1、 本科毕业论文 （ 20 届） 产淀粉酶海洋放线菌的筛选与诱变选育 所在学院 专业班级 生物科学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 目录 目录 摘要 . I Abstract . II 引言 . 1 1 材料与方法 . 3 1.1 材料 . 3 1.1.1 仪器与设备 . 3 1.1.2 药品与试剂 . 3 1.1.3 培养基 . 3 1.1.4 诱变源 . 4 1.2 实验方法 . 4 1.2.1 采样及处理 . 4 1.2.2 菌株的分离培养 . 4 1.2.3 初步定向筛选 . 4 1.2.4 保种 . 4 1.2.5 摇瓶复筛 . 5 1.2.6 酶活力测定 . 5 1
2、.2.7 菌悬液的制备 . 6 1.2.8物理诱变 . 6 1.2.9 原生质体的制备 . 6 1.2.10 原生质体融合 . 6 1.2.11 原生质体再生 . 7 1.2.12 粗酶特征 初步分析 . 7 2 实验结果与分析 . 8 2.1 产淀粉酶放线菌的筛选 . 8 2.2 产淀粉酶菌株的诱变 . 8 2.3 粗酶特征初步分析 . 9 目录 3 讨论 . 12 3.1 诱变方式的选择 . 12 3.2 粗酶特征变量选择 . 13 小结 . 14 参考文献 . 15 致谢 . 错误 !未定义书签。 中文摘要 I 摘要 摘要 【目的】通过合适的诱变方法，选育出一株海洋来源产淀粉酶能力显著提
3、高的菌株。【方法】 从浙江舟山附近海域进行多层次取样，利用鉴定培养基观察水解圈大小，比较 透明圈直径（ C）和菌落直径（ H）的比值， 初步筛选产淀粉酶的放线菌。用YOO改良法测定酶活力，复筛产酶能力强的菌株作为出发菌株，通过紫外线、水浴热处理和超声波 3种物理诱变方式以及原生质体融合技术选育高产淀粉酶菌株。探究了突变株 粗酶液在不同温度、 pH、 Ca2+浓度下的酶活力变化。 【结果】 从海泥、海水和海藻中分离到产淀粉酶的放线菌 43株，取其中产酶能力最高的 3株中的一株，编号为 A19，其初始酶活力为 46.5 u/mL。经诱变选育，发现在 15W紫外线， 照距 30 cm，照射时间 30
4、s和 功率 150W超声波处理 45min时 ，酶活力最高， 同为 111.7 u/mL， 提高 140.21%。 突变株粗酶 液在 pH6.0时活性最高，在 pH7.5时存在一个峰值 ； 经 30 处理后酶活较高， 在60 、 70 时有失活趋势； 0.03 mol/L Ca2+处理后，酶活力显著提高。 关键词 淀粉酶；放线菌；筛选；诱变 英文摘要 II Abstract Abstract Objective To breed a strain of marine whose amylase production capacity remarkably improved by appropr
5、iate mutagenesis method. Method Multi-level sampling were taken from waters near Zhoushan in Zhejiang Province. Make the use of identifying medium to observe hydrolysis cycle, compare the ratio of the diameter of transparent circle (C) and the diameter of the bacterial colony (H), preliminary screen
6、 actinomycetes which could produce amylase. Make the use of Yoo improved method to isolate the vitality of enzyme, rescreen strain and sort out some good strain with strong ability of producing enzyme which will be starting strain. UV, water bath and ultrasonic wave these 3 physical mutagenesis meth
7、ods and the technology of protoplast fusion were taken to breed strain with high-producing enzyme. Explored the variation of mutant crude enzyme at different temperatures, pH and Ca2+ concentration. Outcome 43 actinomycetes that can produce amylase have isolated from marine mud, sea water and algae.
