1、 本科毕业论文 （ 20 届） 高效液相色谱法检测出口水产品中组胺含量的研究 所在学院 专业班级 生物科学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 本科毕业论文 目录 1 目录 摘要 .1 Abstract .2 引言 .1 1 材料与方法 .2 1.1 材料 .2 1.2 仪器与药品 .2 1.2.1 仪器 .2 1.2.2 药品 .2 1.3 实验方法 .2 1.4 样品处理 .2 1.5 色谱条件 .3 1.6 本章小结 .4 2 实验结果与分析 .5 2.1 标准曲线 .6 2.2 样品曲线 .10 2.3 本章小结 .10 3 实验讨论 . 11 3.1 国内外检测组胺方法
2、的探讨 . 11 3.1.1 荧光分析法 . 11 3.1.2 酶联法 . 11 3.1.3 气象色谱法 .12 3.1.4 高效液相色谱法 .12 3.2 高效液相色谱的优点和特点 .12 3.2.1 优点 .12 3.2.2 特点 .12 3.3 检测水产品中组胺含量的意义 .12 3.4 水产品中组胺研究的展望 .13 3.5 本章小结 .13 小结 .14 参考文献 .15 致谢 .16 本科毕业论文 中文摘要 I 摘要 摘要 食品中的组胺含量过多会导致 食物中毒 ， 通过 大量检测 和事实 表明，水产品 中 组胺含量比较高的是 青皮红肉鱼类 。 当 鱼 死亡后鱼肉 不新鲜或腐败时，鱼
3、体 里 游离 状态 的组胺酸 就会通过 脱羧酶 作用产生组胺 。人体组胺中毒后一般有0.5 1小时的潜伏期 ， 最长能达 4小时而 最短可为 5min。随着社会的发展人们对饮食健康的越加重视，食品中组胺含量的的检测的方法也在不断的进步。到现在高效液相色谱法检测组胺含量技术已经基本成熟，由于其高效，操作简单，结果精确等优点。高效液相色谱法成为了现在主流的检测食品中组胺含量 的方法。本文选取了青皮红肉鱼类中的典型代表金枪鱼为样本，产用加入高氯酸柱前衍生的方法， 以 40 mol L pH 5 50的柠檬酸钠缓冲液作为流动相，流速为 1 0 mLmin。通过对出峰时间以及峰面积和峰形状的统计。研究样
4、本中的组胺含量。样品中随机选取一样加标用以计算回收率，通过检测计算回收率来确定实验的误差。本实验通过测量组胺的含量确定出口水产品的新鲜度， 优质鱼应该含有低于10毫克 /公斤的组胺水平，而 30毫克 /公斤，表示严重恶化， 50毫克 /公斤则直接认定该事物中含有毒性，不供应人使用。通过检测 5个样品均不 含组胺，说明这些样品是新鲜的。 关键词 高效液相色谱 ； 水产品 ； 组胺 本科毕业论文 英文摘要 II Abstract Abstract The histamine skightky excessive food can cause food poisoning, through a la
5、rge number of detection and in fact, aquatic products of histamine content is higher is totally red meat fish. When the fish fish dont fresh or after the death of the body, fish corruption free state of histamine acid will pass decarboxylase an enzyme action creates histamine. Human histamine poison
6、ing usually have a 0.5 - after 1 hour, the longest can reach the incubation period for four hours and the shortest 5min. With the development of society people to eat a healthy diet of increasingly seriously, the content of histamine in food the examination method is also in constant progress. To no
7、w HPLC detection histamine content technology has basic mature, due to its high efficiency, simple operation, the result accurately, etc. High performance liquid chromatography is now a mainstream testing food histamine content of method. This paper selects the green husk the typical representative
