1、 本科毕业论文 （ 20 届） 东海陆架沉积物真核微生物多样性研究 所在学院 专业班级 生物科学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 本科毕业论文 目 录 目录 摘要 .错误 !未定义书签。 Abstract .错误 !未定义书签。 引言 . 1 1 材料与方法 . 3 1.1 材料 . 3 1.1.1 样品 . 3 1.1.2 仪器 . 3 1.1.3 配置溶液 . 3 1.1.4 生化试剂 . 4 1.2 实验方法 . 4 1.2.1 样品的前处理与保藏 . 4 1.2.2 沉积物样品总 DNA 的提取 . 4 1.2.3 沉积物总 DNA 的电泳检测 . 6 1.2.4 P
2、CR 扩增 . 6 1.2.5 PCR 产物的纯化 . 6 1.2.6 真核微生物 18S rDNA 基因克隆文库的构建 . 7 1.2.7 系统发育分析 . 8 2 实验结果与分析 . 9 2.1 DNA 的提取、纯化和 PCR 扩增 . 9 2.2 克隆文库的构建及测序 . 9 2.3 沉积物 中真核生物多样性及系统发育分析 . 10 2.3.1 沉积物中真核微生物多样性 . 10 2.3.2 系统发育分析 . 12 3 讨论 . 19 3.1 真核微生物群落多样性分析 . 19 3.2 18S rDNA 分析群落多样性实验优化 . 19 参考文献 . 22 附录 . . 21 附译文：
3、中国亚热带大型浅水湖 -太湖中真核微生物群落组成的季节变化规律 . 25 译文原文 .42 致谢 . .54 本科毕业论文 目 录 本科毕业论文 中文摘要 I 摘要 摘要 沉积物是集化学物质和微生物于一体的特殊生态环境。沉积物中的真核微生物种类繁多 、数量庞大，研究沉积物中真核微生物的多样性有利于我们更好地了解海洋生态环境和海洋演变历史。本论文通过对东海陆架沉积物 13号地的 4 个不同层次的海底泥样沉积物样品进行研究 ,采用 18S rDNA 技术等手段，对真核生物基因序列进行系统发育分析，结果发现海洋沉积物中有着丰富的真核微生物多样性，可将它们归为微藻（ Microalgae）、真菌（ F
4、ungi）、丝足虫类（ cercozoan）、囊泡类（ Alveolate）、后生动物（ Metazoa）、原生动物门（ Protozoa）等六个类群，其中后生动物这一类群是沉积物真核 微生物的主要组成部分，各层之间物种数量没有明显的变化规律，其中 10个克隆子是未知的物种。最后对真核微生物群落多样性、 18S rDNA 分析群落多样性实验优化、海洋微生物多样性的保护三个方面进行了讨论。 关键词 东海陆架；沉积物；真核微生物；多样性； 18S rDNA; 本科毕业论文 英文摘要 II Abstract Abstract Sediment is the special ecological en
5、vironment,which takes chemical substances and microorganisms into one set. The type of eukaryotic microorganisms from Sediment are vareties as same as the number. With the investigation on the diversity of eukaryotic microorganisms,We can better understand the evolution of the marine environment and
6、 maritime history. Based on the East China Sea shelf sediments 13 site and the detection of18S rDNA techniques .we can get the corresponding integration of biological sequences from the 4 samples at different depths of the sea mud sediment samples. Finally, The results which get from the phylogeneti
7、c analysis of Gene sequences on eukaryotic microorganisms showing the rich diversity of the marine eukaryotic. It can be classified as Microalgae, Fungi,cercozoan,Alveolate,Metazoa,Protozoa. This group of metazoan eukaryotic microbes is the major component of the sediments and the number of species
