1、 本科毕业论文 （ 20 届） 日本沼虾对温度（渐变）耐受与响应特征的初步研究 所在学院 专业班级 水产养殖学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 目 录 中文摘要 . 1 英文摘要 . 2 1.前言 . 3 1.1 日本沼虾 . 3 1.2 超氧化物歧化酶（ SOD） . 3 1.3 过氧化氢酶 (CAT) . 3 1.4 水温 . 3 2.材料与方法 . 4 2.1 实验材料 . 4 2.2 实验方法 . 4 3.结果与分析 . 6 3,1 渐变温度对日本沼虾影响的温度范围 . 6 3.2 渐变温度对日本沼虾耗氧率的影响 . 7 3.3 不同温度渐变下 日本沼虾 的响应特征
2、. 8 4.讨论 . 10 4.1 对日本沼虾水温渐变的适应性分析 . 10 4.2 不同水温渐变对日本沼虾耗氧率的影响 . 10 4.3 不同水温渐变对日本沼虾 SOD,CAT 活力的影响 . 11 5.小结 . 11 6.致谢 . 错误 !未定义书签。 参 考 文 献 . 12 1 日本沼虾对温度（渐变）耐受与响应特征的初步研究 摘要 测定不同温度渐变条件下 日本沼虾 的存 活率，并且研究在最适 生存的水温范围内 日本沼虾 的耗氧率，鳃中的氧化氢酶、超氧化物歧化酶的 活力 。结果表明：在不同温度渐变条件下 日本沼虾全活范围 保持在 15一 30之间 ， 日本沼虾 的最适生存水温为 22.5
3、 27.5 ，12.5 日本沼虾的成活率为 0.32 0.06， 32.5 日本沼虾成活率为 0.45 0.09。 日本沼虾的耗氧率 通过 SPSS 上单因素放差分析， 得到 耗氧率在 22.5 、 25 、 27.5显著差异 (p 0.05)。日本沼虾 的耗氧率 下降到波谷为 0:00、 10:00、 14:00， 达到波峰的是 6:00、 14:00、 18:00。日本沼虾 的耗氧率曲线从 22.5到 25再到 27.5逐渐递增，曲线的图形基本相同。 通过单因素放差分析得到，青虾的 在 22.5 、 25 、 27.5 的 SOD 和 CAT 活力差异 差异（ p 0.05） 。在相同水温
4、条件下 CAT 和 SOD 的活力都随着时间的增长而下降，不同渐变后水温 CAT 和 SOD活力也都随着水温的上升而上升。 关键词 ： 日本沼虾 水温渐变 耗氧率 超氧化物歧化酶 过氧化氢酶 2 temperature (gradient) tolerance and response characteristics of the preliminary study of Macrobrachium nipponense Abstract Under different temperature gradients measured the survival rate of freshwater
5、 shrimps， And study the water temperature in the range of optimal survival of the oxygen consumption rate ， gill in the catalase (Catalase CAT), superoxide dismutase (Superoxi dedismutase,SOD) vitality of freshwater shrimp 。 The results showed that:Under different temperature gradient in the freshwa
6、ter shrimp keep the whole live the range for 15 一 30 ， The optimum temperature for survival of freshwater shrimp 22.5 27.5 ， At 12.5 , the survival rate of Macrobrachium nipponense was 0.32 0.06， At 32.5 , the survival rate of Macrobrachium nipponense was 0.45 0.09。Freshwater shrimps with the oxygen