8、of red meat fish as samples, production with tuna before joining high chlorine acid column derivatives, using the method of 40 rmnol/L pH 5.50 citrate sodium buffer a as mobile phase, velocity of 1.0 mL/min. Through to the peak time and peak area and peak shapes of statistics. Research samples of hi
9、stamine content. Add in the sample as BiaoYong randomly selected by calculates recovery, by detecting calculates recovery to determine the experimental error. This experiment by measuring the content of histamine to determine the freshness, and exporting aquatic product quality fish should contain l
10、ess than 10 mg/kg of histamine level, and 30 mg/kg, expressed grave deterioration, 50 mg/kg is directly recognized this things contains toxic, not supply people use. Key words HPLC ； sea food ； Histamine 本科毕业论文 引言 1 引言 进出口水产品多以成品方式密封包装为主。水产品中尤其是鱼类含有各种各样特有的维生素、脂肪酸、矿物质等多种营养成分在内，这些营养成分对人体能起到一定的保健作用。鱼肉有
11、着丰富的蛋白质含量，人类的很大一部分事物都来自于水产品，而鱼类到现在更是人类最常见的食物之一。但是，鱼类和陆生的动物具有很大的差别，它们都生长的环境跟陆地相比之下比较特殊在 比较特殊，比如水中的温度低、光照强度弱、有着种类繁多的浮游生物、海水中的盐度高和深海中的水压高。因此，水产品也就形成了含有很多营养保健成份和有毒害成份。而这些成份在大多数陆生的动物和植物体中是不具备的。当鱼活着的时候由于代谢中用，特别是一些海鱼组胺存在于鱼鳃和鱼的内脏中。鱼肉中基本不含有组胺。当鱼死后没有及时处理，由于鱼类的防御系统找到了破坏已经不能抑制细菌的生长和繁衍，许多细菌开始生长其中就包括形成组胺的细菌，这些细菌生
12、长后能迅速产生组胺。而一些鱼类由于游离组胺酸含量相对较高，某些细菌生长时会即便不产生组 胺而产生组胺酸脱羧酶，这些组胺酸脱羧酶也能与游离的组胺酸反应最终产生组胺。组胺是鱼体中毒性最大的生物胺类。中毒病人呈现组胺反应，主要表现为颜面潮红似酩酊样，眼结膜充血，头昏，头剧痛，心悸恶心等症状，严重的患者出现晕厥，血压降低。更严重者可导致死亡。因此，建立快速、准确的测定生物样品中组胺的分析方法有着十分重要的意义。常用的分析方法有荧光分光光度法，比色法，薄层色谱法，高效液相色谱法 (HPLC) 。目前测定食品中组胺的技术方法有很多，灵敏度、精密度、特异性和使用性也各不相同。因此，以食品安全为目的的检测主要
13、选 择精密度高、实用性强的方法；而以检测食品新鲜度、质量为目的的检测多选择灵敏度高、特异性好的方法。本文选取了 5份进口金枪鱼样品。通过 加入高氯酸柱前衍生的方法， 以 40 rmnol L pH 5 50的柠檬酸钠缓冲液作为流动相，用 C18柱，流速为 1 0 mL min色谱条件进行检测 。 通过回收率的计算确定实验的精确性。最后检查出 5份金枪鱼样品中的组胺含量，确定金枪鱼的鲜度。 本科毕业论文 材料与方法 2 1 材料与方法 1.1 材料 中国进出口检测检疫局舟山分局，随机收取 5 份出口金枪鱼，将包装袋拆开取出金枪鱼。通过室温解冻后用刀切成碎 肉，装入样品袋贴上标签备用。 1.2 仪
14、器与药品 1.2.1 仪器 干燥箱、称量瓶、电子天平、剪刀、容量瓶、移液管、 Maxi Mix（漩涡振荡器）、液相色谱仪（ HP 1100 G1313A） 、电热恒温干燥箱（ DHG-9140A）、 冷冻离心机 （ Universal 320R） 、分散机 （ IKA） 、均质器 （ T25 BASIC） 。 1.2.2 药品 组胺提取液（ 24ml 高氯酸融于 1L 水） 组胺标准液（ 100g/ml） 1， 7 二氨基氢烷（ 25mg/kg） NaOH 溶液（ 2mol/ml） 饱和 NaHCO3 单酸氯（ 1.00g 融于 100ml 丙酮 ） 乙晴 1.3 实验方法 高效液相色谱法 1
