1、 本科毕业论文 （ 20 届） 产淀粉酶海洋放线菌的分离、筛选及初步鉴定 所在学院 专业班级 生物科学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 本科毕业论文 目录 目录 摘要 .I Abstract . II 引言 . 1 1 材料与方法 . 4 1.1 分离纯化 . 4 1.1.1 实验仪器 . 4 1.1.2 培养基 . 4 1.1.3 实验方法 . 4 1.2 产淀粉酶菌株筛选 . 5 1.2.1 实验仪器 . 5 1.2.2 培养基及实验试剂 . 5 1.2.3 筛选实验 . 5 1.3 产淀粉酶放线菌的初步鉴定 . 6 1.3.1 形态观察 . 6 1.3.2 生理生化特性
2、 . 7 2 结果分析 . 9 2.1 分离纯化结果 . 9 2.2 筛选结果 . 9 2.2.1 淀粉透明圈结果 . 9 2.2.2 Yoo 改良法测定酶活结果 . 11 2.3 形态观察 . 11 2.4 生理生化特性 . 15 2.5 本章小结 . 16 小结 . 17 参考文献 . 18 致谢 .错误 !未定义书签。 本科毕业论文 中文摘要 I 摘要 摘要 从舟山东极 、 海滨公园 、 鸭蛋山码头等地区的潮间带、滩涂中采集泥样 、 水样，分离到 63 株放线菌菌株，并采用透明圈法筛选出产淀粉酶能力菌株，对其进行形态观察，生理生化实验及初步鉴定。结果表明共筛选到产淀粉酶的放线菌菌株 6
3、株，分别标记为： A7、 A18、 A27、 A28、 A30、 A46。取 淀粉酶酶活较高的 2 株菌株 A46 和 A30 进行相应形态观察及生理生化实验。通过查阅伯杰细菌鉴定手册（第八版），初步鉴定结果显示菌株 A46 可能为 小单孢菌 属的一种，菌株 A30 可能为诺卡氏菌属的一种。本文的研究结果为舟山海域潮间带海洋放线菌研究提供了参考。 关键词 海洋放线菌；活性物质；产淀粉酶；筛选与鉴定 本科毕业论文 英文摘要 II Abstract Abstract： we collected mud sample and water sample from the intertidal zone
4、s and tidal flats of Zhoushan East Pole, Seashore Park, and Duck Egg Mountain Dock, and separated them into 63 actinomycetes bacterial strains. We adopt the method of transparent loop to select bacterial strains that possess the ability of producing amylase, observe their configurations, and process
5、 physiology and biochemistry experiment and preliminary appraisal. The result shows that the number of the selected actinomycetes bacterial strains that can produce amylase is 6. We respectively mark them as A7, A18, A27, A28, A30, and A46. Then we should take two bacterial strains A46 and A30 which
6、 can produce the relative high amylase and observe the corresponding configurations and process physiology and biochemistry experiment. Through referring to Bergeys manual of determination bacteriology (the eighth edition), the preliminary appraisal result shows that bacterial strain A46 may belong