8、 I adopt 1 from 3 strains which have the best capacity of producing enzyme, tag it as A19, and its initial enzyme vitality is 46.5 u / mL. Breeding by mutagenesis, we found that the vitality of enzyme stood at the peak if it stayed in a certain environment with15W UV, of a distance of 30 cm, exposur
9、e time 30s and sonication powered 150W dealing with for 45 minutes. The result is 111.7 u / mL, increased 140.21%. The crude enzyme vitality of mutants had best state when it was PH6.0, and there was a peak when it was PH7.5. The vitality was higher if it has undergone 30 water bath,and there was a
10、declined trend when it was 60 and 70 . If handle it with 0.03 mol / L Ca2+, its vitality would improve remarkably. Key words Amylase; Actinomycetes; screening; mutagenesis 引言 1 引言 淀粉酶是使用最早、用途最广的一类酶。它一般作用于可溶性淀粉，直链淀粉，糖元等 。 水解淀粉的酶制剂按照水解糖苷健，水解产物的不同，可将其分为以下几种 1： -淀粉酶 ， -淀粉酶 ， 葡萄糖淀粉酶和脱支酶 。 淀粉酶广泛应用于燃料酒精、淀粉
11、糖浆、传统酿造、食品加 工、纺织退浆等行业。近年来，伴随国内外淀粉质原料深加工工业不断发展，淀粉酶的应用领域不断扩大，开发筛选具有各种特性的淀粉酶成为目前酶制剂研究领域的一个重要方向。中温酸性淀粉酶以其良好的耐酸特性引起了众多科研人员的兴趣。目前酿造行业普遍应用的中温淀粉酶，其最适 pH 值都在 6 以上 2。自从日本学者在 1963 年发现了产自 Aspergillus niger 的酸性淀粉酶以来，很多国家都开展了相关研究，陆续分离得到几种最适 pH 在4.0-5.5 之间的高温酸性淀粉酶 3-5。在淀粉糖浆以及啤酒酿造行业，中温酸性淀粉酶有着 突出的应 用优势 。 首先 ， 该酶较强的耐
12、酸特性使其有潜力与糖化酶协同水解淀粉质原料 ； 其次 ， 由于作用温度的特点 ， 使得中温酸性淀粉酶不必和高温淀粉酶一样 ， 将淀粉物料保温在 100 左右再进行水解 ， 具有 降低能耗 的作用 ； 同时 ， 相对于高温淀粉酶来说 ， 中温酸性淀粉酶的灭活更加 容易 操作 。 因此 ， 中温酸性淀粉酶的开发和应用势在必行 。 此外 ， 具有生淀粉降解能力的淀粉酶类也是近年来的研究热点 。 在传统淀粉加工行业中 ， 原料首先要蒸煮糊化后再加入淀粉酶类进行水解 ， 这将消耗大量的热能 ， 提高生产成本 。 如果采用能够降解生淀粉的酶类来水解物料 ， 可以简化 操作 ， 缩减成本 。 目前 ， 相关
13、报道中这些酶大多源于真菌和酵母 ， 而来源于细菌的较少 。 诱变是指用物理、化学因素诱导，使生物 遗传 特性发生变异的方法。通常用于选育菌种、得到高产量植物种子等。诱变操作并不复杂，即用诱变剂直接或间接地处理细菌等生物。诱变剂大致可分物理诱变剂、化学诱变剂和生物诱变剂。常用的物理诱变剂包括紫外线、 X射线、射线、快中子等；化学诱变剂包括烷化剂 (如甲基磺酸乙酯、硫酸二乙酯、亚硝基胍、亚硝基乙 基脲、乙烯亚胺及氮芥等 )、天然碱基类似物、脱氨剂 (如亚硝酸 )、移码诱变剂、羟化剂和金属盐类 (如氯化锂及硫酸锰等 )6。 随着遗传学和分子生物学等领域的飞速发展，许多新型的技术被应用于菌种选育，如原
