1、 本科毕业论文 （ 20 届） 日本沼虾对酸碱度的耐受与响应特征的初步研究 所在学院 专业班级 水产养殖学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 目录 中文摘要 1 英文摘要 2 1.前言 3 1.1 日本沼虾及其研究现状 3 1.2 pH 对水生动物的影响 3 1.3 SOD 和 CAT 与机体免疫机能的关系 4 2.材料与方法 4 2.1 实验材料及其来源 4 2.2 实验设计与 方法 5 2.3 计算方法 6 3.结果 6 3.1 pH 对日本沼虾的急性毒性实验结果 7 3.2 pH 对日本沼虾 呼吸耗氧实验结果 7 3.3 pH 对日本沼虾 抗氧化酶活力实验结果 9 4.讨
2、论 10 4 1 pH 对日本沼虾存活率的影响 10 4.2 pH 对日本沼虾耗氧率的影响及耗氧率的昼夜变化 11 4.3 pH 对日本沼虾的抗氧化酶活力的影响 12 小结 13 致谢 13 参考文献 13 1 日本沼虾对酸碱度的耐受与响应特征的初步研究 摘要 本实验研究了日本沼虾对酸碱度的耐受与响应特征 。本实验测定不同 pH 环境胁迫下，日本沼虾的 96h 存活率变化；日本沼虾的耗氧率变化和日本沼虾鳃组织的抗氧化酶（ SOD、 CAT）的活力变化。实验结果表明： 96 小时 pH 毒性实验得出日本沼虾的可存活范围为 :5.5 8.5。当 pH 在 5.5 8.5 时， pH 的变化对日本沼
3、虾的存活率无显著的影响（ p 0.05）。不同 pH 下，日本沼虾平均耗氧率从小到大排列为： 8.0 7.5 7.0 8.5 6.5 6.0 5.5。 而耗氧率越小，生存生长所需的耗能越少。已有研究表明 :当生物体受到 轻度逆环境胁迫时， SOD 和 CAT 活性往往升高；而当受到重度逆环境胁迫下， SOD 和 CAT 活性通常降低。 96h 时，在 pH=7.0、 7.5、8.0、 8.5 时日本沼虾鳃组织中 SOD 和 CAT 活性低于 pH=6.0 和 6.5。而 pH=5.5 的组， SOD 活力最低， CAT 活力最高，可能对 SOD 来说 pH 为 5.5 是重度胁迫。结合耗氧率实
4、验：在本实验条件下，日本沼虾适宜生存的 pH 范围为 7.0 8.5。 关键词 日本沼虾 pH 存活率 耗氧率 SOD CAT 2 The preliminary study of on tolerance and response characteristics of Macrobrachium nipponense Abstract The experiment report out the preliminary study of on tolerance and response characteristics of Macrobrachium nipponense. The expe
5、rimental determination survival rate change of Macrobrachium nipponense with different pH after 96h, oxygen consumption rate change of Macrobrachium nipponense with different pH and antioxidant enzymes (SOD, CAT) activities of Macrobrachium nipponense gill with different pH . The results showed that
6、: the pH range of Macrobrachium nipponense can survive is from 5.5 to 8.5. When pH was 5.5 8.5, the survival rate has no significant difference（ p 0.05） . The oxygen consumption rate of Macrobrachium nipponense with different pH from small to large order is 8.0 7.57.0 8.5 6.5 6.0 5.5 and the smaller
