1、 本科毕业论文 （ 20 届） 产淀粉酶海洋放线菌的酶活性测定及发酵条件研究 所在学院 专业班级 生物科学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 目录 目录 摘要 .I Abstract . II 引言 . 1 1 材料与方法 . 3 1.1 材料 . 3 1.1.1 供试样品 . 3 1.1.2 试剂与药品 . 3 1.1.3 仪器与设备 . 3 1.2 方法 . 4 1.2.1 目的菌株的筛选 . 4 1.2.2 产淀粉酶菌株的酶活性测定 . 4 1.2.3 形态观察实验 . 5 1.2.4 单因子实验 . 5 1.2.5 正交实验 . 5 2 结果与分析 . 6 2.1 淀粉
2、酶透明圈 . 6 2.1.1 透明圈 . 6 2.2 酶活性的测定 . 7 2.2.1 酶活性的测定 . 7 2.3 菌株发酵条件的优化 . 7 2.3.1 单因子实验 . 7 2.3.2 正交实验 . 10 2.4 A46 菌株的初步鉴定 . 11 2.4.1 形态观察 . 11 2.4.2 显微观察 . 11 3 讨论 . 13 3.1 实验结果的讨论 . 13 3.2 菌株筛选分离纯化 . 13 3.3 酶活性测定的方法 . 14 3.4 菌种保藏 . 14 小结 . 16 参考文献 . 19 致谢 .错误 !未定义书签。 中文摘要 I 摘要 摘要 从 舟山东极，朱家尖，海滨公园，鸭蛋山
3、码头等附近海域的潮间带采集泥样、沙样，分离筛选到 6株产淀粉酶的海洋放线菌菌株分别编号为 A7、 A18、 A27(c3)、 A28、A30(a5)、 A46。运用 Yoo改良法对筛选到的这 6株海洋放线菌进行酶活测定 ，并选取酶活最高的 A46进行发酵条件的研究。通过单因子实验以及正交实验来初步探索该菌的适合的发酵条件。实验结果表明：经过单因子优化后，目的菌株 A46酶活力从 33.7U/mL提高到了 45.1U/mL，其活力增加了 33.8%；经过正交实验的优化后，酶活从初始的 33.7U/mL提高到了 65.5U/mL，其活力增加了 94%。本文的研究结果为舟山海域潮间带产淀粉酶海洋放线
4、菌的工业化发展提供了参考。 关键词 海洋放线菌；淀粉酶；酶活性测定；发酵条件 英文摘要 II Abstract Abstract This article from the ZhouShan dong pole, ZhuJiajian, Waterfront Park, Duck Mountain terminal of the intertidal zone soil and sand samples collected, separation of amylase producing marine actinomycetes named A7,A18,A27(c3),A28,A30(a5)
5、,A46. This six marine actinomycetes were screened through measuring enzyme activity by mean of Yoo. Select the highest activity of the fermentation conditions A46. In addition, culture conditions of the strain were optimized by using single factor and orthogonal tests. The results show that we treat
6、ment with the single factor optimization mutagenesis the enzyme activity of strain A46 increased to 45.1 U/mL from 33.7U/mL, and then by optimization of culture conditions to 65.5U/mL. Results of this study provide the industrialized development of a reference for marine actinomycetes in Zhoushan in
