1、 本科毕业论文 （ 20 届） 产淀粉酶的海洋真菌的筛选与初步研究 所在学院 专业班级 生物科学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 目录 摘要 .I Abstract . II 引言 . 1 1 材料与方法 . 4 1.1 材料 . 4 1.1.1 设备与仪器 . 4 1.1.2 药品与试剂 . 5 1.2 实验方法 . 5 1.2.1 制备培养基 . 5 1.2.2 采样 . 6 1.2.3 样品的处理 . 6 1.2.4 菌株的纯化与筛选 . 6 1.2.5 形态观察 . 7 1.2.6 摇床培养 . 8 1.2.7 酶活力的测定 . 8 2 结果与分析 . 10 2.1
2、淀粉水解试验后的结果 . 10 2.2 菌株菌落的观察结果 . 11 2.3 菌株的显微观察结果 . 13 2.4 菌株的酶活力的测定结果 . 16 3 讨论 . 17 3.1 实验结果的讨论 . 17 3.2 菌株纯化时划线的次数 . 17 3.3 保种的方法 . 17 3.4 酶活力的测定方法 . 18 小结 . 19 参考文献 . 20 致谢 .错误 !未定义书签。 I 摘要 摘要 本文以从舟山海域潮间带海泥中筛选的海洋真菌为研究对象，主要目的是筛选出可以产淀粉酶的真菌，淀粉酶是能催化淀粉水解转化成葡萄糖、麦芽糖及其它低聚糖的一群酶的总称，它广泛存在于动植物和微生物中。在食品与化工工业上
3、，利用淀粉的目的主要是想获得其水解产物 ,而这需要淀粉酶的参与。所以对于产淀粉酶的微生物的筛选对于我们以后利用淀粉酶具有重大的意义。本实验主要采用平板分离法及淀粉水解试验筛选出其中具有产淀粉酶能力的真菌，对其菌落进行观察并且通过显微镜对其进行形态观察，然后进行淀粉酶的活力测 定，以方便以后的深入研究。 研究结果表明：在本实验中，共纯化得到 40 株菌株，在淀粉酶筛选培养基上，经过卢氏碘液染色后有 6株菌株的菌苔周围出现比较明显的无色透明圈，说明培养基中的淀粉已被水解，为阳性。所以具有产淀粉能力的菌株有 6株，就其菌落形态以及显微镜下的形态观察表明这六株菌株不是同一种，然后对这 6株菌株进行酶活
4、力的测定，其结果表明，这六株菌株的酶活力均在 85U/mL以上。 关键词 海洋真菌；筛选；淀粉酶；酶活力 II Abstract Abstract In this paper,from the intertidal mud in Zhoushan sea area in the screening study of marine fungi,The main purpose is to filter out the fungus can produce amylase,Amylase is that catalyze the hydrolysis of starch into glucose,
5、 maltose and other oligosaccharides general term for a group of enzymes,Is widely found in animals, plants and microorganisms.In food and chemical industry,the main purpose of the use of starch is to obtain its hydrolysis product,this requires the participation of amylase.So for the microbial produc
6、tion of amylase for our future use of the screening of amylase is of great significance.This experiment by plate separation and hydrolysis of starch which has been selected for ability to produce fungal amylase,Observation of its colonies and the morphology observed by microscopy,Then amylase determ
