1、 本科毕业论文 （ 20 届） 日本黄姑鱼对血糖耐受反应的研究 所在学院 专业班级 水产养殖学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 目录 中文摘要 1 英文摘要 2 1. 前言 3 2. 材料与方法 3 2.1 实验饲料 3 2.2实验鱼和饲养方法 4 2.3 腹腔注射 5 2.4 血样采集 5 2.5 血糖浓度的测定 5 2.6 计算 5 2.7 数据处理 5 3. 结果 6 4. 讨论 6 5. 结论 8 致谢 8 参考文献 9 1 摘要 本实验主要是研究日本黄姑鱼的血糖耐受能力和胰岛素增敏剂（ TZDs）对日本黄姑鱼糖代谢的影响。实验设计了两种饲料，第二种饲料添加了 TZD
2、s，而第一种饲料没有添加TZDs。饲养时，分两个饲养组分别在两个池塘中进行饲养。第一个饲养组投喂第一种饲料，第二个饲养组投喂第二种饲料，共饲养 8 周。饲养结束时，经过 24 小时禁食后，对两个饲养组的日本黄姑鱼注射葡萄糖 进行血糖耐受试验 。实验结果显示， 第三个处理组 的日本黄姑鱼 空腹时 的 血糖浓度 低于第二个处理 组 ； 第二个处理组在 葡萄糖负荷 1h 后，出现 了16.43mmol/L 的 血糖 浓度 峰值，其血糖浓度在 血糖耐受试验的 1h-4h 阶段 明显下降， 并在此后的 4-48h 阶段内缓慢下降， 48h 后未恢复到正常水平； 第三个处理组 在 葡萄糖负荷 3h 后，出
3、现 了 10.83mmol/L 的 血糖 浓度 峰值，其血糖浓度在 48h 后 基本恢复到 正常 水平 。 第二个处理组和第三个处理组的 血 糖 耐受试验 对照 结果 表明，添加 TZDs 影响了 日本黄姑鱼 的血糖耐受反应。 关键词 日本黄姑鱼 糖代谢 血糖耐受试验 胰岛素 胰岛素增敏剂 2 The study on the reaction of glucose tolerance in juvenile giant croaker (Nibea japonica) Abstract This experiment studies glucose tolerance of juvenile
4、 giant croaker and the effect of insulin sensitizer (TZDs) on glucose metabolism of the juvenile giant croaker. Experiment designed two diets, diets 1 adding with TZDs while diets 2 didnt. And the juvenile giant croaker was divided into two feeding groups which was kept in two pond, respectively. Ke
5、pt the first group with the diets 1 while kept the second group with the diets 2, keeping for 8 weeks. At the end of the breeding, after 24 hours of fasting, inject glucose to the two breeding groups of juvenile giant croaker for glucose tolerance test. The results show that the initial blood glucos
6、e concentration of the juvenile giant croaker of the third treatment is lower than the second treatments; one hour after the glucose loading, the blood glucose concentration of juvenile giant croaker of the second treatment appears a peak value of 16.43mmol/L which decreased significantly within fol
7、llowing 1h-4h, and it decreased slightly after 4h and dose not return to the normal level after 48h; three hours after the glucose loading, the blood glucose concentration of juvenile giant croaker of the third treatment appears a peak value of 10.83 mmol/L which return to the normal level in 2 days