7、 oxygen consumption rate is the less energy needed for growth is. Studies have shown that: when the organism stress by the mild revese environmental, SOD and CAT activity is always increased, when it stresses by the reverse severe environmental, SOD and CAT activity is usually reduced. At 96h, SOD,
8、CAT activities of Macrobrachium nipponense gill in pH 7.0, 7.5, 8.0 and 8.5 was lower than pH 6.0 and 6.5. And the group of pH 5.5 SOD activity minimum, CAT activity maximum .May be pH 5.5 is the severe stress With oxygen consumption rate experiment In this experimental condition, the suitable pH to
9、 Macrobrachium nipponense from 8.0 to 8.5. Keywords Macrobrachium nipponense pH survival rate oxygen consumption rate SOD CAT 3 日本沼虾对酸碱度的耐受与响应特征的初步研究 1.前言 1.1 日本沼虾及其研究现状 分类地位：日本沼虾（ Macrobrachium nipponense） 又称青虾或河虾，隶属十足目（ Decapoda） 、长臂虾科（ Palaemonidae）、沼虾属（ Macrobrachium） 1、 2。 形态特征： 体色 呈 青蓝并有棕绿色斑纹故
10、名青虾。虾体形粗短，分头胸部和腹部二部分。头胸部较粗大 ，往后渐次细小，腹部后半部显得更为狭小。 青虾共 20 个体节，其中头部 5 节与胸部 8 节愈合在一起，腹部 8 节，腹部除第 7 节外，每个体节均有附肢一对。血液循环系统为开管式循环系统，由心脏、血管和血窦组成，血液含铜与氧气接触呈蓝色。日本沼虾的消化道呈直管状，由口、食道、胃、肛门组成；肝胰脏为主要消化腺，暗橙色，有胆管开口于中肠。呼吸系统为头胸两侧 8 片叶状鳃。神经系统由脑神经节围咽神经和腹神经节组成。青虾雌雄异体生殖腺位于肝胰脏上方，精巢白色，卵巢黄绿色或橘黄色。 生态习性： 该虾肉味鲜美 ,营养丰富。是深受广大群众喜爱的名
11、贵的水产品。 沼虾 属于杂食性，它繁殖力强，生长快，还可与鲢、鲮等非肉食性的鱼类混养，饲养得好，经济效益可观 。沼虾属是个大属，共有 100 余种，分布很广，除欧洲外，世界各地均产，报据文献记录，我国约有 20 种，其中以青虾为最常见。青虾是以动物性饵料为主的杂食性甲壳类，食性广且贪食。影响其摄食强度的因素主要是水温。一般 3 月份水温升到十几摄氏度时开始摄食， 411 月摄食强度最大， 12 月份低温期进入越冬阶段而极少摄食。 青虾栖憩湖泊，池塘和江河中，河北白洋淀、山东微山湖以及江苏太湖等都是著名产区。 研究现状：青虾是日本淡水渔业中重要的经济虾种 3，也是我国淡水养殖业中主要经济虾种之一
12、。目前国内外已对 日本沼虾 的生物学特性 4、养殖技术 5、免疫 6、遗传与发育 7、 8、营养机制 9等进行了较为系统的研究，探讨了温度、 pH、含盐量、 Ca2+、 Cu2+等水环境因子对其代谢生理 10-13的影响，给 日本沼虾 的安全健康生产提供了良好的基础技术保障，应用于生产，使该产业得到了快速的发展。 1 2 pH 对水生动物的影响 pH 值作为水环境生态平衡的指标，是水中化学性状和生命活动的综合反映。 pH 值对 海水鱼虾类的直接影响表现在 pH 过高的水则会腐蚀鱼虾鳃组织，并使孵化中的鱼卵膜早溶，引起胚胎过早出膜而大批死亡； pH 过低的水可使鱼虾血液 pH 值下降减弱其载氧能