7、 consumption rate by spss put single factor analysis of variance， Oxygen consumption rate obtained in 22.5 、 25 、 275 significant difference (p 0.05)。 Oxygen consumption rate of freshwater shrimp as 0:00、 10:00、14:00 down to trough, reaching peak is 6:00、 14:00、 18:00.Freshwater shrimp from the oxyg
8、en consumption rate curve of 22.5 to 25 and then27.5 is increased gradually， Curve is basically the same。 Released by single factor analysis of variance are, freshwater shrimp at 22.5 , 25 , 27.5 in the difference between SOD and CAT activity (p 0.05)。 With the water temperature conditions in the sa
9、me vitality of both CAT and SOD increased and decreased over time。 Different temperature gradient CAT and SOD activity after also rising with the temperature rise。 Keywords Macrobrachium nipponense Temperature gradient Oxygen consumption Superoxide dismutase Catalase 3 日本沼虾对温度（渐变）耐受与响应特征的初步研 究 1.前言
10、1.1 日本沼虾 青虾又名日本沼虾 (Macrobrachium nipponense)或河虾 ， 属于节肢动物门 ， 甲壳动物纲 ，十足目（ Decapoda） 、长臂虾科 （ Palaemonidae）、 沼虾属 （ Macrobrachium） 。 青虾是 产量 较大、经济价值较高的一种淡水虾类 【 1】 ，主要分布于中国，日本，越南中部以北及俄罗斯远东地区的咸淡水和淡水水域，我国的 江苏太湖、河北白洋淀以及山东微山湖等都是著名产区。 日本沼虾 青绿色，带有棕色斑点。 日本沼虾 的体色 受生活 环境 影响 。 日本沼虾 体外 有 外骨骼。 日本沼虾 是 由 20 个体节组成 的 整体，头
11、胸部 13 节， 是由 头部 5 节与胸部 8 节 组成的 ，腹部 8 节，每个体节均具一对附肢 【 2】 ，除第 7 节 没有 ，青虾的内部系统包括 :消化 、 呼吸 、 循环 、 排泄 、 神经 、 生殖。 日本沼虾 一般生活在 水底，白天 生活 在阴暗的 地方 ,一般 夜间活动。在天然水域中 ,日本沼虾 的栖息地点有季节变化。温暖 的 夏秋季节在 水流缓慢的生活 , 严寒冬春季节越冬 一般在湖里的深水地带 。 日本沼虾 的 11大类食物是浮游植物、轮虫、桡足类、水生寡毛类、昆虫、鱼原生动物、枝角类、虾、植物碎片和有机碎屑。 日本沼虾寿命短， 一般最多成活 11个月， 一般日本沼虾 在 当
12、年 6月 7月份出生 到 次年的 5月份 就 开始死亡，至 8月份就几乎全部死亡。 日本沼虾 在其生长过程中有蜕壳现象 , 因为 蜕壳作用 的不同而 分为三种类型，分别是变态蜕皮 、 生长蜕壳 、 生殖蜕壳。影响蜕壳的环境因素有 水 温 、 食物 、 光照 、 Ca2+浓度。 日本沼虾含有丰富的蛋白质 和 矿物质（如钙、磷、铁等），营养价值很高，可食部分蛋白质占 16 20左右 ，它的 肉质松软，易消化，但又 肉 鲜味美 无腥味和骨刺。 日本沼虾 还具有经济价值高，生长快，养成周期短，饲料要求低，繁殖 容易，可全天候养殖等优点 【 3】 。前几年，全国 日本沼 虾 养殖面积就超过 300万亩，
