬生产。其高投入和高产出的特点，表现出集约化生产的高生产率，也带来了极
16、高的经济效益和社会效益。大棚集约化养殖符合了产业发展 的方向，所以在某种程度上对传统的养殖模式有取而代之之势。 利用塑料大棚养殖南美白对虾简便易行，具有养殖周期短、产量高、易管理等特点 4,24。与传统养殖模式相比，每年可养殖两茬或三茬，产量提高数倍以上；由于错开了上市旺季，对虾的价格较高。 但是 大棚集约化养殖是高投入高产出的生产模式，其生产水体是高有机质环境，具有高生物量，高有机成分，高微生物量和高污染性的特点。 传统的养殖模式中养殖用水追求的是使用优质海水、新鲜海水进行养殖，而大棚集约化养殖模式采用的是用稳定海水进行养殖。稳定的海水不仅能减少了水环境因子的变 化幅度，构建成一个相对独立的
17、生态环境，降低发病率，还可以节约用水，带来更大的经济效益。 但是，这种集约化生产是在有限水体中放养高密度的养殖对象；大饲料量投喂；养殖期间水环境持续在高水温状态下。这就使得大棚集约化养殖的水环境表现出高生物量、高有机成分、高微生物量。例如残留的饵料、大量的粪便和排泄物、死亡的个体、大量繁生的单细胞藻类和细菌。这种养殖用水的排放对自然环境是一种直接的污染，或是潜在的危害。 1.3 弧菌与水产养殖的关系 在水产养殖初期，主要受到细菌性疾病的影响，后来逐步发展为受到病毒性疾病影响。目前，水产养殖过程中的细菌性疾病和病毒性疾病共存，一同影响着南美白对虾的生长。 我国较为常见的对虾疾病有红腿病（红肢病）
18、、烂眼病、烂鳃病、褐斑病（甲壳溃疡病）、弧菌病等 3,8,9。其病原体主要有革兰氏阴性杆菌：鳗弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌等 5,23。弧菌是一种水产养殖系统中的重要致病细菌，弧菌虾病是一个的主要因素，粪大肠菌群（后进先出粪合作室）是水质监测的一个重要生物指标，污染主要来自人类和动物粪便，粪大肠菌群对养殖水体结合因子试验和化学分析，集约化农业生产条件和水的污染评价度提供了科 学依据 9。病原传播途径多为水质恶化，光线过强等 5。此外 ,通过合理施肥 ,繁殖小球藻等单细胞藻类 ,应用光合细菌、净水 EM 菌等进行生态调控 ,净化水质。整个养殖期间水质始终保持 “ 肥、爽、活、嫩 ”
19、,可明显减少虾病 ,避免虾池发生大批死亡的现象 6。 倪纯治，林燕顺等人于 1995 年发表的海水养殖虾池的几种致病弧菌生态，研究长毛 对虾养成期间几种弧菌致病生态变化规律及其与病害的关系。 8 Yossi Tal, Joy E. M. Watts, Harold J. Schreier 于 2005年 8 月发表 Anaerobic Ammonium-Oxidizing (Anammox) Bacteria and Associated Activity in Fixed-Film Biofilters of a Marine Recirculating Aquaculture System
20、，本科毕业论文正文 5 研究海水养殖系统中微生物的活动情况 6。靳明建 ,季小敏 ,周亚文于 2010 年发表塑料大棚养殖南美白对虾技术要点，在饲养管理中阐述了大棚养殖水体细菌控制对南美白对虾生长的影响 5。中国水产科学研究院南海水产研究所、暨南大学 水生生物研究所 ,水体富营养化与赤潮防治广东省教育厅重点实验室 , 自 2008 年 4 月至 8 月 , 在广东省汕尾市红海湾凡纳滨对虾 ( Lito-penaeus vannamei) 高位池养殖基地全程采集养殖池塘水样 , 检测水体细菌类群和理化因子 , 分析养殖过程中细菌类群的数量变化规律及其与环境因子的关系10。 1.4 本研究的目的及
21、意义 大棚集约化养殖是新型的，是可进行循环式养殖，一年内可进行多茬生产。其高投入和高产出的特点，表现出集约化生产的高生产率，也带来了极高的经济效益和社会效益。大棚集约化养殖是 利用塑料大棚 养殖南美白对虾，具有简便易行，具有养殖产量高、周期短、易管理等特点， 符合产业发展的方向 。与传统养殖模式相比，每年可养殖两茬或三茬，产量提高数倍以上。所以对其水环境的控制具有很大的意义。维持南美白对虾养殖水环境除了理化指标的控制外，维持一个小环境的微生物系统是十分重要的。显然微生物的生物指标是一个表现其水环境的一个很好指标 1,11,15。通过对养殖池水体弧菌数量的检测与分析 ，表现养殖水环境病原生物的状
22、态，为南美白对虾集约化养殖疾病的防治提供有效的依据。 2.材料与方法 2.1 试验地点与时间 从 2010 年 8 月至 2010 年 11 月， 每半个月到 舟山旭旺养殖场 定时定点采集一次 ， 共 6次，时间为 8月 16 日， 9月 1 日， 9 月 16 日， 10 月 1 日， 10 月 16 日， 11月 1 日，分别记为 a、 b、 c、 d、 e、 f。 采集样品的次数与时间对照情况，如表 1 所示， 表 1 实验次数与日期对照表 Table 1 Number of experiments with the date table 次数 a b c d e f 日期 8.16 9