8、, slowly. The comparison of the glucose tolerance test in the second treatment and the third treatment suggest that TZDs has an impact on the glucose metabolism of juvenile giant croaker. Keywords Juvenile giant croaker Glucose metabolism Glucose tolerance test Insulin TZDs 3 1. 前言 日本黄姑鱼（ Nibea japo
9、nica）俗称黑毛鲿，属鲈形目，石首鱼科，黄姑鱼属 1-2，为海水肉食性鱼类 3，主要分布于我国的东海、南海和日本南部海域。 1龄日本黄姑鱼全长可达 47cm， 2龄达 68cm， 3龄可达 80cm， 4龄 可达 87cm3-4。目前，日本黄姑鱼已 在浙江沿海深水网箱示范点进行养殖试验，并取得一定成就。因其对盐度的变化适应性强，生长速度快，抗病力强，经济效益好，而深受广大养殖户的欢迎，有望成为我国重要的新养殖品种之一 5。 糖类是自然界中广泛分布的一类化合物，是生命活动的主要能量来源。在人类食物中，糖类供给能量一般占全部能量的 50%-55%，在家畜、家禽饲料中，糖类含量也都在 50%以上
10、6。水产动物虽然与陆生动物一样，可以利用糖类作为其能量来源，但在利用能力方面差别极大。 研究表明，鱼类的糖代谢能力较低 6-7 ， 与陆生动物相比， 鱼表现出对饲料中的 糖类利用性很差 8-10， 特别是 对于 肉食性 的海水 鱼类 更为明显，它们在很大程度上 难以利用葡萄糖作为 其 能量来源。 养殖鱼类对饲料中蛋白质的需要量比较高，约为哺乳动物的 2-4倍 6，蛋白质和脂肪是鱼类能量的主要来源。 研究显示，当与高蛋白低糖饲料相比，高糖低蛋白饲料没有引起肉食性鱼类体内葡萄糖激酶和己糖激酶（调节血糖的关键酶）含量的增加 11-12，而且即使在摄食低蛋白饲料时，肉食性鱼类也是继续使用氨基酸作为能量
11、来源 13-15。 鱼类对糖类利用能力低下最初 被认为可能是由于内源胰岛素水平过低造成的 6， 16。然而，随着放射免疫实验方法 技术 的发展， 并利用此技术 对鱼体 中 胰岛素 的 水平 进行 测定 ，结果 表明 ， 与哺乳动物 相比， 鱼体 中含有较高水平的 胰岛素 17-18。在 所有研究的鱼类中，都有高胰岛素血症 的发生，最高的胰岛素水平出现在餐后 1-3小时 16,19， 24小时后才逐渐恢复到基础水平。 但 研究发现 胰岛素与 受体 (receptor)的结合能力大约只有老鼠的 1/415。因 而推测 鱼类对 糖类 利用性不佳 的可能原因 是因为胰岛素 抵抗 (Insulin Re
12、sistance， IR)所造成 。 鱼粉是水产饲料的主要蛋白源，但制作鱼粉的 原料鱼资源有限，随着水产养殖业的不断扩大，对鱼粉的需求也供不应求，目前国际市场上鱼粉的价格昂贵，因此有限的鱼粉资源越来越不能满足日益扩大的水产养殖业发展的需要。糖类是最廉价的能量饲料原料，通过提高鱼类对糖类物质利用的能力，就可以节约蛋白质，从而能起到节约成本、减少养殖环境污染等作用。因此本实验拟以日本黄姑鱼为研究对象，通过血糖耐受实验以及胰岛素增敏剂（ TZDs）对血糖代谢影响的研究，以期获得鱼类，尤其是肉食性海水鱼类糖代谢的相关机理。 2. 材料与方法 2.1 实验饲料 实验设置了两种饲料，第 二种饲料添加了含量
13、水平为 0.03%的 TZDs，第一种饲料没有添加 TZDs，饲料配方及各成分比例见表 1。 按照表 1 的饲料配方配制并制备饲料，制备步骤如下： 将各种干饲料原料粉碎，按照表1 配方中的比例准确称重，初混；用搅拌机搅拌 15min 后，加入大豆磷脂、鱼油和豆油继续搅拌 15min，然后加入适量的水再继续搅拌 15min； 混合均匀后， 用双螺杆挤压式制粒机（ CD4 1TS）制成直径 1.2 毫米的颗粒； 制备出来的颗粒饲料 在 室温条件下自然风干至水分含量4 少于 10%；用塑料袋封口装袋，在 -20 保存备用。 表 1 实验饲料配 方（干物质） Table 1 Experimental
