1、 本科毕业论文 （ 20 届） 产蛋白酶 的海洋 放线菌 的初步研 究 所在学院 专业班级 生物科学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 目录 - I - 目录 摘要 .I Abstract . II 引言 . 1 1 材料与方法 . 4 1.1 实验材料 . 4 1.1.1 培养基与试剂 . 4 1.1.2 仪器与设备 . 5 1.2 实验方法 . 5 1.2.1 菌株的分离纯化 . 5 1.2.2 菌株的筛选 . 6 1.2.3 产胞外蛋白酶放线菌株的酶活测定 . 6 2 实验结果与分析 . 9 2.1 分离纯化结果 . 9 2.2 筛选结果 . 10 2.3 酶活测定结果
2、. 12 2.3.1 酪氨酸标准曲线的绘制 . 12 2.3.2 酶活的计算结果 . 13 3 讨论 . 15 3.1 斜面保存法 . 15 3.2 菌种筛选方案 . 15 3.3 缓冲溶液的 pH 选择 . 15 3.4 蛋白酶活力测定 . 15 3.5 本研究的目的意义 . 15 4 小结 . 15 参考文献 . 19 致谢 . 错误 !未定义书签。中文摘要 I 摘要 摘要 本文以从舟山海域潮间带海泥，海水中提取的海洋放线菌为研究对象，利用平板透明圈法分离出其中具有蛋白酶活性的放线菌，并观察目的菌株的菌丝和检测目的菌株的酶活力情况。蛋白酶是一类很重要的水解酶类，是一类常用的工业和研究用酶。
3、蛋白酶参与蛋白质的水解、消化、血液凝固与血栓溶 解、血管形成、炎症、受精以及细胞生长和维持细胞的形态等。自 1945 年瑞士 Dr.Jaag 等发现微生物碱性蛋白酶以来，由于其广泛的用途，已成为当前国内外研究的热点。微生物是蛋白酶最重要的来源，所产的蛋白酶较动物、植物来源的蛋白酶易于分离、纯化。放线菌是微生物的一种，主要从泥土、泉水、土地、土壤及海水附近等环境中分离得到，具有独特的基因类型、特殊的生理机制及特殊的代谢产物。研究结果表明：舟山海域潮间带海泥中，一共提取到了 63 种菌株，其中 8株在酪素筛选平板上都产生明显的蛋白水解透明圈，对其中 2株具有较大酶活力的菌株 ，采取以酪蛋白为底物的
4、紫外分光光度法进行酶活测定。 对于进一步发挥 蛋白酶的经济效益，寻找和开发放线菌资源无疑是 极其必要 的。 关键词 蛋白酶；分离纯化；透明圈；酶活力 英文摘要 II Abstract Preliminary research of the marine actinomycetes with protease activity abstract This paper use the marine actinomycetes which extracted from the mud of Zhoushan ocean and seawater for study, the experiment u
5、se flat transparent ring method to isolate the actinomycetes which have protease activity , and observe the mycelium of the purpose of strain, and test the enzyme activity of the purpose of strain . Protease is a very important kind of hydrolysis enzymes,commonly industrial and research enzyme. Prot
6、ease involves in protein hydrolysis, digestion, blood clots, thrombolytic, angiogenesis, inflammation, fertilization and cell growth and maintains cell morphology, etc. Since 1945,when the Swiss Dr.Jaag etc found microbial alkaline protease, protease because of its wide range of uses, has become the