23、.1 9.16 10.1 10.16 11.1 采集养殖虾池的水样和水底沉积物。预先选定三个养殖 池，分别编号为 1#， 2#， 3#。其中 1#和 2#池塘为室内塑料大棚养殖池塘， 3#池塘为室外露天养殖池塘。 2.2 样品采集 分别采集 1#和 2#池塘的水样， 3#池塘的水样及底沉积物，于每次采样时间为10:00-14:00，盛于灭菌的三角玻璃瓶中，放入泡沫箱中，在 3h 内带回实验室立即进行处理，并对上述池塘的水温、水体 PH、水色、盐度、虾体生长情况进行测定记录。 2.3 培养基 分离弧菌的选择培养基（ TCBS） 酵母粉 5.0 , 蛋白胨 10.0, 硫代硫酸钠 10.0, 枸橼
24、酸钠 10.0, 牛胆粉 5.0, 牛胆酸钠 3.0 , 蔗糖 20.0 , 氯化钠 10.0, 柠檬酸铁 1.0 , 溴麝香草酚兰 0.04, 麝香草酚兰 0.04, 琼脂 15.0, pH 值调制 8.6 2.4 培养和计数 平板涂布计数法检测水样中细菌和弧菌数量。对采集来的样品 ,各取 0. 1 ml 稀释液和原水样至平板上 ,用灭菌玻珠滚动涂布 ,再按梯度稀释到 10-1、 10-2、 10-3 浓度，分别将原本科毕业论文正文 6 样、 10-1、 10-2、 10-3 浓度样品及蒸馏水（空白对照组）接种到平面培养基上（每种接种三个平面培养基以求平均） 。接种后，把平板培养基置于 30
25、培养箱内培养 ,培养 24h和 48h后，对 TCBS 平板上生成的黄色和绿色菌落进行计数 ,选取 30-300 之间的培养基板进行计数，同一组的数据求平均后，减去空白组换算出水样和泥样的数据，再计算出原水样和原沉积物样本的弧菌总数并分离出单菌落供种类鉴定。 2.5 实验数据的处理与分析 整理记录下全部数据，结合采样时间制作弧菌总数随时间变化趋势图，直观分析实验结果。发现 24h培养与 48h培养，无明显差距。用 excel制作表格，再制图。将所得数据根据南美白对虾养殖情况，经行分析。 2.6菌种的鉴定 菌株纯化后 ,先作培养特征 ,经革兰染色 ,细胞形 态、运动性、菌落颜色观察 ， 用杭州天
26、和微生物制剂有限公司生产的弧菌生化鉴定管，按“革兰氏阴性杆菌新编码鉴定”系统， 结合 常见细菌系鉴定册 12对菌株进行检索 ,鉴定到种。 3.结果与分析 3.1 环境因素及对虾生长关系 水质环境是南美白对虾养殖的根本基础，水质直接影响南美白对虾的养成和收获。由表2 监测结果可以知道， 表 2 养殖池温度、 pH 值、水色、盐度、虾长的变化 Table 2 The variation of temperature, pH, water color、 salinity and shrimp long 本科毕业论文正文 7 检测期间，南美白对虾养殖池水温变化总体是从 8 月上旬投入虾苗开始逐渐下降，
27、温度范围为 33.5 -19。 1#养殖池病害发生于九月下旬死亡，清池。 2#养殖池在 10 月中旬大棚封顶，养殖水温控制在 22 -25左右，温度范围为 22 -33.3 ,3#养殖池是室外养殖池，其温度变化相对比较大，为 19 -33.5。养殖期间温度稳定下降。养殖 水体 PH 变化比较平稳，一般维持在 ,6.4-7.7 之间。 1#养殖池 PH 范围为 7-7.7， 2#养殖池 PH 范围为 6.4-7.7，3#养殖池 PH 范围为 7.2-7.7，随着养殖时间的增长， PH 平稳降低，其中 2#养殖池在接近捕捞时， PH 降到最低为 6.4，这期间的原因可能是因为虾的有机代谢、排泄物等
28、有机堆积，导致水质环境 PH 降低。在养殖期间，大棚养殖池内盐度变化不是很明显，维持在 1.018-1.017之间。对养殖南美白对虾生长状况的测量， 1#南美白对虾在养殖中期死亡，养殖长度只为5cm，另外 2 个养殖池都正常捕捞，其中 2#室内养殖池虾长为 10cm 左右 ,3#室外养殖池虾长为 7cm 左右，室内大棚养殖池的虾长明显大于室外养殖池。水色变化不大， 没有出现突变或异常现象。 3.2 弧菌总数及其变化 弧菌病是养殖南美白对虾较常见的细菌性疾病。而弧菌的存在及其数量的多少是产生细菌性疾病的基本条件。由于大棚养殖需要定期排污，所以其底沉积物检测不稳定，因此只对室外养殖池进行底沉积物检
29、测，数据列于如表 3， 表 3 水样及底沉积物所含弧菌数 Table 3 Vibrio data records contained in water samples 本科毕业论文正文 8 检测结果表明： 3 个采样点均有弧菌检出，检出率 100%。 图 1 1 号池弧菌总数（ 10 月上旬全 池死亡） Figure 1 Total vibrio of Pond No. 1 (Oct. 1 death of the whole pool) 图 1 表明， 1#室内养殖池内水体弧菌数量变化为 230 1840 个 /ml，养殖池半个月时间内（ a-b），弧菌数量突然爆发，从原来的 230 个 /ml 增到 1840 个 /ml， 9 月下旬，南美白对虾全池虾病死亡。