7、ination to facilitate future in-depth study. The results show that:In this experiment, 40 strains were purified ,Medium in the screening of amylase,after Romers iodine staining around 6 strains of bacteria moss appeared more obvious the colorless and transparent circle,That the medium has been hydro
8、lyzed starch, were positive.Therefore, starch production capacity of strains with 6 strains,On their colony morphology and microscopic morphology of the six strains that are not the same one,Then these six strains were the determination of enzyme activity,The results showed that the enzyme activity
9、of 6 strains were 85U/ml above. Key words marine fungi; screening; amylase; enzyme activity 1 引言 在粮食作物中，含量最高的营养成分是淀粉，它除了可以直 接作为食物外，还可以对淀粉进行深加工，生产葡萄糖、果糖、低聚糖等，以淀粉质原料及其水解产物为基质经过发酵可以生产乙醇、啤酒、味精、有机酸等食品与化工产品，淀粉酶是能催化淀粉水解转化成葡萄糖、麦芽糖及其它低聚糖的一群酶的总称，它广泛存在于动植物和微生物中。淀粉作为农业第一大产品，其原料深加工是粮食与食品加工中的重要组成部分。淀粉是发酵工业的主要原料，通
10、过发酵可以生产出众多产品，如乙醇、甘油、有机酸、基酸、酶等，也可以生产高附加值的生物制剂和药品。通过对淀粉的生化处理可以提高淀粉产品的附加值，这些都需要淀粉酶的 参与。淀粉酶是最早用于工业化生产并且迄今仍是用途广、产量最大的酶制剂产品之一。广泛应用于造纸、食品和医药工业中，如饴糖、啤酒、黄酒、葡萄糖、味精、抗生素等行业；用于对高质量的丝绸、人造棉和化学纤维的退浆；可制成不同品种的工业酶、医用酶和诊断酶等。在洗涤剂工业中，淀粉酶与碱性蛋白酶、脂肪酶一起添加于洗衣粉中制成多酶洗衣粉等，具有极广泛的用途 1。 海洋约占地球表面的 71%，其中蕴藏着丰富的微生物资源海洋环境的特殊复杂性使海洋微生物为了
11、适应生存而产生不同结构和功能的天然活性物质 2。 浙江舟山海域广阔，海洋 资源也丰富多样，而海洋微生物资源更是丰富，目前海洋微生物资源的利用越来越广泛，人们越来越意识到海洋微生物的重要性，所以对于海洋微生物的研究也越来越多。随着工业的发展，具有新活性性质来源不同的淀粉酶亟待开发，因此研究工作者们对耐酸性淀粉酶 3、耐碱性淀粉酶、耐高温淀粉酶、支链淀粉酶4、产物新型淀粉酶 5等进行了研究。此外，由于深海微生物采样、分离培养的困难等多种因素的影响，国内外对深海微生物的研究还处于起步阶段，对海洋产淀粉酶研究较少 6-7。 酶是由生物体产生的的，现在有实用价值的酶一般来自动物、 植物和微生物，工业上的
12、酶大多来自微生物产生的酶，酶类中重要一种淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的统称，按水解淀粉方式不同，把淀粉酶分为 -淀粉酶、 -淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和异淀粉酶。淀粉酶广泛存在于微生物、植物和动物体中，目前已广泛应用于食品、发酵、畜牧业生产、谷物加工、纺织、造纸、轻化工业、医药和临床分析等领域 8-10。 2 在食品与化工工业上，利用淀粉的目的主要是想获得其水解产物，而这需要淀粉酶的参与。淀粉是由葡萄糖通过 1， 4糖苷键构成的直链淀粉和 1， 6 位有分支的支链淀粉组成的。不同种类的淀粉酶水解 淀粉会生成不同的酶解产物。 依作用机理分为三种主要的淀粉酶： 淀粉酶从淀粉分子内部水解 1， 4 糖苷键