7、 hot spot of current domestic and international research. Microbes are the most important source of protease. protease ,which are from animals, plants ,are easy to separate, purify. Actinomycetes which is a kind of microorganisms, are mainly isolated from soil, water, land and soil environment, have
8、 unique gene types, special physiological mechanism and special metabolites. The results show that: In the inter-tidal mud of Zhoushan ocean, there are totally 63 species strains we have obtained. The 8 of which have the clear zone which are hydrolyzed by the protease. UV spectrophotometry with the
9、casein as for substrate tests the enzyme activity of 2 strains which have a greater clear zone. To further get the economic benefits of protease, it is no double and very necessary to seek and develop the resource of actinomycetes. KeywordsProtease;isolation and purification;Clear zone;Enzyme activi
10、ty 引言 1 引言 蛋白酶广泛存在于微生物中。自 1945 年瑞士 Dr.Jaag 等发现微生物蛋白酶以来，其在烘烤、蛋白质加工和饲料的生产中得到了广泛的应用，由于其能够显著提高食品的风味、稳定性、可溶性以及改善食品营养价值，该酶成为当前国内外食品行业研究的热点。虽然人们对蛋白酶的研究和利用已有多年的历史，但国产蛋白酶仍存在品种单一、酶活力不高、价格昂贵等问题，加上各国都十分注重对已有的重要微生物资源的保护，使得优质产酶菌株的 筛选和选育有着十分重要的应用价值。 许多微生物具有产生胞外蛋白酶的能力，所以可以将发酵液离心之后直接测定，而无需利用盐析法沉淀蛋白质。微生物是蛋白酶最重要的来源，所产
11、的蛋白酶较动物、植物来源的蛋白酶易于分离、纯化高温微生物是极端微生物的一种，主要从堆肥、热泉、火山地、地热区土壤及海底火山附近等高温环境中分离得到，与生命起源、系统进化关系密切 ,具有独特的基因类型、特殊的生理机制及特殊的代谢产物 1，为地球上的边缘生命现象。蛋白酶参与蛋白质的水解、消化、血液凝固与血栓溶解、血管形成、炎症、受精以及细胞生长和维 持细胞的形态等 2。 对于进一步发挥其经济效益，寻找和开发放线菌资源无疑是很重要的。 漯河医学高等专科学校食品工程系的李超敏等人 3采用选择培养基筛选得到了一株蛋白酶高产菌株 A-19，其能够在脱脂牛乳培养基上形成清晰可见的水解圈。根据该菌的生理生化特