13、年产值过 20万吨。目前国内外对 日本沼虾 的研究有很多，例如光波长对日本沼虾的研究 【 4】 ，饥饿 【 5-6】 ， 耗氧率 【 7】 ，排氨率和 Na+/k+ATPase 比活力 【 8】 ，牛磺酸 【 9】 ，血清酚氧化酶活力 【 10】 ，能量方面 【 11-12】 。 1.2 超氧化物歧化酶（ SOD） 超氧化物歧化酶（ SOD）是含有金属微量元素的活性蛋白酶，其主要成员有 Cu-SOD、 Zn-SOD、Mn-SOD和 Fe-SOD。 SOD有许多重要作用 例如： 神经存活 【 24】 和信号传递 【 20】 。 SOD具有特殊的生理活性，能够把有 害的超氧阴离子自由基转化为过氧化
14、氢，是生物体内清除氧自由基的首要物质 【 23】 。 目前国内外对虾类和 SOD的研究不多，水温骤降 【 22】 ，饥饿 【 6】 ，肌肉中 SOD分离探索对一些虾类的研究。 1.3 过氧化氢酶 (CAT) 过氧化氢酶是催化过氧化氢分解成氧和水的酶， 它 存在于细胞的过氧化物体内。过氧化氢酶是过氧化物酶体的 标志酶 , 约占过氧化物酶体酶总量的 40%。过氧化氢酶存在于所有已知的动物的各个组织中，特别在肝脏 中以高浓度存在。过氧化氢酶（ CAT）是一种酶类清除剂，又称为触酶，是以铁卟啉为辅基的结合酶。它可促使 H2O2分解为分子氧和水，清除体内的过氧化氢，从而使细胞免于遭受 H2O2的毒害，是
15、生物防御体系的关键酶之一。 1.4 水温 4 水温是影响水产生物生长、发育的主要生态因子之一，直接影响着水产生物的存活、生长和代谢强度等 【 13】 ，目前国内外关于水温对水生生物影响的研究有一些，例如 水温 关于 福寿螺的研 究 【 25】 ，对鱼虾等的研究 .但关于水温渐变对水生生物影响的研究不多，关于鱼类方面如条纹斑竹鲨，五日龄草鱼的温度耐受性研究 【 26,27】 ，关于昆虫方面如强壮箭虫对温度、盐度的耐受性研究 【 28】 ，关于虾类方面斑节南美白对虾耐受性方面研究 【 29,30】 。目前关于水温渐变对日本沼虾的研究基本没有，拟通过实验研究水温渐变对日本沼虾成活率的影响，确定日本沼
16、虾成活率最高的水温渐变范围。通过研究水温渐变对日本沼虾耗氧率和青虾鳃中过氧化氢酶、超氧化物歧化酶的含量来证明 日本沼虾 成活率最高的水温渐变范围。 2. 材料与方法 2.1 实验材料 实验所用日本沼虾购自舟山定海 ,驯养 2 天以上，驯养期间充气不喂食。 然后再选取体长（ 4.46 0.75） cm,(1.58 0.66)g 的健康虾随机分组。实验用水是以经过充分曝气处理的自来水 ， PH 为 7.15， 30L 的塑料箱，盛装 15L 实验水。呼吸器规格 :2.7L，塑料袋若干，大量冰块，小鱼网 2 个，温度计 11 个，小烧杯 3 个，试管若干， 移液管 2 个， 溶氧测定采用电化学探头法
17、 , DO-958 溶解氧电极溶解氧测定仪。酶活度实验所用的仪器是 722S 分光光度计（上海医疗器械公司）， HH-S 电子恒温水浴，离心机是上海安亭科学仪器厂生产，考马斯亮蓝蛋白质含量测定试剂盒、 SOD 活力测定试剂盒、 CAT 活力测定 试剂盒均由南京建成生 物工程研究所生产 等 。 2.2 实验方法 2.2.1 不同温度下青虾的成活率 把大小相同的健康 日本沼虾 放入装有相同水的常温水箱中，然后把温度渐变到实验所需要的温度。（把 10 只 日本沼虾 放进水箱中由常温开始加热或减温，观察 3 小时 3 、 2 小时 3 、1 小时 3青虾的成活情况）通过预实验确定实验温度范围。 设置一
18、个预实验组，记录实验数据。设置温度 12.5 、 15 、 25 、 30 、 32.5。每小时用塑料袋包裹冰块（不漏水）与加热棒控温，两小时记录实验数据一次，连续记录 48 小时。实验时静水，不喂食，不充 气，不换水。推测得到具体实验温度范围。 设置一个实验组，两个平行组观察，记录实验数据。设置温度 12.5 、 15 、 17.5 、20 、 22.5 、 25 、 27.5 、 30 、 32.5。每小时用塑料袋包裹冰块（不漏水）与加热棒控温，两小时记录实验数据一次，连续记录 48 小时。实验时静水，不喂食，不充气，不换水。 成活 率（ %） =成活 数（尾） /虾总数（尾） （ 1）