14、diet formulation (dry matter%) 原料组成 第一种饲料 第二种饲料 鱼粉 47.25 47.25 豆粕 23.27 23.27 大豆磷脂 1.00 1.00 鱼油 1.00 1.00 豆油 0.50 0.50 玉米淀粉 9.00 9.00 Vc 1.00 1.00 胆碱 0.50 0.50 多维 2.00 2.00 多矿 0.70 0.70 TZDs 0.00 0.03 CMC 2.00 2.00 纤维素 11.78 11.75 % 100.00 100.00 营养组成 蛋白质 43.6 43.6 脂肪 7.2 7.2 糖 15.6 15.6 能量 301.3 30
15、1.3 1.复合维生素： g/kg mixture：硫胺素， 5；核黄素， 5；吡哆醛， 4；尼克酸， 20；泛酸钙，10；生物素， 0.6；叶酸， 1.5；肌醇， 200；维生素 E， 40； VA， 5； B12， 0.01； VK3， 4；VD3， 4.8；纤维素， 700.09。 2.复合矿物盐： g/kg mixture：磷酸二氢钙， 122.87； 乳酸钙， 474.22；磷酸二氢钠， 42.03；硫酸钾， 163.83；硫酸亚铁， 10.78；柠檬酸铁， 38.26；硫酸镁， 44.19；硫酸锌， 4.74；硫酸锰， 0.33；硫酸铜， 0.22；氯化钴， 0.43；碘酸钾， 0
16、.02；氯化钠， 32.33；氯化钾， 65.75。 2.2 实验鱼和饲养方法 实验在 浙江海洋水产研究所 (西轩岛 ) 试验场 进行 。 实验用鱼 来源于浙江海洋水产研究所繁殖的日本黄姑鱼幼鱼 。饲养开始前，先将若干健康的大小相近的幼鱼放在选定的水泥池5 中暂养。待生长与摄食稳定后，分两个饲养组分别放入两个水泥池塘 中进行饲养，按照规格整齐的要求挑选幼鱼，随机 分配 ，每池 100条幼鱼。 养殖用水为经过沉淀和过滤处理的天然海水 。采用自然光照，连续充气。养殖用水的水质条件为：水温 27.50 0.45、溶解氧大于 7mg/L、总氨氮在适宜范围内、 pH为 7.8 0.2。饲养期间， 第一个
17、饲养组投喂第一种饲料，第二个饲养组投喂第二种饲料， 每天分 2次投喂（上午 8： 30和下午 17： 30），每次投喂量以鱼饱食为准；每天上午进行换水，傍晚将残饵和粪便吸出；饲养 8周。 2.3 腹腔注射 饲养期结束时，经过 24小时禁食后，取第一个饲养组的 27条鱼 按照每千克活鱼体重注射1克生理盐水的比例进行腹腔注射生理盐水，记为第一个处理组（空白组）；取第一个饲养组的另外 27条鱼按照每千克活鱼体重注射 1克葡萄糖试液的比例进行腹腔注射葡萄糖，记为第二处理组；取第二个饲养组的 27条鱼按照每千克活鱼体重注射 1克葡萄糖试液的比例进行腹腔注射葡萄糖，记为第三个处理组。 注射试剂后，按照组别
18、放入水体中，且不再投喂。 2.4 血样采集 按耐受试验设计的时间 (0h、 1h、 2h、 3h、 4h、 12h、 16h、 24h和 48h)分别采集血液。 用MS-222麻醉药配制成一定浓度的麻醉液麻醉实验 鱼后 ，用注射器从实验鱼的尾部静脉血管抽取血液。然后用 HITACHI高速冷冻离心器 (CT15RE型 )离心血液，离心器温度设置为 -4，转速设置为 10000转 /min，离心 10min。用移液枪将离心后的 血液的上清液 移至新的干净的血液离心管中， 在 -70的温度下保存，以便以后用来进行血糖浓度测定分析。 2.5 血糖浓度的测定 采用酶法测定血样葡萄糖浓度 ， 用紫外分光光
19、度计 (UV-2550型 )进行读数测定。 测定原理：葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下产生葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢在过氧化酶的作用下使邻联甲胺生成蓝色的物 质，其在 505nm的吸光率，即显色程度与葡萄糖含量成正比，并以此作为定量葡萄糖的依据。 测定步骤： (1) 配制测定试剂，并在低温下保存； （ 2）将血样从 -70 的冷冻柜里取出 ，解冻； （ 3） 选择颜色清亮的血样，用移液枪吸取适量血清到干净干燥的试管中，加入测定试剂，配制成测定管试液，振荡 1-2min； （ 4）配制空白管试液和校准管试液，振荡 1-2min； （ 5） 在数显恒温水浴锅 (HH6型 )水浴加热空白管试液、校准管
20、试液和测定管试液，水浴温度为 37，加热 15min； （ 6）水浴加热后用紫外分光光度计读数测定， 波长设置为 505nm。 2.6 计算 葡萄糖浓度计算公式： CH=(As/Ao) C。 CH:血糖质量浓度 (mmol/L)， As:样品管的吸光度值 ， Ao:校准管的吸光度值 ， C:校准液浓度 。 2.7 数据处理 所有数据均采用平均数标准误表示，经单因子方差分析（ ANOVA），之后采用 Duncan氏 (1955)多重比较检验均值的差异显著性，显著性水平为 0.05。统计分析 SPSS 10.0 for Windows，作图采用 Microsoft Excel 2010处理。 6