13、力，造成鱼虾缺4 氧，影响矿化作用。亚致死的低 pH 值还会影响甲壳动物的性成熟和繁殖。另外，在不利的离子环境下，蜕皮频率降低或每次蜕皮时的增长减少都会使虾的生长速度下降 14、 15。 Tsai16认为 pH 低于 4.8 或者高于 10.6 对于虾而言是致死的，而超过 6.6 8.5 这个范围则会使对虾的生长和食物的转化效率降低。杨富亿等 17研究认为：随着 pH 的升高， 幼虾死亡率先是下降，然后又增加，表明 pH 对青虾幼虾的急性毒性呈双向剂量效应，同时指出青虾幼虾生存的安全范围时 5.26 8.67。 pH 值是影响鱼类呼吸和排泄的重要环境因子，当 pH 值合适时，耗氧率较低，这是由
14、于体内蛋白质的代谢水平最低，脂肪和碳水化合物分解的比例最大的缘故。而在 pH 值不合适的时候，鱼体表现出不适应，将通过改变代谢状况，消耗较多的能量以适应外界环境，表现为增大了蛋白质的代谢比例，造成耗能增大、耗氧率升高 18。 1.3 SOD 和 CAT 与机体免疫机能的关系 在环境胁迫情况下产生的活性氧能够杀伤异 物，但同时对机体本身也是有毒害作用的，因此在所有的需氧生物体中，都具有抗氧化防御系统来防止内源代谢代谢活性氧自由基过量产生，这个系统通常由一些能够被氧化应激诱导的抗氧化酶类和抗氧化物质体系形成。其中超氧化物歧化酶（ SOD）和过氧化氢酶（ CAT）就是两种重要的抗氧化酶。 SOD 可
15、催化 O2-生成H2O2，从而清除 O2-，而 CAT 能催化 H2O2生成水和氧气，因此 CAT、 SOD 酶的变化在一定程度上能反映出机体在环境胁迫下免疫机能的变化 19。 本实验设计了不同 pH 下日本沼虾的存活率；在日本沼虾可存活范围内不同 pH 下 日本沼虾的耗氧率；在日本沼虾可存活范围内不同 pH 下日本沼虾鳃组织的抗氧化酶（ SOD、 CAT）的活性三个实验。旨在研究日本沼虾对 pH 的耐受与其相应的生化特征，得出日本沼虾适宜生存的 pH 范围，以期为日本沼虾的人工养殖提供一定的理论基础。 2. 材料和方法 2.1 实验材料及其来源 实验所用日本沼虾购自舟山定海农贸市场，并暂养两
16、天，然后再选取体长（ 4.46 0.75cm） ,体重（ 2.25 0.48g） 的健康虾随机分组。 实验用水是以经过曝气 48h 处理的自来水， pH 为（ 7.15 0.10） ，溶解氧 大于 6mg/L，再添加酸、碱溶液配制成实验水。 实验容器是 10L 的塑料盆，盛装实验水 5L 和 30L 的塑料箱，盛装 15L实验水。 耗氧率的测定仿照黄玉瑶 20流水密封装置，稍加改进。呼吸室的规格为 2.7L,可以完全密5 封并方便地排出呼吸室的空气。溶氧测定采用电化学探头法 , DO-958 溶解氧电极溶解氧测定仪。 pH 值用 FZ20pH 计（梅特勒 -托力多仪器有限公司）测定。虾体重用
17、Sartorius BP211D 电子天平称量。 抗氧化酶活度实验所用的仪器是 722S 分光光度计（上海医疗器械公司），离心机是由上海安亭科学仪器厂生产， HH-S 电子恒温水浴，考马斯亮蓝蛋白质含量测定试剂盒、 SOD 活力测定试剂盒、 CAT 活力测定 试剂盒均由南京建成生物工程研究所生产。 2.2 实验设计与方法 2 2 1 pH 毒性试验 以公差 0.5 pH 单位 ,在 3.5 10.5 之间设 15 个 pH 梯度。每个梯度设定 3 个平行组。采用曝气 48h 的自来水添加 1.0 mol/L 的 HCl 和 NaOH 来 配制实验水，其中 3.5 7.0 梯度用 HCl 调节
18、,7.5 10.5 用 NaOH 调节。将日本沼虾投入盛装 5L 实验水的塑料盆中，每组投放 10 尾 ,每小时观察记录一次，及 时捞出死亡的虾，捞出的死虾进行解剖观察它的内脏组织和鳃组织，每 24h 换一次水，实验水温为 25 0.7， 保持 24h pH 变化幅度 0.2 个 pH 单位。最后以每个平行组的平均值得出 96h 死亡率。 2.2.2 呼吸耗氧率实验 根据 pH 毒性试验的结果，日本沼虾可生存 pH 范围为 5.5 8.5。在这个范围内，以公差 0.5 pH 单位 ,在 5.5 8.5 之间设 7 个 pH 梯度，做不同 pH 下，日本沼虾的呼吸耗氧实验，保持 24h 变化幅度