12、征以及其 16SrDNA 序列同源性分析，可以确定筛选得到的A-19 菌株为芽胞杆菌，为下一步的蛋白酶基因的克隆、表达及分子改造奠定了基础。其从郑州奶牛场土壤样品中分离到一株芽孢杆菌，命名为 A-19 菌株。该菌株有较高的蛋白酶活性， 37、 pH7.0 培养 48h 后，其蛋 白酶活力可达 63.5U/mL。菌体生长专性需氧，有运动性，粗糙型菌落，氧化酶试验阳性， DNA(G+C)的摩尔分数为 47%。通过其生理生化特征和 16S rDNA 序列相似性的系统发育分析，确定A-19 菌株属于芽孢杆菌属。该菌的 16S rDNA 序列已被 GenBank 收录，序列登陆号为 EU561347。
13、淮海工学院海洋学院刘朝谊等 4从连云港黄海海域的鱼类、贝类和海水等样品中分离到近 150 株产碱性蛋白酶的低温菌。并通过正交试验确定菌株的最佳培养基为干酪素平板培养基，水解酪蛋白试验可对菌株的产酶情况进行定性研究，酶活较高的菌株都能产生较大的水解圈。干酪素分离培养基配合水解酪蛋白试验，可以提高产碱性蛋白酶菌株筛选效率。对其中 3 株产酶活性较高的菌株 (ASG，YSG， ZG)进行了耐盐性试验和培养温度试验，菌株 ASG， YSG 的最适生长温度、时间以及培养基的最适 NaCl 的质量分数分别为： 15， 36h， 5%； 20， 30h，3%。其研究了从海洋鱼和贝类中筛选产碱性蛋白酶海洋适冷
14、菌菌株的方法。结果表明从海鱼、海贝等样品中能得到产低温碱性蛋白酶的菌株，干酪素分离培养基是较好的筛选培养基，产酶菌株都能在干酪素培养基上产生透明圈，水解 酪蛋白引言 2 试验可对菌株的产酶情况进行定性研究，酶活较高的菌株都能产生较大的水解圈。干酪素分离培养基配合水解酪蛋白试验进行产低温碱性蛋白酶的菌株的筛选，可以提高筛选效率。但经过复筛后得到的细菌并不一定为海洋菌。 ASG 和 YSG 的最适生长温度、时间分别为 15， 36h 和 20， 30h。 ASG 耐盐质量分数范围为0.5%15%，盐质量分数为 5%时最适生长； YSG 耐盐浓度范围为 1%6%，盐质量分数为 3%时最适生长。 AS
15、G， YSG 为典型的海洋细菌，而 ZG 不是海洋细菌。所以通过耐盐性和培养温度实验，可以较快捷的从海洋中筛选 产低温碱性蛋白酶海洋细菌。经微生物自动分析仪测定， ASG 为食酸丛毛单胞菌 (Comamonas acidovorans)， YSG 为栖稻黄色单胞菌 (Flavimonas oryzihabitans)。 德州学院生物系许褆森 5等人探索产蛋白酶菌对鲈鱼肠道菌群的影响。利用酪蛋白培养基和脱脂乳培养基，从健康鲈鱼肠道中筛选产蛋白酶的益生菌，并利用福林 -酚试剂法测定其酶活力。从健康鲈鱼肠道中共筛选出 18 株产蛋白酶的益生菌，占健康鲈鱼肠道菌群的 17.7%。 18 株菌均具有产蛋
16、白酶酶活力，其中 SC14、SE1、 SF7 和 SG22 株产酶活力特别强，相对酶活力分别为 2.285、 3.618、 2.190、4.474U/mL。为今后制成益生菌制品应用于水产养殖，提高养殖动物的存活率和生长速度提供了理论基础。 广东省食品质量监督检验站的欧英杰 6等人通过测定嫩肉粉中木瓜蛋白酶的酶活力大小，为判断嫩肉粉质量优劣提供参考依据。把嫩肉粉溶于盐酸半胱氨酸溶液，取该混合液与酪蛋白溶液反应 10min，用紫外分光光度法测得反应所生成酪氨酸的含量。该方法具有较好的准确性和重现性，添加标准回收率为96.8%105.8%，且步骤简明，所需测试仪器简单。他 们在该方法条件下，每分钟水
17、解酪蛋白生成 1ug 酪氨酸所需样品的量为 1 个酶活力单位。此种酶活力表述方式亦为国内关于各种酶活力的表述所常用，便于酶活力数据的比较与换算。他们通过测定，发现市售各种嫩肉粉中木瓜蛋白酶的酶活力参差不齐，则嫩肉粉对肉类的嫩化能力强弱亦有差别，体现在使用添加量的多少和对肉类浸泡时间的长短上。也有发现酶活力单位为零的，说明该产品中的木瓜蛋白酶已失去活力，或者根本没有添加木瓜蛋白酶，属于伪劣商品。利用紫外分光光度法能准确地测定嫩肉粉中木瓜蛋白酶的活力，该法样品处理简便，所需仪器简单，步骤简明， 能快速、直观地测出嫩肉粉中木瓜蛋白酶分解肉类蛋白能力的强弱，为判断嫩肉粉产品质量优劣提供重要参考。木瓜蛋