15、.4 样品处理 1.4.1 取洁净离心管（ 20ml） 6 只，置于试管架上。编号： 1、 2、 3、 4、 5、加标。去比色管（ 25ml） 6 只，对应编号 1、 2、 3、 4、 5、加标。 1.4.2 每样样品称取 2.0g，分别加入 1、 2、 3、 4、 5 号离心管。随机取一样样品在称取 2.0g本科毕业论文 材料与方法 3 加入加标离心管。 1.4.3 加入组胺提取液（ 24ml 高氯酸融于 1L 水） 15ml 1.4.4 将样品用 均质器（ T25 BASIC）进行均质（没均质一种样品都要用清水将均质器清洗，以减小实验误差） 。 1.4.5 将均质后的样品放入 冷冻离心机（
16、 Universal 320R）以 5000（ rm/min）离心 10 分钟。 1.4.6 离心好后去上清液于 25ml 比色管，留沉淀物。 1.4.7 每只离心管加入组胺提取液（ 24ml 高氯酸融于 1L 水） 10ml，重复以上 1.4.1.41.4.1.6 步骤。 1.4.8 用去离子水定容于 25ml，摇匀，静至。 1.4.9 取洁净离心管（ 5ml） 10 支，编号：曲线 1、曲线 2、曲线 3、曲线 4、 1、 2、 3、 4、 5、加标。 1.4.10 曲线 1、曲线 2、曲线 3、曲线 4 分别加入 100L、 200L、 500L、 1000L 组胺标准液（ 10g/ml
17、）用去离子水定容至 1ml。从对应比色管中移取 1ml 至离心管（ 5ml）。 1.4.11 活化：每支离心管分别加入 20 L 内标（ 1， 7 二氨基氢烷 25mg/kg）， 1、 2、 3、 4、5、加标管分别加入 100 LNaOH（ 2mol/ml），每支离心管分别加入 300 L 饱和 NaHCO3，每支离心管分别加入 2ml 单酸氯（ 1.00g 融于 100ml 丙酮）。 1.4.12 使用 Maxi Mix（漩涡振荡器）震荡后放入 40烧箱，放置 45min。 1.4.13 取出后每支离心管加入 100 L 氨水，放置 40min。然后用乙晴定容至 5ml，震荡过膜。 1.5
18、 色谱条件 通过 加入高氯酸柱前衍生的方法， 以 40 rmnol L pH 5 50 的柠檬酸钠缓冲液作为流动相，用 C18 柱，流速为 1 0 mL min 色谱条件进行检测 。 本科毕业论文 材料与方法 4 1.6 本章小结 在选取样品的时候采取选择不同公司的产品，采样的范围更加的广阔。样品刚刚取出时都是冷冻的。由于室温不够为了节省时间可开启空调加速解冻。实验所用的离心管和比色管等玻璃仪器清洗完后用蒸馏水再次清洗一次，然后在烘干才能使用。均质时候先对样品进行均质，加标的放在最后进行。每均质一份样品都要用水将均质器清洗一遍，以免对下一份样品数据产生影响。对于离心机的选择，本实验选取了 冷冻
19、离心机（ Universal 320R），冷冻离心相对于常温离心而言得到的数据更加的精确。在经过 2 次提取后，对样品进行定容，由于将上清液移取到比色管（ 25ml）时候不可避免的会带入一些沉淀物。定容时候视线的平视点应该对准液面的凹点，沉淀物不能计算在内。在将样品放入烧箱进行衍生时间为 45min，这里的时间是指烧箱里温度达到 40开始计算的时间。所以事先应当将烧箱打开温度调到 40，等烧箱温度稳定了之后再放入样品。在使用漩涡震荡时候注意力度的掌握，不需要太重，直至离心管中溶液出现漩涡即可保持力度，不需要在用力下压。最后装瓶时候用 1ml 注 射器吸取，过膜注入测试瓶中。每去一份样品换一只注
20、射器。 本科毕业论文 实验结果与分析 5 2 实验结果与分析 2.1 标准曲线 下图中图 1、图 2、图 3、图 4 分别对应标准曲线曲线 1、曲线 2、曲线 3、曲线 4 分别加入 100 L、 200 L、 500 L、 1000 L 组胺标准液（ 10 g/ml）的液相色谱图。比较图 1、图 2、图 3、图 4 看出第一次出峰的时间为 10.6min。结束时间为 11.4min。第二次出峰时间为 13.2min，结束时间为 14.0min。第一次出峰的峰面积呈线性关系。对应 100 L、 200 L、 500 L、 1000 L。可得出 第一次出峰的物质为组胺。第二次出峰的峰面积都在 13.58 13.70 之间。可以得出第二次出峰的物质为实验加入的试剂。 图 1 图 2 本科毕业论文 实验结果与分析 6 图 3 图 4 通过微积分将曲线 1、曲线 2、曲线 3、曲线 4 分别加入 100 L、 200 L、500 L、 1000 L 组胺标准液（ 10 g/ml）的标准曲线高效液相色谱图进行积分得到图 5。由微积分得到曲线 1、曲线 2、曲线 3、曲线 4 的线性关系下图 6。通过曲线 1、曲线 2、曲线 3、曲线 4 的线性关系得到标准曲线图 7。