21、3. 结果 由图 1结果可知，第二个处理组 禁食时血糖含量为 5.54mmol/L， 注射后 1h血糖显著升高 ，达到 16.43mmol/L， 为禁食时的 2.97倍。 1h后血糖开始急速下降至 8.21mmol/L， 但 24h时血糖仍显著高于禁食水平 ， 注射后 48h血糖与禁食水平无统计学显著差异 ， 但仍然要比禁食时高。 图 1 第二个处理组血糖浓度变化图 (mmol/L) 禁食时第三个处理组的血糖含量为 3.78mmol/L， 3h后迅速上升至 10.83mmol/L， 显著高于禁食水平。 3h后，出现缓慢下降现象，降至 7.82 mmol/L， 12h后血糖含量出 现再次下降 ，
22、48h时血糖含量降至 6.65mmol/L。（图 2） 图 2 第三个处理组血糖浓度的变化图 (mmol/L) 4. 讨论 第二个处理组 第一个处理组 第三个处理组 第一个处理组 7 大量文献表明鱼类注射葡萄糖后会表现持久的高血糖 ， 但不同的鱼类糖耐量存在差异。Furuichi等 （ 1981） 20 研究 报道中指出：黄条 鰤（ Seriola quinqueradiata）的 糖耐量最低 ， 真鲷（ Pagrosomus major）其次 ， 鲤鱼最高。斑点叉尾鮰（ Ictalurus punctatus）在口服葡萄糖后也有类似的高血糖反应 21。从本实验的结果（ 图 1）来看，注射葡萄
23、糖后会使日本黄姑鱼的血糖含量升高，在 1h后达到峰值（ 16.43mmol/L），在之后的 1-4h出现急速下降现象（降至 7.72mmol/L）， 48h后（降至 7.41mmol/L）未恢复到正常水平。 这与 Gro-Ingunn Hemre和 Tom Hansen（ 1998） 22对大 西洋鲑鱼的 研究结果相一致。蔡春芳等 (1999)23使用不同糖源及铬对异育银鲫生长和糖耐量的研究中，也得到了相似的血糖浓度变化趋势。 图 3 三个处理组的血糖浓度变化对比图（ mmol/L） 研究 发 现， 哺乳动物 进食后血糖 浓度 急速上升， 此 时胰岛细胞分泌的胰岛素 会 增加机体外周组织对血糖
24、的吸收，从而降低血糖。 进食后，正常人在 2 个小时以内就基本恢复到正常水平 6,24，而研究发现大西洋鲑鱼葡萄糖负荷后， 其血糖浓度恢复到正常水平的时间需 48-96小时 22 。葡萄糖负荷后的血糖浓度出现峰值的时间和恢复至正常水平与正常人存在差异，这说明海水肉食性鱼类对血糖的耐受能力相对低下。 Wilson 等（ 1987） 25曾认为鱼类低的糖耐受量是由于内源性胰岛素分泌不足造成的。但其后 Plisetskaya（ 1990） 26和 Mommsen 等（ 1991） 27的研究表明，鱼类胰岛素水平相似于甚至高于哺乳类。因此人们又研究了胰岛素受体数量及受体与胰岛素的亲和力 28-29，
25、发现胰岛素与 受体 的结合能力大约只有老鼠 的 1/416。 因 而推测 鱼类对 糖类 利用性不佳 的可能原因 是 因为胰岛素抵抗所造成的。 TZDs(Thiozolidinediones)是一种胰岛素增敏剂药物， 其 可加强胰岛素对其靶组织的效应 ， 增强胰岛素的敏感性， 减轻胰岛素抵抗，改善糖代谢 30-32。 从本实验结果（图 3）可以看出，第三个处理组的血糖浓度较第二个处理 组有所变化。禁食时第三个处理组的血糖含量为 3.78mmol/L，显著低于第二个处理组。第三个处理组的峰值时间（ 3h）迟于第二个处理组（ 1h），且浓度峰值低于第二个处理组（ 10.8378mmol/L VS.1
26、6.43 mmol/L） 。 48h 后第二个处理组未恢复至正常水平，而第三个处理组则基本恢复至正常水平。实验结果提示，TZDs 对日本黄姑鱼的血糖耐受反应有影响，其可能增强了 胰岛素的敏感性，从而使胰岛素第一个处理组 第二个处理组 第三个处理组 8 促进肌肉肝脏和脂肪组织中的合成代谢，抑制分解代谢，从而降低了血糖含量 33。 但葡萄糖负荷后，日本黄姑鱼基本恢 复至正常水平的时间还是很长，这可能与鱼类机体或 TZDs 的含量有关，有待进一步研究。 5. 结论 实验结果显示：（ 1）日本黄姑鱼的血糖耐受的血糖浓度峰值出现的时间为 1h，即便在48h后也未恢复至正常水平；（ 2） TZDs影响了日