19、 0.2 个 pH 单位。 试验前 , 将试验虾放在暂养箱中 , 控制实验水温为 25 0.8 ,静置停食 24h , 至无粪便排出后，取 4 尾日本沼虾放入呼吸室内 , 让虾在室温下适应 2h , 待虾在呼吸室安静下来，呼吸平稳 , 活动自如后开始采样。每隔 2 h 测定 1 次流入水与流出水的溶氧量 , 并测定呼吸室进出水流量，连续测定 24 h 。对日本沼虾耗氧率的测定 , 每次重复测定 3 次 , 记录数据。试验结束后 , 用吸水纸吸干试验虾体表水分 , 称其体重。 2.2.3 抗氧化酶活力实验 根据 pH 毒性试验的结果，日本沼虾可生存 pH 范围范围为 5.5 8.5。在这个范围内
20、，以公差 0.5 pH 单位 ,在 5.5 8.5 之间设 7 个 pH梯度，控制实验水温为 25 0.8 ，做不同pH 下，日本沼虾的酶活度实验。将日本沼虾投入盛装 15L 实验水的塑料箱中，每组投放 15 尾。测定 24、 48、 72、 96h 的 SOD、 CAT 的活力， 每 24h 换一次水，保持 24h 变化幅度 0.2 个 pH单位。 测定时，每次每组取 3 尾虾的鳃，准确称其重量，加 9 倍的生理盐水制成 10%的组织匀浆备用，根据需要调成适合实验浓度的组织匀浆，测定个组织匀浆的蛋白质含量。 SOD 测定原理：6 通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基，后者氧化
21、羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈 现紫红色，用可见光分光光度计测其吸光度。当被测样品中含 SOD 时，则对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，使形成亚硝酸盐减少，比色时测定管吸光度值低于对照管吸光度值。 CAT 测定原理： CAT 分解 H2O2的反应可通过加入钼酸铵而迅速中止，剩余的 H2O2与钼酸铵作用产生一种淡黄色的络合物，在 405nm 处测定其生成量。按照 SOD、 CAT测定试剂盒说明书上的操作步骤操作。每个组织匀浆样本重复测定 3 次。蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法，并根据测定数据计算 SOD、 CAT 活力。 2.3 计算方法 2.3.1 计算公式 死亡率 （ %） =虾
22、总数（尾）死亡数（尾） 100 耗氧率 mg/(g.h)= M L)X-(X 21 公式中： X1是进水溶氧量（ mg/L） ， X2是出水溶氧量 (mg/L),L 为单位时间水流量（ L/h），M 为虾体重。 蛋白含量（ g/l） = 值）空白管值（标准管 值）空白管值测定管 ODOD ODOD -( 标准管蛋白浓度（ g/L） 组 织 匀 浆 中 SOD 活 力 （ U/mgprot ） = 值对照管 值）测定管值对照管 OD ODOD -( 组织中蛋白含量 稀释倍数 50（ mgprot/ml） 组织 匀浆中 CAT 活力（ U/mgprot） =取样量待测样本匀浆蛋白浓度值）测定管值对
23、照管602 7 1-( ODOD （ mgprot/ml） 2.3.2 数据处理 所得数据均用 Excel 软件和 spss 17.0 软件做数据处理和统计分析，采用单因子方差分析（ one-way ANOVA） ， 用 p 0.05 表示差异不显著， p 0.05 表示差异显著。 3. 结果 3.1 pH急性毒性实验结果 随着 pH 的升高，日本沼虾的 96h 急性毒性实验的死亡率是先下降，然后又增加，说明7 pH 对青虾的毒性呈双向剂量效应（表 3- 1）。 pH 对日本沼虾的存活率的影响极显著 （ ANVOA，F（ 14， 30） =26.31 F0.01(14， 30)， p 0.01
24、)。 pH=3.5 的酸性条件下的日本沼虾虾，死亡速度最快，24h 内全部死亡。死亡个体尾巴蜷曲，全身发白，附肢脱落。解剖后发现腮颜色略显红色，较正常虾深，内脏松散。在 pH 为 5.5 8.5，日本沼虾的存活率无差异 （图 3-1），存活率均为100%。由此可以认为：日本沼虾的可存活范围为 5.5 8.5。 表 3-1 不同 pH 下 96h 日本沼虾的死亡率 Tab.3-1 Mortality of Macrobrachium nipponense with different pH pH 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.