7、to Micromonospora, and bacterial strain A30 may belong to Nocardsbacillus. The research result of this paper offers reference to the ocean actinomycetes study of the intertidal zone in Chushan sea area. Key words： marine actinomycete; active material; producing amylase; screen and identify 本科毕业论文 引言
8、 1 引言 酶 (Enzyme)是生物体内一类具有催化活性和特殊空间构象的生物大分子物质，包括蛋白质和核酸。它广泛存在于各种生物体中，生物体内的各种新陈代谢，其大部分的化学变化是在酶的参与下有控制、有 秩序的进行的，所以没有酶就没有新陈代谢，也就没有生命活动 1。 淀粉酶 (Amylase)是能催化淀粉水解转化成葡萄糖、麦芽糖及其它低聚糖的一群酶的总称，它广泛存在于动植物和微生物中。淀粉 (Starch)作为农业第一大产品，其原料深加工是粮食与食品加工中的重要组成部分。淀粉是发酵工业的主要原料 ,通过发酵可以生产出众多产品 ,如乙醇、甘油、有机酸、氨基酸、酶等 ,也可以生产高附加值的生物制剂和
9、药品。通过对淀粉的生化处理可以提高淀粉产品的附加值 ,这些都需要淀粉酶的参与。淀粉酶是最早用于工业化生产并且迄今仍是用途最广 、产量最大的酶制剂产品之一，早在数前年前，人类就已利用高温与中温淀粉酶的作用从事酿酒、制饴糖等 2， 3。 酶是由生物体产生的，现在有实用价值的酶一般来自动物、植物和微生物，其中工业上的酶大多来自微生物产生的酶。 而地球表面积 71的海洋是生命的发源地，海洋生物处于低温、高盐、高压、寡营养的特殊环境 4，其生物多样性远远超过陆地，许多海洋微生物产生多种类型的陆生生物所没有的生物活性物质。但有国外学者认为，海洋微生物中仍有 99.599.9%却至今仍未被认识 5， 因此
10、， 海洋微生物活性物质有着巨大的开发潜力 。 同时开发海洋微生物农药具有发酵娴熟、生产成本低廉以及无原料后顾之忧等优势。海洋放线菌是一类特殊的、具有重要价值的微生物。由于海洋环境的特殊性，赋予生活在海洋中的放线菌在生理性状和遗传性的特殊性，因此海洋放线菌具有从中发现结构新颖的活性物质的潜力。据不完全统计， 50%以上新发现的海洋微生物活性物质是由海洋放线菌这个庞大的分类群缩产生的，暗示了开发海洋放线菌的巨大潜力。微生物药物是天然药物极为重要的组成部分 6。但是，经过几十年长时间的开发，从陆物找到新活性物质的几率越来越小，筛选的难度也越来越大。因此，开 发生态环境及布有别于陆地的海洋微生物资源、
11、寻找新型微生物药物成为研究的必然趋势。 1. 几种主要的放线菌 海洋放线菌是一类革兰氏阳性（高 G+C）海洋细菌，由于其生产丰富的次级代谢本科毕业论文 引言 2 产物（如抗生素），因此具有很大的研究潜力和实用价值。海洋放线菌的分布特点如表1-2 所示 7： 表 1-2 海洋放线菌分布表 Table1-2 Marine actinomycosis distribution table 分布位置 菌 群 链霉菌（ Streptomyces） ; 小单胞菌（ Micromonospora） ; 近海、沿岸浅海 诺卡菌（ Nocardia） ;红球菌（ Rhodococcus） ; 分支杆菌（ Myc
12、obacterium） ; 远海、深 海 高温放线菌（ Thermoactinomyces） ;戈登菌（ Gordonia） 游动放线菌（ Actinoplanetes） ; 1.1海洋链霉菌 链霉菌属也称链丝菌，是 放线菌门 一个大属，约有近千种。 链丝菌好气，绝大部分腐生，其基质菌丝不断裂，气生菌丝分化成直的、弯曲的或螺旋状的 孢子 丝，成熟的孢子丝生成链状的分生孢子，故名链丝菌。菌落较小而致密，不易挑取，表面呈粉状、绒状，并有多种颜色。 链霉菌属的不少菌种在代谢过程中，次级代谢产物为 抗生素 ，如 链霉素 、四环素、 红霉素 、 卡那霉素 和春雷霉素等；有的菌种可生产 蛋白酶 、葡萄糖异