7、tertidal zone. Key words actinomycetes; amylase; activity determination; fermentation 引言 1 引言 舟山地处长江口南侧，地理位置介于 东经 12130 12325， 北纬 2932 3104之间，地理环境优越，生物资源丰富。特别是舟山海域潮间带，所谓潮间带，即是指大潮期的最高潮位和大潮期的最低潮位间的海岸，也就是海水涨至最高时所淹没的地方开始至潮水退到最低时露出水面的范围。由于潮间带的特殊性质使得潮间带微生物环境中生长的放线菌就会具有非常独特的生理生化性质，可能在它们身上发现一些具有特殊作用的代谢产物。 海
8、洋微生物包括海洋细菌、 海洋真菌和海洋放线菌等，是一个正在开发的重要生物资源。海洋环境独特，具有高压、高盐、低营养、低温的特点。在这种环境中海洋微生物种类约为陆生微生物的 20倍以上，代谢途径不同于陆地微生物，因此，可以产生多种新的物质。目前各国已经从海洋细菌、放线菌、真菌等微生物中分离到多种活性物质，这些活性物质可大致分为： 1、抗生素：研究表明海洋微生物及其代谢产物是寻找新抗生素的重要来源。其中海洋放线菌始终是研究和开发的前沿。头孢菌素 C、 P、 N， 硫酸小诺霉素就是由海洋放线菌分泌产生并已得到临床应用的抗生素 1。 2、抗肿瘤活性物 质：海洋微生物蕴含丰富的结构新颖的抗肿瘤代谢产物，
9、国内外已经从海洋细菌、放线菌、真菌等微生物体内分离到多种抗肿瘤活性物质 2。 3、毒素：海洋生物毒素一直是海洋活性物质研究的焦点之一。目前发现，许多海洋生物毒素的真正来源是海洋中游离的或附生在海洋生物上的海洋微生物所产生。其中研究较多的是河豚毒素 (TXX)。 4、酶制剂：由海洋微生物生产的酶制剂，在生物技术和工业应用中已担任了重要的角色。其中包括蛋白酶，淀粉酶，热稳定酶等等。 淀粉酶 (amylase) 是能够催化淀粉水解转化成葡萄糖、麦芽糖及其它低聚糖的一群酶的总称。它广泛存在于动植物和微生物中。淀粉酶包括 -淀粉酶和 -淀粉酶。 -淀粉酶（ EC3.2.1.1）从淀粉糖链内部水解 1,4
10、-D-葡萄糖苷键，广泛应用于燃料乙醇、淀粉糖浆、传统酿造、食品加工、纺织退浆等行业，是最早实现工业化生产，迄今为止用途最广、产量最大的酶制剂品种之一 . 随着社会需求的发展，淀粉酶不仅需要活力高，而且还要求不同特性以适应不同行业 . 酸性 -淀粉酶是在酸性条件下能水解淀粉的酶类，可应用于酸性条件下淀粉原料的加工，如高麦芽糖浆的生产和烧酒的制备 . 我国淀粉原料的深加工一般要经过液化 和糖化，目前液化使用的 -淀粉酶最适 pH值为 6.0左右，而糖化酶最适 pH值为 5.0左右，因此液化后必然要耗费大量酸碱调 pH. 开发酸性淀粉酶将有助于解决引言 2 液化酶和糖化酶适用 pH值的差异这个难题
11、. 自 1963年日本研究者发现 Aspergillusniger可以产酸性 -淀粉酶以来，许多国家都开始对其研究 .低温 -淀粉酶一般是指最适温度在40 以下的 -淀粉酶，在去污剂生产、纺织业及食品烘焙等方面有很大的市场价值 3。 -淀粉酶又叫淀粉 -1, 4-麦芽糖苷酶 ,系统名称为 -1, 4-葡聚糖麦芽糖苷酶 ,主要存在 于高等植物特别是发芽种子中。 -淀粉酶是一种外切酶 ,作用于淀粉时 ,从淀粉链的非还原性末端开始 ,水解其 -1, 4糖苷键 ,沿着淀粉链每次水解 2个葡萄糖单位 ,水解产物为麦芽糖。由于它只能从淀粉链的外部开始依次水解 ,故水解速度较慢 ,不能像 -淀粉酶那样使淀粉
12、溶液的黏度迅速降低。该酶不能水解也不绕过 -1, 6-糖苷键。当它作用于支链淀粉时 ,遇到分支点即停止作用 ,剩下的大分子质量分支糊精 ,称为 -2极限糊精。 -淀粉酶在催化淀粉 -1, 4-糖苷键水解的同时 ,使产物由 型转变为 型 ,生成 -麦芽糖 ,酶名 -淀粉酶由 此而来。 -淀粉酶是一种糖化酶 ,可作为糖化剂 ,应用于制备饴糖、啤酒、饮料等工业生产中。在结晶麦芽糖、麦芽糖醇时 ,也需要较纯净的高活力的 -淀粉酶。因此 ,-淀粉酶的提取在食品、加工、发酵、纺织品、医药等行业有着重要的应用价值 4。 前人对产陆地上的淀粉酶的放线菌已经有了很多的研究，能够产淀粉酶嗜盐菌，如不动杆菌 5，能