13、,而对淀粉分子的 1， 6 糖苷键不能水解，但它可跨越 1， 6 糖苷键 ,对分子内的 1， 4 糖苷键起作用 ,且水解1， 4 糖苷键的先后次序是无规律的。淀粉酶水解直链淀粉的最终产物是麦芽糖与葡萄糖 ,而其水解支链淀粉的最终产物是麦芽糖、葡萄糖和异麦芽糖。淀粉酶作用于淀粉内部切开 1,4 糖苷键，而生成糊精和还原糖，产物的末端残基碳原子构型为构型，故称淀粉酶。它是一种重要的酶制剂，广泛应用 食品工业、饲料工业、发酵工业及纺织工业等等。目前淀粉酶的生产主要利用微生物发酵。淀粉酶产生菌主要有细菌（如枯草杆菌、地衣芽孢杆菌等等）和真菌（如黑曲霉、米曲霉和根霉等等）。国内外目前主要利用细菌发酵生产
14、淀粉酶。真菌淀粉酶可以改善面团的发酵特性和面包的贮藏特性，被开发为一种重要面包品质改良剂，因此开发安全、高活性、优特性的真菌淀粉酶成为研究热点 11。 淀粉酶从淀粉分子的非还原性末端开始，水解相间隔的 1， 4 糖苷键 ,依次切下一个麦芽糖分子。淀粉酶也只能水解 1， 4 糖苷 键 ,而不能水解 1， 6 糖苷键 ,且不能跨越 1， 6 糖苷键 ,遇此键水解作用就停止。淀粉酶水解直链淀粉时 ,使直链淀粉分子逐渐缩短 ,麦芽糖生成速度较慢。而其水解支链淀粉时，因支链淀粉分支较多，非还原性末端较多，故麦芽糖生成速度较水解直链淀粉时快得多。但因 -淀粉酶对 1， 6 糖苷键既不能水解，也不能跨越，所
15、以它只能对分支点以外的部分起作用，产生相当于支链淀粉总量的 50% 60%的麦芽糖，而对分支点以内的部分不能水解，此剩余部分称为极限糊精。 葡萄糖淀粉酶从淀粉分子的非还原性末端开始，逐次切下一个个葡 萄糖。它不仅能水解 -1， 4 糖苷键，而且能水解 -1， 6 糖苷键和 -1， 3 糖苷键，只是水解后两者的速度较前者要慢得多，因此，葡萄糖淀粉酶作用于直链淀粉和支链淀粉时，能将它们全部水解为葡萄糖。 淀粉酶是重要的酶制剂，具有巨大的应用价值。随着世界能源危机，节能环保的新型工业化发展道路成为全球工业发展的必然趋势。 3 在淀粉酶产生菌的初筛实验中，以菌落周围形成水解圈直径的大小作为淀粉酶活力的
16、初步判定的依据，水解圈大的，淀粉酶的活力就大。酶活力的测定方法有很多，最常见的方法有 5 种： Bernfeld 法、临床检验、 Fuwa 改良发法、部颁标准法、 Yoo 改良法。 在本实验中，采用的方法是 Yoo 改良法，根据史永旭 12等通过对五种方法操作步骤、误差、测定范围等比较， Yoo 改良法为实验室测定淀粉酶活力的最佳方法。 4 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 设备与仪器 培养皿 ： 中国医药（集团）上海化学试剂公司 玻璃棒 ： 江苏省泰兴市振科仪器厂 试管 ： 国药集团化学试剂有限公司 离心管：容量 5mL 锥形瓶：容量 150mL， 200mL， 250mL，中国医药
17、（集团）上海化学试剂公司 烧杯：容量 100mL， 500mL， 1000mL，国药集团化学试 剂有限公司 量筒：容量 50mL， 100mL，中国医药（集团）上海化学试剂公司 移液枪：型号，容量 1000uL 枪头：容量 1000uL 旋涡混合器： QL-866 洁净工作台：型号 SB-JC-IA，上海博迅实业有限公司医疗设备厂 低速离心机：型号 LD5-2A，北京医用离心机厂 干燥箱：型号 ph070A，上海恒科学仪器有限公司 电冰箱：型号海尔 BCD-257，青岛海尔股份有限公司 隔水式恒温培养箱：型号 GNP-9160，上海精宏设备有限公司 电热恒温水浴锅：型号 HHS，上海博迅实业有
18、限公司医疗设备厂 电子天平：型 号： BS124S 型，塞多利斯科学仪器 (北京 )有限公司 马头牌架盘药物天平：型号 BP-II，上海医用激光仪器厂 立式压力蒸汽灭菌器：型号 YXQ-LS-30S，上海博迅实业有限公司医疗设备厂 压力蒸汽灭菌锅：型号 YXQ-LS-50A，全立式自动立式电热，上海云泰仪器仪表有限公司 数码生物显微镜：型号 Lei ca DMIL，上海博迅实业有限公司医疗设备厂 恒温摇床：型号 ZHWY-2012 型，上海智城分析仪器制造有限公司 分光光度计：型号 722 型， 上海天普分析仪器有限公司 5 1.1.2 药品与试剂 氯化钠，碳酸钠，葡萄糖， 10%氢氧化钠溶液