13、构酶。 常见于土壤及腐烂植物中，一般闻起来有泥土味道。相较于其他菌种，链霉菌属繁殖较缓慢，但由于代谢过程的抗生素能抑制其他菌种的生长，所以时间一长，链霉菌属就会成为地盘上的优势菌种。 链霉 菌属同属菌种之间大多具有交换 RNA的特性，所以新的链霉菌属菌种持继不断被发现。 1.2海洋小单孢菌属 基因菌丝发育良好，形成致密小菌落，直径约 3 毫米；菌丝纤细，直径 0.20.8 微米，无鞘 ,有分枝，不断裂；一般无气生菌丝；孢子单个生在基内菌丝上， 时常在基丝表面形成褐黑色孢子层，孢子表面光滑、粗糙或有突起 ;菌落黄橙或橙本科毕业论文 引言 3 红 ,也有的为绛红、褐色或绿蓝等色；细胞壁化学组分 型
14、，即以内消旋二氨基庚 二酸和甘氨酸为特征性组份，有时还有少量左旋或羟基二氨基庚二酸；含有阿拉伯糖和木糖； DNA 中的 G+C 克分子含量为 71.4 72.8。 木属菌喜潮湿，常见于湖、河的水和泥中，能够分解一些不易分解的有机质，如纤维素、几丁质、木聚糖等。产生多种抗生素，特别是氨基糖苷类，如对绿脓杆菌有特效的 庆大霉素 等。代表种为青铜小单孢菌。 放线单孢菌属 基内菌丝上的长柄顶端形成单个大孢子，直径 2.5 3.0 微米，无气生菌丝。至今只记述葡萄牙放线多孢菌 1 种。 1.3 其他 诺卡氏菌属 ,需氧革兰氏染色阳性杆菌。菌为多形态，有球状、杆状、丝状 ,菌体大小 0.6(3 4)微米
15、,无运动性，有 些菌种呈弱抗酸性，专性需氧 ,营养要求一般。在普通琼脂平板上培养 3 天后有可见菌落， 7 10 天后菌落凸起 ,气生菌丝形成后 ,表面呈绒毛状。不同种的菌落 有黄、 橙、红或这些色素的混合色。 DNA中的 G+C 克分子含量为 60 72。大多为腐生菌 ,存在于土壤中。对人或动物致病的有星形诺卡氏菌、巴西诺卡氏菌、鼻 疽诺卡氏菌和豚鼠诺卡 氏菌 4 种。 分枝杆菌（ Mycobacterium）属 放线菌门 。该属细菌包括许多已知在 哺乳类动物 中造成严重疾病的 病原菌 ，包括 结核杆菌 和 麻风杆菌 。而海洋分枝杆菌（ 学名Mycobacterium marinum）是一种
16、存在于 海水 和 淡水 中的 细菌 ，属 分枝杆菌 类，与结核杆菌 同属。在 28-32 水温最为活跃，超过 37 则较难生存 8。所以，一但入侵人体，只会在人体的 筋膜 蔓延，不会入侵 温度 较高的内脏 器官 。然而，这并不代表它对人体的危害较轻，因为一但被海产刺伤而感染了这种细菌，伤口只会不断肿胀，而没有明显痛楚 9。因此，患者可能因此而轻视问题，使病况拖延，而要经历长时间的治疗 周期 （可长达 6 至 9 星期）。 本文通过对舟山沿海潮间带泥样水样中分 离筛选出的具有产淀粉酶能力的放线菌株的初步研究，为舟山海域潮间带海洋放线菌研究提供参考。 本科毕业论文 材料与方法 4 1 材料与方法
17、1.1 分离纯化 1.1.1 实验仪器 隔水式恒温培养箱 GNP-9160 型 电子天平 BS110S 冰箱 海尔 BCD-257 超净工作台 ZHJH-C1115C 干燥培养两用箱 PHO7OA 电热恒温水浴锅 HHS 型 BX 数显立式高压蒸汽灭菌锅 YXQ-LS-30S 1.1.2 培养基 高氏一号海水培养基：可溶性淀粉 20g， NaCl 0.5g， K2HPO4 1g， FeSO4 0.01g，MgSO47H2O 0.5g， KNO3 1g， K2HPO4 0.5g，琼脂 20g，陈海水 1000mL；调节 pH7.27.4， 121 灭菌 30min。 1.1.3 实验方法 1.1
18、.3.1 样品处理 分别从舟山东极 、 海滨公园 、 鸭 蛋山码头等地区潮间带、滩涂，采集泥样 、水样，为了排除陆地微生物，最好选择远离人类干扰的所谓 “原始天然海域 ”作为研究对象1 0。 用灭菌后的小铲子采集泥样或水样。样品置于塑料瓶 ,4 保存。 样品处理：用无菌药勺称取 5g 海泥样本于 95mL 无菌水中，剧 烈振荡制成均匀的混悬液，最后稀释到 10-2、 10-3、 10-4。 1.1.3.2 分离培养 样品处理后用高氏一号琼脂海水培养基进行分离培养，先采用涂布法将各个稀释度的样品进行涂布，每个稀释度做 3 个重复平板，然后 28-30 培养 3-5d， 48h 以后应经常注意观察