18、白酶（ PapainEC3.4.22.2）属于巯基蛋白酶，可水解蛋白质和多肽中精氨酸和赖氨酸的羧基端，并能优先水解在肽链的 N 端具有2 个羧基的氨基酸或芳香 L 氨基酸（如酪氨酸）的肽键。其最适作用 pH为 5.07.0，在中性或偏碱性时亦有作用，耐热性强 7。目前市场上嫩肉粉的成分主要是木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶通过分解胶原蛋白、弹性蛋白，降解胶原纤维和结缔组织蛋白成为小分子的多肽甚至氨基酸，令肌肉肌丝和腰筋丝断裂， 因此嫩肉粉能使老牛肉、猪肚、腊肉等较坚韧肉类迅速嫩化，有利消化并提高营养价值，并可节省烹调时间与能源，适合饭店、宾馆及家庭使用 8。 引言 3 西北农林科技大学植保学院与陕西省农
19、业分子生物学重点实验室的刘双 9等人研究从秸秆中分离得到一株弹性蛋白酶高产菌，并对该菌株进行鉴定，以期为实现其工业化生产提供理论依据。采用酪蛋白 (脱脂奶粉 )进行初筛后，以弹性蛋白(牛筋 )进行复筛，并对筛选结果进行检验，然后对所得菌株结合形态、生理生化特性和 16S rRNA 基因序列进行分类鉴定，得到一株弹性蛋白酶高产菌株 LSF-97。结果显 示，菌株 LSF-97 与短小芽孢杆菌同源率达到 100%，形态及生理生化特征与模式菌也显示高度一致性，故将其确定为短小芽孢杆菌。弹性蛋白酶 (Elastase)是一种以水解不溶性弹性蛋白为特征的广谱性蛋白水解酶。自从 1949 年被 Banga
20、发现以来 10，各国科学家对其的研究便表现得十分活跃，从最初的酶源和纯化研究到现今的分子遗传机理的探索，研究水平越来越深入，很大程度上拓宽了其应用领域。目前，弹性蛋白酶在医药、食品、农业、轻工业、服装加工、环保和生物技术等领域被广泛运用 11-15，并具有极大的开发潜力和商业 价值。在我国，弹性蛋白酶的生产还主要是从猪胰脏中提取，受到脏器资源不足、提取工艺复杂等因素的限制，不利于酶制剂的可持续性发展，而国外通过微生物发酵生产已取得了巨大的经济效益 16。另外，微生物生产弹性蛋白酶技术的开发还存在产物活性不高、性质差异大、基因工程菌不稳定等问题的制约，而筛选出弹性蛋白酶的高产菌株是解决诸多问题的
21、关键所在。从自然中直接去筛选稳定高产菌株无疑是最为直接和行之有效的方法。 在蛋白酶活力的测定方面 17，主要利用紫外可见分光光度法测定单位时间内底物的消耗或产物的生成。酶与底物在特定的条 件下反应，酶可以促使底物释放出还原性的集团，在此反应体系中添加化学试剂，酶促反应的产物可以与该试剂发生化学反应生成有色物质。通过在特定的波长下比色即可求出还原产物的含量，从而计算出酶活力的大小。或者不用化学试剂与产物发生反应生成有色物质，而是直接利用产物在特定波长下的特征光吸收，通过测定光吸收值的大小来求得产物的量，从而计算酶活性的大小 18。而采用不同底物衍生的测定方法也不同，所取得的数值也不能进行直接比较
22、。传统的作法，蛋白酶是用明胶或血红蛋白作底物来测定的。由于要求底物具有较高的专一性和便于标准化，新 的测定方法往往采用合成的 N-苯甲酰 -L-精氨酸乙酯 (BAEE)19。但以 BAEE 为底物的测定方法所涉及到的仪器设备昂贵，成本偏高 20。故采用以酪蛋白为底物的紫外光谱法来测定蛋白酶的活力，该法所需测试仪器简单，步骤简明，容易掌握；并且该法也常被国内用来测定各种酶的活力，所得的数据便于比较。 材料与方法 4 1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 培养基与试剂 1）高氏 I 号培养基：可溶性淀粉 20g， KNO3 1g;， NaCl 0.5g;， K2HPO4 0.5g;， Mg
23、SO47H2O 0.5g， FeSO47H2O 0.01g，琼脂 20g，海水 1000mL， pH 7.27.4， 121灭菌 20min。 2）酪蛋白培养基 21,22： 酪蛋白 10.0g， 牛肉 膏 3.0g， 氯化钠 5.0g， 磷酸氢二钾 2.0g，琼脂 15.0g， pH 值 7.27.4， 加热溶解于 1000mL 海水 中 ,121 高压灭菌 20min， 备用。 3）放线菌发酵培养基：黄豆粉 10g，玉米粉 10g，可溶性淀粉 5g， KH2PO41g，陈海水 1000mL；调节 pH7.27.4，用 250mL 三角瓶分装，每瓶 50mL， 培养基分装完毕后，在三角烧瓶