14、生质体融合育种技术和基因工程育种技术等。但是诱变育种技术仍是提供菌株生产能力的重要手段。它获得的正突变率相对较高，可以得到多种优良突变体和新的有益基因类型。另一方面，诱变育种存在一定的盲目性和随机性，在实际应用中，应根据出发菌株及实验室条件等具引言 2 体情况来选择合适的诱变方法 7。 我国地处太平洋西部，大陆海岸 线长达 1800公里，渤海、黄海、东海、南海四个海区面积达 473万平方公里，属我国管辖的海域约 300万平方公里，有大小岛屿 6000 多个，有着丰富的海洋微生物资源 8。而放线菌是迄今最重要和最大的药用微生物种群，其产生的抗生素占已发现的天然来源抗生素的 2/3以上，故放线菌也
15、被称为开发新药的先导化合物资源库 9。海洋放线菌由于生存于特殊的海洋环境中，往往具备了复杂独特的代谢途径，其次级代谢产物在结构类型以及在生物活性等方面都呈现出与陆生放线菌不同的特点和多样性。多年来，诸多结构新颖、生物活性显著的天然活性产 物持续从海洋来源放线菌代谢产物中被发现。海洋放线菌活性产物的研究一直是近年来海洋微生物研究中的一个热点。 本实验 即 以应用前景广阔 的 海洋放线菌为实验对象 ， 选取简单易行的 3种物理诱变方式对其进行诱变，并尝试原生质体融合育种技术 ，筛选淀粉酶高产菌株，为该酶的工业生产提供新的可能来源。 材料与方法 3 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 仪器与设
16、备 锥形瓶（容量 150mL， 200mL， 250mL， 500mL），烧杯（容量 50mL， 100mL，500mL），量筒（容量 50mL， 100mL， 500mL），移液管，移液枪， 培养皿（ D=90mm），磁力搅拌器，压力蒸汽灭菌锅（ XQ-LS-50A 型），干燥箱（ PH070A型）， SSW 型微电脑电热恒温水槽 ， JY92-II 超声波细胞粉碎机， 洁净工作台（ SB-JC-IA 型），电子天平（ BS124S 型），超纯水器（ DPWS-T-20L/H 型），恒温摇床（ ZHWY-2012 型），隔水式恒温培养箱，冷冻离心机 （ Eppendorf -5417R），冰
17、箱（西门子 BCD-198）， 722 型分光光度计 。 1.1.2 药品与试剂 可溶性淀粉、蛋白胨、酵母膏、牛肉浸膏、葡萄糖、琼脂、硝酸 钾、氯化钠、磷酸氢二钾、硫酸铁、氢氧化钠、盐酸、硫酸镁、磷酸二氢钾、曲利本蓝、碘化钾、碘、磷酸氢二钠、柠檬酸。 1.1.3 培养基 1） 高氏一号琼脂培养基 ： 可溶性淀粉 20g， KNO3 1g， NaCl 0.5g， K2HPO4 0.5g，MgSO47H2O 0.5g， FeSO47H2O 0.01g， 琼脂 20g，水 1000mL， pH7.2-7.4， 121 灭菌20min。 2） 产淀粉酶定性培养基：可溶性淀粉 2g，蛋白胨 10g，酵母
18、膏 5g， K2HPO4 3g，FeSO47H2O 微量， MgSO47H2O 微量，琼脂 15-20g， 水 1000mL， PH7.0， 121 灭菌30min。 3） LB 培养基：胰蛋白胨 10g，酵母浸膏 5g， NaCl 10g，水 1000mL， 121 灭菌20min。 4） 发酵培养基： 1.0%蛋白胨 ， 0.5%酵母膏， 0.1%葡萄糖， 0.5%可溶性淀粉，0.2%KH2PO4， 0.05% MgSO47H2O， 0.01%CaCl22H2O， PH 7.0， 121 灭菌 20min。 5） 再生培养基： 葡萄糖 2%，酵母菌 0.4%，牛肉膏 0.2%， MgSO4
19、7H2O 0.05%，KH2PO4 0.1%， K2HPO43H2O 0.15%， NaCl 0.05%， FeSO4 0.001%，琼脂 1.8%， 10%蔗材料与方法 4 糖溶液， 0.7mol/L NaCl溶液，生理盐水， 121 灭菌 20min10。 1.1.4 诱变源 紫外线 (UV)照射 ,15W,照距 30 cm；恒温水浴；功率 150W 超声波。 1.2 实验方法 1.2.1 采样及处理 应用多层次取样，分别从舟山东极岛、海滨公园、鸭蛋山码头 3 地采集海泥、海水、海草等样品。采集过程所用工具均经过灭菌处理。样品及时带回实验室 ，在 4 冰箱中暂时 保存，尽快处理。 1.2.