19、， 10%盐酸溶液，可溶性淀粉，琼脂，MgSO47H2O， KNO3， K2HPO4， FeSO4， 人工海水， MnCl2， KH2PO4，柠檬酸，卢氏碘液， I2， KI， 0.1mol/L 硫酸溶液，磷酸盐缓冲液。 1.2 实验方法 1.2.1 制备培养基 培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物 13-14。 由于各种微生物所需要的营养不同，所以培养基的种类很多。可以根据微生物种类和实验目的不同分成若干类型。培养真菌的培养基常见的有培养霉菌的查 氏培养基，分离真菌用的马丁氏琼脂培养基以及培养真菌的最常用马铃薯培养基
20、（ PDA）， 分离霉菌及酵母 用的孟加拉红培养基。 本实验用到的培养基有马铃薯培养基、淀粉酶产生菌筛选培养基以及摇床发酵培养基。 PDA 培养基： 马铃薯 200 克 ， 葡萄糖 20 克 ， 琼脂 1520 克 ，陈海 水 1000 毫升 ， 自然PH 其做法是称取 200g 马铃薯，洗净去皮切成小块，加水煮烂（煮沸 2030 分钟，能被玻璃棒戳破即可），用四层纱布过滤，再据实际实验需要加葡萄糖和琼脂，继续加热搅拌混匀，稍冷却后再补足水分至 1000 毫升，分装 在锥形瓶里 ， 加 塞 、包扎，（ 121 ）灭菌 20 分钟左右后取出，冷却后贮存备用。 淀粉酶产生菌筛选培养基：蛋白胨 1%
21、，牛肉膏 0.3%，氯化钠 0.5%，可溶性淀粉0.2%，琼脂 2%， pH7.2-7.4 其做法：称取蛋白胨 10 克，牛肉膏 3 克，氯化钠 5 克，可溶性淀粉 2 克，琼脂 20 克，人工海水 1000mL，海水煮沸后将各组分加入到其中溶解煮沸，用氢氧化钠调 pH 至7.2-7.4。分装后， 121 灭菌 20min。 摇床发酵培养基：本实验所用的是淀粉液体培养基，即在淀粉酶产生菌筛选培养基的基础上减去琼脂的成分。 6 1.2.2 采样 分别从浙江舟山鸭蛋山 码头、三江码头、马目农场附近海域采集泥样并尽快处理样品。 用事先灭过菌的铁铲采集泥样放置于事先灭过菌的采集瓶中，回实验室后尽快处理
22、样品。 1.2.3 样品的处理 制备土壤稀释溶液：称取土样 10g，放入盛有 90mL 无菌陈海水并带有玻璃珠的锥形瓶中，振动约 20min，使土样与水充分混合，将微生物分散。用一支 1mL 移液枪从中吸取 1mL 土壤悬液加入盛有 9mL 无菌陈海水的大试管中用旋涡混合器充分混匀，然后用移液枪从此试管中吸取 1mL 加入另一个盛有 9mL 无菌陈海水的试管中，同样用旋涡混合器混合均匀，以此类推制成 10-1， 10-2， 10-3 三种不同稀释度的土壤溶液。按以上步骤对采集的泥样处理制备土壤稀释溶液。将多余的样品置于 4 摄氏度的冰箱中保存备用。 1.2.4 菌株的纯化与筛选 首先用涂布接种
23、分离海洋真菌，先将事先配置好、灭过菌的马铃薯培养基溶化后冷却至 50左右，在无菌操作台中将培养基倒入同样灭过菌培养皿中制成平板，倒入培养皿中的培养基的厚度一般占培养皿高度的四分之一，等其凝固。用无菌移液枪分别由10-1， 10-2， 10-3土壤稀释液中各取 0.1mL 对号放入标有相应稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，其方法是将菌 液先沿一条直线轻轻的来回推动，使之分布均匀，然后改变方向 90 度沿另一垂直线来回推动，平板内边缘处可改变方向用涂布棒再涂布几次，室温下静置 510min，培养基充分吸收菌液后 28倒置培养3d。 菌株培养过程中，每天观察菌落生成情况，并根据菌株生长速度及菌落特征，然后通过平板划线分离法纯化菌株。（ 1）倒平板，按稀释涂布平板法倒平板；（ 2）划线，挑取上述平板上长出的菌株在平板上划线，一一对应并作记号；（ 3）重复划线操作直到得到菌落达到纯化。 将平板划线得到的已生长好的纯化菌种接种至空白斜面培养基 上。放置于 4冰箱冷藏保种备用。 菌株的筛选