19、平板中菌落生长情况，避免菌苔生成影响分离取样。 3-5d 后观察平板中的菌落，对不同颜色、形状的菌落进行划线分离。划线采用区域划线法，继续 28-30 培养 48h，然后挑取单个菌落，继续重复划线，重复上述步骤本科毕业论文 材料与方法 5 3-5 次，基本可以得到较纯菌株，然后接种到试管斜面中，于 4 冰 箱冷藏保种备用。 1.1.3.3 抑制剂 分离海洋放线菌一般都需要使用抑制剂 ,建议用放线菌酮 (100 或 50mg/1,000mL)或制霉菌素 (100mg/L) 加萘啶酮酸 (2025mg/L,000mL) 。也可以用放线菌酮 (100 或50mg/1,000mL)或制霉菌加利富平 5
20、10mg/L,000mL11。 本次实验采用的抑制剂为重铬酸钾 (150mg/L),能够既有利于放线菌的生长 ,又能抑制真菌和细菌的生长。 1.2 产淀粉酶菌株筛选 1.2.1 实验仪器 隔水式恒温培养箱 GNP-9160 型 电子天平 BS110S 冰箱 海尔 BCD-257 超净工作台 ZHJH-C1115C 干燥培养两用箱 PHO7OA 电热恒温水浴锅 HHS 型 BX 数显立式高压蒸汽灭菌锅 YXQ-LS-30S 振荡摇床 ZHWY-2102C 1.2.2 培养基及实验试剂 高氏一号海水培养基：可溶性淀粉 20g， NaCl 0.5g， K2HPO4 1g， FeSO4 0.01g，M
21、gSO47H2O 0.5g， KNO3 1g， K2HPO4 0.5g，琼脂 20g，陈海水 1000mL；调节 pH7.27.4， 121 灭菌 30min 卢氏碘液： 1 克碘， 2 克碘化钾， 300 毫升水，先将碘化钾溶于蒸馏水中，待全部溶解后再加碘，振荡溶解。 1.2.3 筛选实验 1.2.3.1 透明圈法 原理：淀粉是白色无定形粉末，由直链淀粉（占 1030%）和支链淀粉（占 7090%）组成。直链淀粉能溶于热水而不呈糊状，支链淀粉不溶于水，热水与之作用则膨胀而成糊状。其中溶于水中的直链淀粉，呈弯曲形式，并借分子内氢键卷曲成螺旋状。这时加入碘酒，其中碘分子便钻入螺旋当中空隙，并借助
22、范得华力与 直链淀粉联系在一本科毕业论文 材料与方法 6 起，从而形成包合物。这种络合物能比较均匀地吸收除蓝光以外的其它可见光（波长范围为 400750 钠米），从而使淀粉变为深蓝色。根据该原理，可将菌株点种于含可溶性淀粉的固体培养基上，并通过碘液显色反应产生的透明圈及菌落大小之比，来初步判断菌株的产淀粉酶能力。该方法不具破坏性，简单易用，节省劳动量。 方法：将 63 株舟山沿海潮间带分离纯化出的放线菌点种于高氏一号培养基的平板上， 28 培养 3 d，滴加卢氏碘液，观察其透明圈的有无及大小。用游标卡尺测量淀粉透明圈和菌落的直径 12，以其比值做表。 1.2.3.2 Yoo 改良法测定酶活 1
23、3-14 取 5ml 0.5%的可溶性淀粉溶液，在 30 水浴中预热 10min，然后加适当稀释的酶液 0.5ml（对 A7、 A18、 A27、 A28、 A30、 A46 发酵液进行 5000R/min 离心 7min，取上清液稀释 3 倍），反应 5min 后，用 5mL0.1mol/L 硫酸溶液终止反应。取 0.5mL 反应液与 5ml 工作碘液显色，在分光光度计于 620nm 进行吸光度的测定，以 0.5mL 水代替0.5mL 反应液为空白，以不加酶液加相同的水的管为对照管。酶活力计算公式： 酶活力（ u/mL） =(R0-R)/R0*50*D 式中 R0， R 表示对照的吸光度值，
24、 D 为酶稀释的倍数 酶活力单位定义：在 30 ， 5min 内水解 1mg 淀粉（ 0.5%淀粉）的酶量为一个单位。 1.2.3.3 菌株保藏 保藏可以接种到试管斜面中，保存于 4 冰箱冷藏保种备用。此方法比较简单，适于短期保藏，但是要经常转接种（通常一个月一次） ,因此，比较容易造成菌株活性降低、菌株易受污染等；实验室常用保种方法还有液体石蜡封存法，即在试管斜面中覆盖一层无菌液体石蜡，此方法优点在于可在室温和 4 冰箱保存并且保存时间较长，缺点在于不能保存可以利用液体石蜡的一些菌种 。 1.3 产淀 粉酶放线菌的初步鉴定 1.3.1 形态观察 将实验菌株用区域划线法划线在高氏一号海水固体培养基上， 25 培养， 3d 后观察菌落形态。 采用插片法对目标放线菌进行形态观察：先在营养琼脂平板上进行划线，再将灭菌好的盖玻片以一定的角度沿着接种线斜插入营养琼脂中，注意不要插到培养皿底部，25 培养，分别在 3d、 5d、 7d、取出，于光学显微镜下进行观察。