8、between the layers is no obvious variation, but of which, the 10clones are belongs to unknown species. Futher more, eukaryotic microbial community diversity, 18S rDNA analysis of experimental optimization of community diversity, the protection of marine microbial diversity are discussed . Key words
9、East China Sea; sediment;eukaryotic microorganisms;diversity; 18S rDNA; 本科毕业论文 引言 1 引言 作为地球的蓝色土地，海洋共有三亿六千万平方公里的面积，占地球总面积的70.8%,含十四亿立方公里的水 ,占地球水资源的 90%。同时，海洋又是自然资源的宝库，矿产及营养的大储藏库 ,地球上氧气大部分都在海洋产生，而且对全球的气象环境影响重大。因此海洋作为生态系统的重要成员，其生态地位是无可取代的 1。 地球作为太阳系中唯一一颗有生命的行星，其最初的生命是由海洋孕育的。据不完全统计，海洋环境中生存的生物大约有 20 多万种，
10、更令人惊奇的是，海洋里总生物量名第一的生物不是鱼虾，而是微型生物，海洋生物量的 90%属于微型生物；如果论个体，数量最多的 “ 生物体 ” 是病毒，每 1 毫升海水中有上百万个病毒，个体数量占了大洋中有核酸颗粒的 94%2。 沉积物是集化学物质和微生物于一体的特殊生态环境 3。在漫长的海洋历史演变过程中，由于海流、陆地河流、人类活动、地球地质板块运动所带来的海洋地貌的变化，使海底沉积物成为了海洋历史的记录者。海洋沉积物是地球上最大面积的覆盖层 , 约为3.5 108 km2 ,占覆盖地球面积的 48.6%4。丰富的海洋微生物资源开发及应用前景广阔 , 吸引了世界各国和组织的大量财力和物力的投入
11、到海洋生物多样性的研究中来。据越来越多的研究表明，海底沉积物中蕴含着丰富的微生物资源。同时，海底特殊的高压、低温（或高温）、低光照等理化 因素给微生物创造了复杂且却独特的生存环境，也给研究者带来了难度。研究沉积物中的微生物多样性 ,有利于我们了解上层覆水的水质及变化情况，从而推测其受污染程度，为海洋环境保护提供便捷。沉积物中微生物物种、基因等资源的鉴定和获得 ,有利于我们了解并增加对当前微生物资源的认知程度 ,并为其在生物技术领域的应用奠定基础 3。最后，研究沉积物中微生物也是研究海洋化学循环的基础，必将成为未来海洋研究的一个重要组成部分。 真核微生物是海洋微生物最重要一大类群，它在海洋中广泛
12、存在 ,是初级生产力的重要贡献者 ,也是微食物环的重要组 成部分。但是，海洋真核微生物的生存方式多种多样，类群也非常多，以及大多数真核微生物实验室的不可培养状态，给研究和分类带来了一定的困难。在现代生物技术的发展中，除去传统的微生物培养方式，运用分子生物学技术直接对真核微生物种类组成进行研究已成为真核微生物多样性研究的重要方法。这种方法不仅能更多的了解海洋微生物的类群，而且在一定程度上了解海洋微生物的演化及物种的变异进化情况，给海洋生态学研究带来了新的曙光。海洋真核微生物分布的本科毕业论文 引言 2 研究尚不是很多，因此，对海洋真核微生物的多样性进行研究势在必行。 本文主要采用 18S rDN
13、A 分析方法，对一个采样点的四个层次的真核生物多样性进行分析，从而更好的了解东海陆架沉积物的多样性。 本科毕业论文 材料与方法 3 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 样品 采自东海陆架沉积物， (见表 1.1， ) 表 1.1 样品采集位点 Tab1.1 Sampling site 柱样号 采样日期 采样时间 层次 水深 /m 纬度 经度 13# 20070425 02： 00 0 3cm； 3 5cm； 5 8cm； 8 10cm 40 31 30.103N 123 29.844 E 样品标记： 0 3cm 为 131F； 3 5cm 为 132F； 5 8cm 为 133； 8 1
14、0cm 为 134F；(注：以下都为此标记顺序 ) 1.1.2 仪器 表 1.2 主要仪器 Tab1.2 List of major equipment 仪器名称 型号 公司产地 冷冻离心机 Eppendorf 5417R 艾本德中国有限公司 梯度 PCR仪 T-Gradient Biometra， Germany 电热恒温水槽 DK-3D 上海精宏实验设备有限公司 凝胶电泳仪 DYY-6C 北京市六一仪器厂 凝胶成像系统 GD 2000 BIO-RAD， USA公司 快速核酸提取仪 Fast PIEP-24 MP BIO,USA公司 超净工作台 SW-CJ-IFD 苏州市洁净技术设计所 隔水