20、2 菌株的分离培养 取 5 g海泥样品倒入盛有 45 ml灭菌水的含有玻璃珠的锥形瓶中，摇床震荡 30 min，取出静止 5 min后，用移液枪取 0.5 mL上清液注入 4.5 mL灭菌水中吹吸数次混匀，制得10-2 稀释液。以此类推，制得 10-8， 10-9， 10-10 稀释液。各取 0.5 mL液体涂布于 高氏一号培养基表面，每个稀释度涂布 3个平板。 取 1 mL水样，注入盛有 9 mL灭菌水的试管中，此为 10-1 稀释液。以此类推，制得10-2， 10-3， 10-4 稀释 液。各取 1 mL液体涂布于 高氏一号 培养基表面，每个稀释度涂布 3个平板。 取 1-2g海草，置于
21、50mL的离心管中，加入适量灭菌海水，并加入少许石英砂。在涡旋振荡器上振荡约 5min后取出海草，静置 5min后，用移液枪取 0.5 mL上清液注入 4. 5 mL灭菌水中吹吸数次混匀。用同样方法再做 2次 10倍稀释，共制得 3个稀释度。每个稀释度各取 1 mL液体涂布于 高氏一号 培养基表面，每个稀释度涂布 3个平板。 所有接好的平板置于 28 恒温培养箱中培养 5-7天后， 挑取不同菌落形态的菌株进行多次划线分离纯化，得到各个放线菌菌 株的纯培养物，编号并保存。 1.2.3 初步定向筛选 用划线法将分离得到的菌株接种至添加有曲利本蓝的产淀粉酶定性培养基， 28培养 5-7 天后观察产水
22、解圈情况。 观察并测定透明圈直径（ C）和菌落直径（ H）， C/H值大者，即可初步判定其产淀粉酶能力较强。 1.2.4 保种 用试管制作做斜面培养基， 挑取有明显淀粉水解圈的单菌落 到无菌水中做稀释菌材料与方法 5 液，用接种环挑取一环菌液轻快地从斜面底部向上做之字形划线。 作为初筛菌株编号后，放置 室温下培养 48h，然后放入 4 冰箱内 保藏。 1.2.5 摇瓶复筛 从斜面 取一环已分离得到的菌株接入装液量 50%的 500mL 摇瓶中， 30 、160r/min 振荡培养 48 h。 在相同培养条件下振荡培养 6 d 后用 Yoo 改良法 11测定酶活 , 酶活力较高者初步确定为进行下
23、一步诱变选育的目标菌株。 1.2.6 酶活力测定 1、将培养 48h 以上 的菌液从恒温摇床中取出，将菌液混匀，加满 1.5mlEP 管，标记对应编号，放入低温离心机离心（ 5000r/min， 20， 10min） 2、配置溶液 (1) 碘原液：称量 KI 22g，加入少量蒸馏水溶解，加入碘 11g，溶解后定容至500ml,贮于棕色瓶中。 (2) 比色稀碘液：取碘原液 2ml，加碘化钾 20g，用蒸馏水定容至 500ml，贮于棕色瓶中。 (3) 1%可溶性淀粉：称量可溶性淀粉 1g，用少量蒸馏水混合调匀，徐徐倾入煮沸的蒸馏水中，边加边搅拌，煮沸 2min 后冷却，加水定容至 100ml。（现
24、配现用） (4) PH6.0 磷酸氢二钠 -柠檬酸缓冲液：称量磷酸氢二钠 4.523g，柠檬酸 0.807g，用蒸馏水溶解并定容至 100ml。（现配现用） 3、将酶液稀释 30 倍，吸取 EP 管中上清液 0.5ml，加入 14.5ml 缓冲液中混合备用。 4、在小试管中依次加入 2.5ml 1%可溶性淀粉溶液， 2.5mlPH6.0 磷酸氢二钠 -柠檬酸缓冲液， 30 预热 5min。 5、加入 30 倍稀释的 0.5ml 酶稀释液，对照管加缓冲液 0.5ml， 30 下保温 5min。加 0.1mol/L 硫酸终止液 5ml终止反应。 6、吸取 0.5ml 反应液与 5ml 比色稀碘液显色并作一只空白管。（ 0.5ml 蒸馏水 +5ml比色稀碘液） 7、分光光度计预热 20min， 620nm处测定吸光度。（空白调零） 8、酶 活力测定公式：酶活力 =50X DX（ R0-R） /R0 D：稀释倍数， R0：对照管光密度值， R：样品光密度值 酶活定义为：在最适温度和 PH 的条件下，每 5 分钟分解淀粉产生 1mg 葡萄糖为