24、口上用八层纱布进行包裹，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染。 121灭菌， 20min。 4)考马斯亮蓝 G 250 蛋白质染色液 23：称取 100mg 考马斯亮蓝 G-250，溶于 50mL 95%乙醇中，加入 85%磷酸 100mL，混匀后即为母液。用时，按 150mL 母液加 850mL蒸馏水的比例稀释，混匀后过滤即为稀释液。此溶液在常温下可放置一个月。 5） 1000ug/mL 的酪氨酸溶液 24：将酪氨酸放于 100105的干燥箱中烘干 3h，冷却后，称取 0.1g 溶于 10mL 5mol/L 的盐酸中，再用 0.1mol/L的盐酸稀释 100mL，放置于冰箱中保存。 6）酪
25、氨酸应用液： 100ug/mL，即酪氨酸应用时应将 1000ug/mL 的酪氨酸溶液稀释10 倍使用。 7） 10%的三氯乙酸：将 10g 三氯乙酸溶于 100mL 水中。 8） 0.5%酪蛋白溶液：称取 0.5g 酪蛋白放于一个 150mL 的小烧杯中，加入大约 2mL 0.5mol/L 的氢氧化钠，搅拌使其溶解，然后用 0.2mol/L 的磷酸盐缓冲液（ pH7.5）稀释到 100mL。 9） 0.2mol/L 的磷酸氢二钠溶液：将 3.56g Na2HPO42H2O 溶于 100mL 水中。 10） 0.2mol/L 的磷酸二氢钠溶液： 3.121g NaH2PO42H2O 溶于 100
26、mL 水中。 11） 0.2mol/L 的磷酸盐缓冲液（ pH7.5）：把 84mL 0.2mol/L 的磷酸氢二钠和 16mL 0.2mol/L 的磷酸二氢钠溶液混合即得。 12） pH 试纸 13） 5%的 NaOH 溶液：称取 5g 氢氧化钠溶于 100mL 水中。 14） 100mg/kg 重铬酸钾溶液：称取 10mg 溶于 100g 水中。每 300mL 培养基中加 3重铬酸钾 1mL(100mg/kg)。 15）人工海水 材料与方法 5 1.1.2 仪器与设备 旋涡混合器 型号： QL-866 低速离心机 型号： LD5-2A，北京医用离心机厂 干燥箱 型号： ph070A，上海恒
27、科学仪器有限公司 电冰箱 型号：海尔 BCD-257，青岛海尔股份有限公司 752 紫外分光光度计 ，上海舜宇恒平科学仪器有限公司 马头牌架盘药物天平 型号： BP-II，上海医用激光仪器厂 隔水式恒温培养箱 型号： GNP-9160，上海精宏设备有限公司 电子天平 型号： BS124S 型，塞多利斯科学仪器 (北京 )有限公司 洁净工作台 型号： SB-JC-IA，上海博迅实业有限公司医疗设备厂 电热恒温水浴锅 型号： HHS，上海博迅实业有 限公司医疗设备厂 恒温摇床 型号： ZHWY-2012 型，上海智城分析仪器制造有限公司 数码生物显微镜 型号： Lei ca DMIL，上海博迅实业
28、有限公司医疗设备厂 压力蒸汽灭菌锅 型号： YXQ-LS-50A，全立式自动立式电热，上海云泰仪器仪表有限公司 立式压力蒸汽灭菌器 型号： YXQ-LS-30S，上海博迅实业有限公司医疗设备厂 此外还需 电炉 ， 塑料瓶 ， 玻璃弹珠 ， 移液枪 ， 培养皿 ， 玻璃棒 ， 铁杯 等。 1.2 实验方法 1.2.1 菌株的分离纯化 分别从舟山的鸭蛋山码头，三江码头，海滨公园等地区潮间带用 取样铲，将表层 5cm 左右的浮 土除去，取 5 25cm处的土样 10 25g，装入事先准备好的 灭过菌的 塑料 瓶，同时将 水样装于灭过菌的塑料瓶中，尽快处理样品。并将药勺，装有玻璃弹珠和 95mL 海水