19、2.2.2 在最适合 日本沼虾 成活的温度下 日本沼虾 的耗氧率 C D D E F 图 2-1 耗氧率的测定的流水密封装置 5 Figure 2-1 Determination of oxygen consumption rate of water seal 图中 A 为水塔， G 为虹吸管， L 为控制流量的开关， C 为呼吸室 ,D 为恒温水槽， I 为已耗氧水暂存瓶， E 为水盆（ 2 小时的总水量）， F 为玻璃管， 了解到青虾的最适水温大体是百度百科的青虾介绍为 22 -27， 中国儿童资源网 的 海洋生物 的 青虾 为 24 -27， 安徽农网农业科技 的 日本沼虾 (青虾 )养
20、殖技术 为 26 -28， 湖州农村经济信息网 的 青虾 优质高产养殖技术 为 22 -28， 商情信息 网的 青虾的 养殖 为 24 -28等。所以确定 22.5， 25， 27.5三个水温梯度来进行一些初步响应研究。 试验虾放在水族箱中，驯养充气不喂食至无粪便排出后将虾放入呼吸室内密封，虾在呼吸室内适应 2 小时后采样。呼吸室规 格为 2.7L，可以完全密封，呼吸室密封时呼吸室内排除所有空气。放进调好温度和流速的呼吸室后 ,还有 2 小时的适应时间。实验时 , 扭开开关 L 水流进入呼吸室经动物呼吸后 ,分别流入已耗氧水暂存瓶 ,多余的溢入水盆中，等待计算体积，计算流量。实验结束后 ,将各
21、组实验鱼用滤纸吸干 ,分别在分沂天平上称重。每隔 2 小时用溶氧测定仪测定 1 次流入水与流出水的溶氧量， 2 小时中流出的水的体积，连续测定 24 小时。设置 2 个平行取相近 2 数字的平均数。试验结束后，用吸水纸吸干试验虾体表水分，称其体重。按下列公式计算虾的耗氧率： 耗氧率 mg/(g*h)=(A-B)*V/h/w （ 2） 式中： A,B分别为进出水口的溶氧量（ mg/L）， h为 2小时 ,v为 2小时中流出的水的体积， w为虾体重（ g）。 2.2.3 水温渐变 下青虾的抗氧化机能的影响 2.2.3.1 取样和取得青虾鳃的蛋白质浓度 测定时，每次每组取 3 尾虾的鳃，准确称其重量
22、 ，准确称取组织重量并碾磨，加 9 倍生理盐水制成 10的组织匀浆， 2500 转 /分离心 10 分钟，取上清，再用生理盐水稀释到所需要的浓度。用考马斯蓝法取得青虾鳃的蛋白质浓度。 2.2.3.2 超氧化物歧化酶 SOD 活力的测定 使用南京建成生物工程研究所的 超氧化物歧化酶（ SOD）测试盒，测定管的的配制方法是取试剂一 1ml，样品 0.05ml，试剂二 0.1ml，试剂三 0.1ml，试剂四 0.1ml 用漩涡混匀器充分混匀，置 37恒温水浴 40 分钟再放入显色剂 2ml 混匀。对照管的的配制方法是取试剂一 1ml，蒸馏水 0.05ml，试剂二 0.1ml，试剂三 0.1ml，试剂
23、四 0.1ml 用漩涡混匀器充分混匀，置 37恒温水浴 40 分钟再放入显色剂 2ml 混 匀。测定管和对照管配制好以后都要室温放置 10 分钟，与波长 550nm 处， 1cm 光径比色杯，蒸馏水调零，比色。以每毫克组织蛋白在 1 mL 反应液中SOD 抑制率达 50时所对应的 SOD 量为一个 SOD 活力单位。 组织匀浆中 SOD 活力 =【 (对照管吸光度一测定管吸光度 )/对照管吸光度】 50 (反应液总体积，取样量 )组织中蛋白含量。 （ 3） 2.2.3.3 过氧化氢 CAT 活力的测定 使用南京建成生物工程研究所的过氧化氢（ CAT） 测试盒，测定管的的配制方法是取 37预热的
24、试剂一 1ml， 37预热的试剂二 0.1ml，混匀，置 37反应 1 分钟再放入试剂三 1ml，试剂四 0.1ml，组织匀 ,0.05ml 混匀。对照管的的配制方法是取 37预热的试剂一 1ml， 37预热的试剂二 0.1ml，组织匀浆 0.05ml 混匀，置 37反应 1 分钟再放入试剂三 1ml，试剂四0.1ml 混匀。测定管和对照管配制好以后都要放在 0.5cm 光径， ,450nm 处，蒸馏水调零，测各管吸光度。以每毫克组织蛋白每秒钟分解 0.000001mol 的 H202 的量为一个活力单位。 组 织匀浆中 CAT 活力 =(对照管 OD 值一测定管 OD 值 ) 271 (1