15、式恒温培养箱 GNP-9160 上海精宏实验设备有限公司 压力蒸汽灭菌锅 YXQ-LS-S 上海博迅实业有限公司医疗设备 台式恒温震荡器 THZ-B 江苏太仓培英仪器有限公司 移液枪 艾本德中国有限公司 冰箱 超低温冰箱 BCD-226 MDF-382E 西门子（中国）有限公司 日本三洋 SANYO 1.1.3 配制溶液 TAE 缓冲液：用 Tris 242g，冰乙酸 57.1ml， EDTA（ 0.5mol/l） pH8.0 100ml 配置 50本科毕业论文 材料与方法 4 倍浓度 TAE 液体后进行稀释使用。 LB 液体培养基、 LB 固体培养基、 LB 一 Amp 培养基（氨苄青霉素至
16、终浓度为120g/ml）。 氨苄青霉素溶液 10mg/mL。 X-gal贮液（ 20 mg/mL）、 IPTG 贮液（ 20）。 1.1.4 生化试剂 总 DNA 提取试剂盒 FastDNA SPIN Kit for Soil， MP BIO,USA 公司。 pMD19- T， dNTP， Taq 酶等 PCR 扩增试剂盒，宝生物（大连）有限公司。 DL 2000 DNA marker。 琼脂糖凝胶 DNA 回 收试剂盒，天根生化科技有限公司。 18S rDNA 引物， PCR 扩增引物。 DH5感受态细胞。 1.2 实验方法 1.2.1 样品的前处理与保藏 将采集到的样品先于 -70冰箱冷冻
17、保藏。 分装时，待样品解冻后在超净工作台上分装，各层泥样分别装入 5ml EP 管 2 管及10ml EP 管 1 管，分别标记 131F、 132F、 133F、 134F，分装结束后将分装样品和原泥样放回 -70冰箱中保藏。 1.2.2 沉积物样品总 DNA 的提取 在无菌操作下准确称取湿重 0.5g 海底沉积物样品 ,采用总 DNA 提取试剂盒FastDNA SPIN Kit for Soil ,按照生产商提供的方法进行总 DNA 的 抽提。 1、在使用试剂盒提取土壤 DNA 前，要先准备以下内容： .试剂盒中含有一个小瓶，是浓缩的 SEWS-M 洗液，在使用前加入 100ml 无水乙醇
18、，并在瓶子的表明写明加入乙醇的时间，确保瓶子旋紧防止溶液蒸发，将瓶子中的试剂混匀，室温保存。 .在裂解液中加入 500mg 的土壤样品，并加入磷酸缓冲液和 MT 缓冲液，保证管中有250 500ul的空间。如果样品数量较多，则分装到多个管中。 .在快速核酸提取仪中，以 6.0m/s 的速度提取 40 秒，一般可以将绝大多数 样品裂解成功，如果实验需要更长的裂解时间，样品最好放在 Matrix E 管中，置于冰上孵育 2 分本科毕业论文 材料与方法 5 钟，防止在提取仪中裂解时间过长所带来的热量。 2、提取步骤： .将 500mg 土壤样品加入 Lysing Matrix E 裂解管中（见准备
19、2）。 .加入 978ul的磷酸缓冲液 Sodium Phosphate Buffer 到 Lysing Matrix E 裂解管中。 .加入 122ul的 MT 缓冲液。 .在快速核酸提取仪中，以 6.0m/s 的速度对样品进行提取，时间持续 40 秒。 .14000xg 离心 5 10 分钟，去除残片 。 （注：离心时间延长至 15 分钟，可以去除大的样品中多余的残片，或是有利于从复杂的细胞壁中分离细胞） .将上清转移到干净的 2ml 离心管中，加 250ul PPS（蛋白质沉淀液），用手拿住管子上下摇晃 10 次。 .14000xg 离心 5 10 分钟，去除残片。将上清转移到干净的 1
20、5ml 离心管中。（注：这一步用 2ml的离心管也可以，但是大的管子对 DNA 混合和附着更为有效） .将 Binding Matrix 溶液混匀，加入 1.0 ml Binding Matrix 溶液到含上清的 15 ml离心管中。 .将离心管放在漩 涡振荡器上，或者放在手上颠倒摇匀 2 分钟；将离心管放在管架上静置 3 分钟，等待硅石沉淀。 .小心将 500ul的上清移除，注意不要碰到附着的颗粒沉淀。 .在剩下的上清液中将 Binding Matrix 重悬，将大约 600ul 的混合液加入 SPIN 滤膜中， 14000xg 离心 1 分钟，将截留管 catch tube 倒空，加入剩下
21、的混合液到 SPIN 滤膜，重新离心 1 次，将截留管 catch tube 再次倒空。 .加入 500ul准备好的 SEWS-M 液体，用枪头吸取液体，轻轻的将小球重悬。（注：确保乙醇已经加入 SEWS-M 浓缩液 中） .14000xg 离心 1 分钟，将截留管 catch tube 倒空，换一个新的管。 .不加任何液体， 14000xg 离心 1 分钟，再重复 1 次，以便将填料中剩余的溶液甩干。将截留管 catch tube 倒空，更换管子。 .将 SPIN 滤膜放置在空气中，室温干燥 5 分钟。 .将附着颗粒（ SPIN 滤膜上）在 50 100ul 的 DES（除热源和核酸酶的超纯水）中温和重悬。（注：为避免纯化的 DNA 过度稀释，请加入能起到重悬作用的最少量的DES；如果在 55热快或水浴中孵育 5 分钟，可能 DNA 的产量会更高） .14000xg 离心 1 分钟，将洗脱的 DNA转移到干净的截留管 catch tube 中，将 SPIN 滤