29、的 250mL 的三角锥形瓶，以及将装有 9mL 海水的有封口的试管，进行高压灭菌。 1.2.1.1 海泥样品稀释液的制备 用无菌药勺准确称取 5g 海泥样本于 95mL 无菌海水中 并放有小玻璃珠的250mL 三角 锥形瓶 中 25， 用手或置摇床上振荡 20min，使 海泥 分散， 剧烈振荡制成均匀的混悬液， 静置 20S 30S。 然后吸取 1mL 于 9mL 无菌海水中进行稀释，即成 10-1 稀释液 ； 吸取 10-2 稀释液 1mL，移入装有 9mL 无菌 海 水的试管中，即成10-3 稀释液；以此类推，连续稀释， 最后稀释到 10-2， 10-3， 10-4 等一系列稀释菌液。
30、1.2.1.2 海水 样品稀释液的制备 从样品瓶中吸取 1mL的样品于 9mL 的无菌海水中进行稀释， 即成 10-1稀释液 。在制备 10-2 稀释液 之前，先置于旋转混合仪器上旋转 5min，使 海水内含物充分 分散， 剧烈振荡制成均匀的混悬液， 静置 20S 30S。 吸取 10-1 稀释液 lmL， 移入装有 9mL 无菌 海 水的试管中，吹吸 3 次，让菌液混合均匀，即成 10-2 稀释液 ； 吸取材料与方法 6 10-2 稀释液 1mL，移入装有 9mL 无菌 海 水的试管中，即成 10-3 稀释液； 最后稀释到 10 2， 10-3， 10-4 等一系列稀释菌液。 1.2.1.3
31、 分离培养 样品处理后用 平板涂布培养法 26， 高氏 I 号海水培养基进行分离培养。 待凝固后编号，然后吸取 0.1mL 菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上 (每个编号设三个重复 )，即 每个稀释度做 3 个重复平板， 再用无菌 玻璃涂棒 将菌液在平板上涂布均匀，将涂布好的平板平放于桌上 20min30min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒 置 ， 25-30培养 3-5d 以后应注意观察平板中菌落的生长情况，避免生成菌苔影响细菌的分离 。 3-5d 后观察平板中的菌落，对不同颜色、形状和大小的菌落进行划线分离。划线完毕后，盖上培养皿盖，倒置于 25-30培养 48h，然后挑取单个
32、菌落，继续重复划线，重复上述步骤 3-5 次，基本可以得到较纯菌株，然后接种到试管斜面中，于 4冰箱冷藏保种备用。 1.2.1.4 菌株保存 将菌种转接在 高氏 I 号海水培养基 斜面培养基上 27，将其保存于 25-30培养箱中，待其充分生长后，用封口膜将棉塞部分 包扎好，置 4冰箱中保藏。斜面法保藏菌种的时间依微生物的种类不同而异。放线菌保存 3-5 个月移种一次。 1.2.2 菌株的筛选 1.2.2.1 产蛋白酶菌株的初筛（透明圈法） 将上述斜面法保藏的菌株先在高氏 I 号培养基上进行活化。 先将 经过 121灭菌 20min 的酪蛋白 培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，待凝固后编号， 将
33、 40 种放线菌分离纯化培养并增殖后，点种培养于酪蛋白琼脂平板培养基 28， 将其倒置培养于 25-30 培养箱中。 3-5d 后，等菌落长出来时，用考马斯亮蓝 G-250 染液在菌落周围 进行染色，经过反复筛选，选择菌落周围形成透明圈的菌种，初步定义为产蛋白酶的放线菌。 1.2.2.2 观察菌株菌丝 插片法 将 初步定义为产蛋白酶的 放线菌接种在 冷却至约 50 的高氏 I 号琼脂培养基倒平板 (每皿约 15mL)的 琼脂平板上，插上灭菌盖玻片后培养， 25-30正放 培养，使放线菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻 片 上。置于载玻片上直接镜检 ， 观察 3d， 5d， 7d 不同生长期 放线菌菌丝 形态。 1.2.2.3 产蛋白酶菌株的复筛（发酵产酶） 将初筛得到的 2 株 A7、 A28 能在酪蛋白培养基上产生较明显的透明圈的放线菌株 进行复筛发酵产酶，以用来测定酶活。 在三角烧瓶内进行点种，点好之后，将其进行 25-30 摇床 120r/min 发酵 3-5d。 1.2.3 产胞外蛋白酶放线菌株的酶活测定 1.2.3.1 酶液的制备