25、60X 取样量 )匀浆蛋白6 含量。 （ 4） 3. 结果与分析 3,1 渐变温度对 日本沼虾 影响的温度范围 3.1.1 温度渐变时间不同对实验的影响 表 3-1(a) 温度渐变时间不同对青虾的影响 Table 3-1 (a) temperature gradient at different times the impact on the freshwater shrimp 时间 /温度 30 33 36 39 42 27 24 21 1小时 正常 有死亡 有死亡 较多死亡 死光 正常 正常 正常 2小时 正常 有死亡 有死亡 较多死亡 死光 正常 正常 正常 3小时 正常 有死亡 有死亡
26、 较多死亡 死光 正常 正常 正常 表 3-1(b) 温度渐变时间不同对青虾的影响 Table 3-1(b) temperature gradient at different times the impact on the freshwater shrimp 时间 /温度 18 15 12 9 6 3 0 1小时 正常 正常 反应迟钝 部分昏迷 昏迷有死亡 昏迷较多死亡 死光 2小时 正常 正常 反应迟钝 部分昏迷 昏迷有死亡 昏迷较多死亡 死光 3小时 正常 正常 反应迟钝 部分昏迷 昏迷有死亡 昏迷较多死亡 死光 从表 1 可见，在预实验的温度渐变过程中，在其它实验条件相同的情况下， 3
27、 小时渐变 3，2 小时渐变 3， 1 小时渐变 3的结果表明由常温 27渐变向上或下变温过程中，温 度上升时发生现象相同。 36开始出现死亡随温度上升死亡增多到 42都死亡，温度下降时到 9时现象相同， 9都 0的过程中 日本沼虾 都昏迷，时间一长就会死亡。在实验中温度渐变的时间不同表现的现象差不多，所以在只有温度渐变时间不同其它实验条件相同的情况下，温度渐变的时间不同不影响实验结果，本实验取 1 小时渐变 3的温度渐变实验方法。 3.1.2 温度渐变后大致温度范围内的存活和死亡境况 表 3-2 大致温度范围内的存活和死亡数 Table 3-2 approximate temperature
28、 range of the number of survival and death 温度 12.5 15 25 30 32.5 死亡数 7 0 0 0 6 存活数 3 10 10 10 4 从表 2 可见，在初步温度范围内，在其它实验条件相同的情况下， 48 小时内观察记录的日本沼虾 的生存情况： 12.5时成活率为 0.3,15 、 25 、 30为全活， 32.5的成活率为0.4,温度误差 0.5， 进一步实验通过 较多的温度取值，多次实验来 得出 日本沼虾 在水温渐变的条件下具体的成活率范围。 3.1.3 不同温度下 日本沼虾 的成活率 表 3-3 不同温度下 日本沼虾 的成活率 Ta
29、ble 3-3 freshwater shrimp survival rate at different temperatures 温度 成活率 死亡情况 活虾情况 12.5 0.32 0.06 部分掉脚和触角 正常 15 100 无明显现象 正常 17.5 100 无明显现象 正常 20 100 无明显现象 正常 22.5 100 无明显现象 正常 7 25 100 无明显现象 正常 27.5 100 无明显现象 正常 30 100 无明显现象 正常 32.5 0.45 0.09 身体乳白鳃橘黄 正常 图 3-1 不同温度下 日本沼虾 的成活率与时刻的变化 Figure 3-1 the su
30、rvival rate of freshwater shrimp under different temperature changes with time 成活率00.20.40.60.811.20 5 10 15 20 25 30 35温度成活率成活率成活率三个成活率 平行组的平均数。从表 3-3 和图 3-1 可见，在 15一 30的 日本沼虾全活 ， 12.5 日本沼虾的成活率为 0.32 0.06，在 这温度条件下 日本沼虾 脚和触角较脆，很容易部分掉脚和触角 ， 32.5 日本沼虾成活率为 0.45 0.09，在 这温度条件下 日本沼虾 死亡身体乳白 且 鳃橘黄，成活的 日本沼虾