25、5 10.0 10.5 平均死亡率（） 100 80 36.7 20 0 0 0 0 0 0 0 16.7 33.3 76.7 100 存活率0204060801001203 4 5 6 7 8 9 10 11pH96h存活率存活率图 3-1 不同 pH 对日本沼虾存活率的影响 Fig.3-1 Survival rate of Macrobrachium nipponense with different pH 3.2 呼吸耗氧 实验结果 采用流水呼吸室法连续 24h 观察测量，整个实验过程中，日本沼虾始终处于安静状态，水温在 25 0.8范围内， 不同 pH 下 24h 耗氧率测定结果见表
26、3-2。 从表 3-2 可以看出，基本上每个 pH 条件下日本沼虾的耗氧率出现了 2 个高峰。第一个高峰出现在 6:00，经方差分析 ，各组在 6： 00 的耗氧率与临近时间点的耗氧率差异极显著（ p 0.01），显著高于临近时间点水平。在 pH 为 5.5、 6.0、 6.5 第二个高峰持续出现在 14:00到 18： 00，在 14:00到 18： 00，根据统计学分析，其耗氧率差异不 显著 （ p 0.05）， 显著高于临近时间点（ p 0.05）。而在 pH 为 7.0、 7.5、 8.0、 8.5 的组在 14:00 到 18： 00 这个时间段上出现 14:00 和 18:00 两
27、个高峰（图 4-1），在 14:00 和 18:00 显著高于 16:00 和其它临近的时间点（ p 0.05）。最低值出现在 22:00， 00:00， 2:00，其耗氧率为显著低于其他各时间点（ p 0.05）。从表 3-2 可以看出，在日本沼虾可存活范围（ 5.5 8.5） 内不同的 pH 情况下，随着 pH 的升高，耗氧率有先下降后上升的趋势（表 3-2）。经方差分析结果显示 ，在 8 表 3-2 不同 pH 下日本沼虾的耗氧率 Tab.3-2 Oxygen consumption rate of Macrobrachium nipponense with different pH 注
28、：同一行中带不同字母的表示相互之间差异显著（ p 0.05） Note: The data with different letter in the same line means significant difference each other （ p 0.05） 可存活 pH 范围（ 5.5 8.5） 内， pH 对青虾耗氧 率影响显著（ p 0.05）。每个 pH 条件下，日时刻 不同 pH 下的耗氧率 mg/(g.h) 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 0:00 0.1900.007a 0.1760.001b 0.1480.004c 0.140 0.002d 0
29、.110 0.001e 0.108 0.001e 0.189 0.005a 2:00 0.1920.006a 0.1790.003b 0.1710.006c 0.149 0.001d 0.129 0.001e 0.118 0.001f 0.189 0.002a 4:00 0.2340.005a 0.1960.006c 0.1940.005c 0.168 0.004d 0.154 0.005e 0.150 0.002e 0.204 0.002b 6:00 0.3770.004a 0.3550.004b 0.3240.002c 0.284 0.003e 0.280 0.004e 0.215 0.0
30、05f 0.310 0.006d 8:00 0.1840.003a 0.1780.002a 0.1660.001b 0.155 0.003d 0.142 0.001e 0.132 0.003f 0.159 0.002cd 10:00 0.1800.005a 0.1720.005b 0.1600.001c 0.117 0.001d 0.115 0.003d 0.104 0.002e 0.144 0.004c 12:00 0.2580.001a 0.2100.002b 0.2040.003b 0.186 0.002d 0.168 0.008e 0.147 0.001f 0.195 0.001c 1
31、4:00 0.3320.013a 0.3300.001b 0.3250.002bc 0.311 0.003c 0.296 0.002d 0.268 0.002e 0.320 0.004c 16:00 0.3290.007a 0.3210.006b 0.3040.002c 0.220 0.001f 0.238 0.002e 0.202 0.002g 0.254 0.001d 18:00 0.3510.005a 0.3390.002b 0.3270.002c 0.276 0.005f 0.285 0.001e 0.272 0.001f 0.293 0.005d 20:00 0.2140.009b
32、0.2030.003a 0.1880.002c 0.184 0.013cd 0.177 0.001d 0.171 0.003d 0.179 0.002cd 22:00 0.1900.005a 0.1870.003a 0.1750.002b 0.175 0.003b 0.159 0.003d 0.128 0.001e 0.166 0.004c 日平均耗氧率 mg/(g.h) 0.2720.005 0.2580.004 0.2480.003 0.211 0.002 0.207 0.005 0.188 0.002 0.228 0.002 夜平均耗氧率 mg/(g.h) 0.2330.002 0.2160.003 0.2000.004 0.183 0.003 0.168 0.002 0.148 0.002 0.206 0.005 平均耗 氧率 mg/(g.h) 0.2520.007 0.2370.002 0.2240.002 0.197 0.003 0.188 0.002 0.168 0.002 0.217 0.004