27、本黄姑鱼的血糖代谢，使日本黄姑鱼的血糖浓度在 3h后出现峰值，在 48h后基本恢复至正常水平，有关的代谢机理有待进一步研究。 参 考 文 献 1 朱元鼎，张春霖， 成庆泰 .东海鱼类 杂 志 .北 京科学出版社， 1963， 277288. 2 张其永，洪万 树 .福建沿 海网箱养殖鮸状黄姑鱼 的鉴别 .福建 水产， 1997（ 2）： 69. 3 王波，张锡烈，曲秀家 等 .日 本黄姑鱼的生物学特性及苗种生产 技术 .海 洋水产研究所，2002， 23（ 4）： 1319. 4 楼宝，徐君卓，吴祖学，等 .日本黄姑鱼养殖试验初报 .上海水产大学学报， 2002， 11（ 4）：324328.
28、 5 许源剑 .日本黄姑鱼的研究进展 .现代渔业信息杂志 .2010， 25（ 5）： 68. 6李爱杰 .水产动物营养与饲料学 .北京 :中国农业出版社 ， 1996. 第 30页 . 7 Shiau S Y. Utilization of carbohydrates in warmwater fish-withparticular reference to tilapia, Orechrom is niloticus O. aureus. Aquac, 1997, 151 (1) : 79 96. 8 Bergot, F.1979. Effects of dietary carbohydr
29、ates and of their modes of distribution on glycemia of rainbow trout, Salmo gairdneri R. Comp. Biochem. Physiol. 64A: 543-547. 9 Christiansen, D.C. and Klungsoyr, L. 1987. Metabolic utilization of nutrients and the effects of insulin in fish. Comp. Biochem. Physiol. 88B: 701-711. 10 Wilson, R.P. (19
30、94) . Utilization of dietary carbohydrate by fish. Aquaculture, 124, 67 80. 11 Cowey, C.B., Dela Higuera, M. and Adron, J. W. 1977a. The effect of dietary composition and of insulin on gluconeogenesis in rainbow trout (Salmo gairdneri). Br. J. Nutr. 38: 385-395. 12 Cowey,C.B.,Knox,D.,Walton,M.J.and
31、Adron, J. W. 1977b. The regulation of gluconeogenesis by diet and insulin in rainbow trout (Salmo gairdneri). Br. J. Nutr. 38: 463-470. 13 Rumsey, G.L. 1981. Why does the salmon require a high protein diets Salmonid 5:20-24. 14 Cowey, C.B., Cooke, D. J., Matty, A.J. and Adron, J. W. 1981. Effects of
32、 quantity and quality of dietary protein on certain enzyme activities in rainbow trout.J. Nutr.111:336-345. 15 Walton, M.J.1986. Metabolic effects of feeding a high protein/low carbohydrate diet as compared to a low protein/high carbohydrate diet to rainbow trout(Salmo gairdneri). Fish Physiol. Biochem. 1:7-15. 16 Hilton,J.W.,Plisetskaya,E.M.& Leatherland, J.F. (1987) Does oral 3,5,3 -triiodo-L-thyronine affect dietary glucose utilization and plasma insulin levels in rainbow trout (Salmo gairdneri). Fish Physiol. Biochem. , 4, 113120.