31、基本不动 。 所以 日本沼虾 温度最好保持在 15一 30之间。 3.2 渐变温度对 日本沼虾 耗氧率的影响 3.2.1 日本沼虾 在 22.5， 25， 27.5的耗氧率 表 3-4 24 小时中 日本沼虾 在 22.5， 25 ,27.5的耗氧率 Table 3-4 in the freshwater shrimp at 24 hours 22.5 , 25 , 27.5 in oxygen consumption rate 时间 /耗氧率 22.5 25 27.5 0:00 0.069 0.001 0.125 0.001 0.179 0.017 2:00 0.072 0.001 0.13
32、9 0.001 0.206 0.004 4:00 0.1 0.008 0.161 0.002 0.307 0.006 6:00 0.17 0.005 0.282 0.009 0.445 0.005 8:00 0.084 0.002 0.149 0.005 0.272 0.004 10:00 0.07 0.001 0.116 0.004 0.176 0.004 12:00 0.102 0.010 0.177 0.002 0.297 0.007 14:00 0.193 0.001 0.304 0.007 0.687 0.002 16:00 0.109 0.006 0.229 0.010 0.304
33、 0.009 18:00 0.171 0.001 0.281 0.003 0.427 0.003 8 20:00 0.126 0.003 0.181 0.002 0.245 0.002 22:00 0.114 0.001 0.167 0.008 0.241 0.008 注：实验虾为 4 尾，耗氧率 1为 24 小时中青虾在 22.5渐变温度境况下得到的结果，实验虾总重为 6.9818 克，耗氧率 2 为青虾在 24 小时中 25渐变温度境况下得到的结果，实验虾总重为 5.1178 克。耗氧率 3 为青虾 在 27.5渐变温度境况下得到的结果，实验虾总重为 6.9140克。 水温是由 27.5开
34、始渐变的。 00.10.20.30.40.50.60.70.80:00 4:48 9:36 14:24 19:12 0:00时间耗氧率22.52527.5图 3-2 为 日本沼虾 在 22.5， 25， 27.5的耗氧率与时刻的变化 Figure 3-2 for the freshwater shrimp in at 22.5 , 25 , 27.5 in oxygen consumption rate and the change time 从表 3-4和图 3-2可见在温度不同其它实验条件相同的条件下，通过 spss 上单因素放差分析， 日本沼虾 在 22.5， 25， 27.5的耗氧率有
35、显著差异。 在水温渐变到 22.5， 25，27.5后，在相同时间点水温高， 日本沼虾 的耗氧率大。 日本沼虾 的耗氧率 下降到波谷为 0:00、10:00、 16:00达到波峰的是 6:00、 14:00、 18:00。 日本沼虾 的耗氧率曲线从 22.5到 25再到 27.5逐渐递增。在 22.5 、 25 、 27.5 日本沼虾 的平均耗氧率分别为 0.115mg (g h)、0.193mg (g h)、 0.316mg (g h)， 在水温渐变到 22.5 、 25 、 27.5后，在相同时间点水温高 ， 日本沼虾 的耗氧率大。 在 22.5 、 25 、 27.5 日本沼虾 白天的平
36、均 耗氧率 为0.122mg (g h)、 0.209mg (g h)、 0.361mg (g h)。在 22.5 、 25 、 27.5 日本沼虾晚上的平均 耗氧率 为 0.109mg (g h)、 0.176mg (g h)、 0.271mg (g h).日本沼虾 白天的平均 耗氧率 稍大于 晚上的平均 耗氧 。 22.5的时候 耗氧率 变化最小 ， 耗氧率 曲线基本相同，耗氧率 变化不大。 3.3不同温度渐变下青虾的响应特征 3.3.1日本沼虾 鳃中 CAT 活力 表 3-5 不同水温 渐变下 CAT 的活性 U/mgprot Table 3-5 in the Temperature gradient under different activity of CAT U / mgprot cat 时间 22.5 25 27.5 12 4.060 0.490 9.210 0.140 11.454 2.941