13、够产生耐热淀粉酶的菌株如热溶芽孢杆菌 6，碱性状态下酶活较大的嗜碱菌如 B.flexus XJU-37，以及盐单胞菌 Halomonas meridiana8 等。此外，人们对于海洋 中微生物的研究也越来越深入，人们大多研究海洋细菌，如北冰洋的 交替假单胞菌属 的ArcB84A9，产低温淀粉酶的海洋细菌 解淀粉类芽孢杆菌 (Paenibacillus.amylolyticus)10,超嗜热古菌 (Thermococcus sp.HJ21)11所产的嗜热耐酸淀粉酶等。对海洋放线菌的研究，在活性物质如抗生素方面比较多，而在淀粉酶方面研究较少。 本次实验主要是对舟山附近潮间带进行多层次，多角度的取样
14、，筛选能够产淀粉酶的菌株，并利用 Yoo 改良法来测定目的菌株的酶活，然后对目的菌株进行培养优化， 增加其产酶量和提高酶活，并对该目的菌株的适宜发酵条件进行初步探索及研究。 材料与方法 3 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 供试样品 在舟山东极，鸭蛋山码头，海滨公园，朱家尖等滩涂采集到的泥样筛选分离出的海洋放线菌作为研究对象，对其进行产淀粉酶活性的测定及研究 1.1.2 试剂与药品 氯化钠，碳酸钠，葡萄糖， 10%氢氧化钠溶液， 10%盐酸溶液，可溶性淀粉，玉米粉，黄豆粉，琼脂， MgSO47H2O， KNO3， K2HPO4， FeSO4， 人工海水，重铬酸钾，MnCl2， KH2P
15、O4，柠檬酸，卢氏碘液， I2， KI， 0.1mol/L 硫酸溶液，磷酸盐缓冲 液。 1.1.3 仪器与设备 培养皿 ： 中国医药（集团）上海化学试剂公司 玻璃棒 ： 江苏省泰兴市振科仪器厂 试管 ： 国药集团化学试剂有限公司 离心管：容量 5mL 锥形瓶：容量 150mL， 200mL， 250mL，中国医药（集团）上海化学试剂公司 烧杯：容量 100mL， 500mL， 1000mL，国药集团化学试剂有限公司 量筒：容量 50mL， 100mL，中国医药（集团）上海化学试剂公司 移液枪：容量 1000uL，型号： QY-1000A 枪头：容量 1000uL 洁净工作台 型号： SB-JC
16、-IA，上海博迅实业有限公司医疗设备厂 低速离心机 型号： LD5-2A，北京医用离心机厂 干燥箱 型号： ph070A，上海恒科学仪器有限公司 电冰箱 型号：海尔 BCD-257，青岛海尔股份有限公司 隔水式恒温培养箱 型号： GNP-9160，上海精宏设备有限公司 电热恒温水浴锅 型号： HHS，上海博迅实业有限公司医疗设备厂 电子天平 型号： BS124S型，塞多利斯科学仪器 (北京 )有限公司 马头牌架盘药物天平 型号： BP-II，上海医用激光仪器厂 超纯水器 型号： DPWS-T-20L/H型，杭州永洁达净化科技有限公司 材料与方法 4 荧光显微镜 型号： Lei ca DMIL，
17、上海博迅实业有限公司医疗设备厂 恒温摇床 型号： ZHWY-2012型，上海智城分析仪器制造有限公司 分光光度计 型号： 722型 立式压力蒸汽灭菌器 型号： YXQ-LS-30S ，上海博迅实业有限公司医疗设备厂 压力蒸汽灭菌锅 型号： YXQ-LS-50A，全立式自动立式电热，上海云泰仪器仪表有限公司 1.2 方法 1.2.1 目的菌株的筛选 淀粉水解：测定放线菌产生淀粉酶的活性。将菌种点种在高氏一号平板上，于 25培养 7d后，取出，在菌落周围滴加新鲜配置的卢氏碘液，观察在菌落周围是否出现透明圈。如菌落周围呈现透明圈时 ，表示菌种产生淀粉酶，透明圈的大小表明淀粉酶活性的强弱，根据情况，选
18、取适合的菌株进行后续实验；若菌落周围染成蓝色，不出现透明圈，说明该菌株不产生淀粉酶。 1.2.2 产淀粉酶菌株的酶活性测定 实验室测定淀粉酶活力的方法一般是用 Yoo 改良法 13-14来测定。 1.2.2.1 酶活性测定溶液的制备 （ 1） 0.5%可溶性淀粉（测酶活当天现配）：称取可溶性淀粉 0.500g，精确至 0.001g，用少量蒸馏水调成浆糊状，在搅动下缓缓倒入沸水中，然 后，以少许蒸馏水分几次冲洗装淀粉的烧杯，洗液并入其中，加热煮沸至完全透明，冷却至室温，用 pH6.0 的磷酸盐缓冲液定溶至 100mL。 （ 2）磷酸 -柠檬酸缓冲液（ pH6.0）：称取磷酸氢二钠 4.523g，
19、柠檬酸 0.807g，用蒸馏水定溶至 100mL，配好后调节 pH 至 6.0。 （ 3）原碘液（储存液）：称取 0.5g 碘和 5g 碘化钾溶于少量蒸馏水，然后定溶到 100mL于棕色瓶中备用。（一月一次）。 （ 4）稀碘液：取 0.1mL 碘液用蒸馏水稀释到 100mL。（用时现配）。 （ 5）反应终止液： 0.1mol/L 硫酸溶液。 1.2.2.2 Yoo改良法测定酶活性 取 5mL0.5%的可溶性淀粉溶液，在 30水浴中预 热 10min，然后加适当稀释的酶液0.5mL（对 A7、 A18、 A27(c3)、 A28、 A30(a5)、 A46 发酵液进行 5000R/min 离心
20、7min，取上清液稀释 3 倍），反应 5min 后，用 5mL0.1mol/L 硫酸溶液终止反应。取 0.5mL 反应材料与方法 5 液与 5mL 工作碘液显色，在分光光度计于 620nm进行吸光度的测定，以 0.5mL 水代替0.5mL 反应液为空白，以不加酶液加相同的水的管为对照管。酶活力计算公式： 酶活力（ U/mL） =(R0-R)/R0*50*D 式中 R0， R 表示对照的吸光度值， D 为酶稀释的倍数 酶活力单位定义：在 30 ， 5min 内水解 1mg 淀粉（ 0.5%淀粉）的酶量为一个单位。 1.2.3 形态观察实验 将实验菌株接种于固体高氏海水培养基上进行培养，培养 7
21、2-120h 后进行菌落形态观察。采用插片法对酶活最高的放线菌 A46 进行形态观察：先在高氏 1号琼脂平板上进行划线，再将灭菌好的盖玻片以一定的角度沿着接种线斜插入琼脂中，注意不 要插到培养皿底部， 25 培养，分别在 3d、 5d、 7d取出观察。 1.2.4 单因子实验 由上述实验测选酶活力最大作为目标菌株，选取该目的菌株进行单因子优化。 1.2.4.1 pH 值对目的菌株产酶能力的影响 取 4 个 250mL 的锥形瓶，分别装入 50mL 发酵培养基，接种量为 2%，设 pH 梯度为 6.5、 7.0、 7.5、 8.0，统一在 25，转速为 120r/min 的条件下培养 7d 后测
22、定酶活性。 1.2.4.2 接种量对目的菌株产酶能力的影响 取 4 个 250mL 的锥形瓶，分别装入 50mL 发酵培养基，调节 pH7.2-7.4，分别接种0.5mL、 1.0mL、 1.5mL、 2.0mL，统一在 25，转速为 120r/min 的条件下培养 7d 后测定酶活性。 1.2.4.3 NaCl浓度 对目的菌株产酶能力的影响 取 4 个 250mL 的锥形瓶，分别装入 50mL 发酵培养基，调节 pH7.2-7.4，接种量为2%，调节 NaCl浓度梯度为 0%、 3%、 6%、 9%，统一在 25，转速为 120r/min 的条件下培养 7d 后测定酶活性。 1.2.4.4
23、转速对目的菌株产酶能力的影响 取 4 个 250mL 的锥形瓶，分别装入 50mL 发酵培养基，调节 pH7.2-7.4，接种量为2%，培养温度为 25，接种后在 4 个转速不同的摇床 (分别为 120r/min、 140r/min、160r/min、 180r/min) 中培养 7d 后测定酶活性。 1.2.5 正交实验 通过正交实验设计软件，对目标菌株进行四因素（ pH，接种量，盐度，转速）三水平的正交实验，来确定该菌的适宜发酵条件。 实验结果与分析 6 2 结果与分析 2.1 淀粉酶透明圈 2.1.1 透明圈 如图 2-1 所示： 高氏 1 号培养基上，每个平板点种两个，经过 5 天培养后，用卢氏碘液进行颜色反应，有 6 株菌株能够在平板上形成明显的透明圈，证明该菌产酶较为量丰富。从下图直观 的来看， A46 的透明圈最大，最明显。从这可以了解到， A46 的产酶量应该比较可观。所以，选取 A46 作为目的菌株比较有优势。 A7 A18 A27(c3)/A28(下 ) A30(a5)/A46(下 ) 图 2-1 透明圈 Fig.2-1 circle
