1、 本科毕业论文 （ 20 届） 海洋细菌的分离及抗水产病原弧菌的筛选 所在学院 专业班级 生物科学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 目录 目录 摘要 . I Abstract . II 引言 . 1 1 材料与方法 . 4 1.1 材料 . 4 1.1.1 仪器与设备 . 4 1.1.2 药品与试剂 . 4 1.1.3 样品 . 4 1.1.4 指示菌 . 5 1.2 实验方法 . 5 1.2.1 制备培养基 . 5 1.2.2 样品处理 . 5 1.2.3 涂布接种分离海洋细菌 . 5 1.2.4 平板划线纯化 . 5 1.2.5 菌种保存 . 6 1.2.6 纯化菌种菌落
2、的观察 . 6 1.2.7 建立简易菌种库 . 6 1.2.8 海洋细菌菌液制备 . 6 1.2.9 抗弧菌海洋细菌的筛选 . 6 2 结果与分析 . 8 2.1 海洋细菌的分离 . 8 2.2 抗 弧菌海洋细菌的筛选 . 10 3 讨论 . 13 3.1 海洋细菌培养基的选择 . 13 3.2 筛选具有抑菌作用细菌方法的选择 . 14 3.3 海洋细菌分离和筛选结果的分析 . 15 小结 . 16 参考文献 . 18 致谢 . 错误 !未定义书签。 I 摘要 摘要 采集中国东海舟山海域海底不同层次 9 个海泥样品，通过涂布平板培养分 离纯化得到海洋细菌 78 株。 采用滤纸片 琼脂扩散 法测
3、定 上述 分离 所得 海洋细菌对 鳗弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、费氏弧菌 5 种水产病害常见病原弧菌的抑制作用，获得具有抑制弧菌作用的海洋细菌 17 株，占 21.8%。其中 6 株菌株对费氏弧菌有明显的抑菌作用，占 7.7%； 7 株菌株对哈维氏弧菌的抑菌作用较显著，占 9.0%； 2 株菌株对创伤弧菌有明显的抑菌作用，占 2.6%； 2 株菌株对溶藻弧菌和鳗弧菌显示一定的抑制作用，各占 1.3%。研究结果表明，通过稀释培养法能分离到一定数量和种类的海洋细菌，且海泥的深度与海洋细菌的菌种分布 没有一定必然的关系；来自深海底泥的海洋细菌中存在较多的具有水产病原弧菌拮抗活性的菌株。通过
4、此次研究，认识病原弧菌对养殖业所带来的巨大危害，了解培养海洋细菌所适用的独特培养基，掌握传统筛选方法并比较各种方法的优缺点最后结合实际情况选择合适的方法来筛选。 关键词 海洋细菌；弧菌；筛选；抗菌作用 II Abstract Abstract： Seventy-eight strains of marine bacteria were isolated from nine samples of marine mud from sea floor in zhoushan, East China Sea. Antimicrobial activities of the strains isolat
5、ed were tested by Filter paper method. Seventeen strains of marine bacteria which is 21.8% of all were found to show antimicrobial activity. The antimicrobial activities of the strains isolated above against to V. furnissii were tested. There are six strains which account for about 7.7% were found t
6、o show high antimicrobial activity. The antimicrobial activities of the strains isolated above against to bacterium V .harveyi were tested. There are seven strains which account for about 9.0% were found to show high antimicrobial activity. The antimicrobial activities of the strains isolated above
7、against to bacterium V. Vulnificus were tested. There are two strainswhich account for about 2.6% were found to show high antimicrobial activity. The strain SH6-7 which account for about 1.3% were found to show high antimicrobial activity with the strains isolated above against to bacterium V. algin
8、olyticus were tested. The strain SH9-1 which account for about 1.3% were found to show high antimicrobial activity with the strains isolated above against to bacterium V.anguillarum were tested. The results show that can be isolated to a certain number and variety of marine bacteria by dilution cult
9、ure. The depth of mud and distribution of marine bacteria species do not necessarily causal relationship. There are more bacteria with antagonistic activity of aquatic pathogenic Vibrio strains from the deep-sea sediment. From the study, there is an enormous harm of the breeding industry. The harm i
10、s brought by pathogenic Vibrio. And we can understand the cultured marine bacteria that are applicable to the unique cultureand and master traditional screening methods and compare the advantages and disadvantages of each method. At last with the actual situation we choose the appropriate method to
11、filter. Key words： marine bacteria; Vibrio spp.; isolation; antimicrobial activity 1 引言 弧菌病 Vibriosis是由弧菌属细菌 Vibrio spp.引起的一类细菌性疾病， 爆发性弧菌病具有传播快 ，传染率高的特点， 不仅给海水养殖鱼类、贝类及甲壳类等经济动物的养殖业造成巨大的经济损失，而且该病在全球范围内流行 ，目前已成为海水鱼类养殖最大的危害 【 1】 。其中溶藻弧菌 Vibrio.alginolyticus, 哈维氏弧菌 Vibrio.harveyi, 创伤弧菌 Vibrio. Vulnificus
12、, 费氏弧菌 Vibrio.furnissii及鳗弧菌 Vibrio.anguillarum都是水产养殖中常见的病原弧菌 【 2】 ，并且具有感染对象广泛，对象死亡率高的特点。 溶藻弧菌属于弧菌科，弧菌属，革兰氏阴性短杆菌无芽 孢、荚膜，单独存在或尾端相连成 / C0或 / S 0形为嗜盐嗜温性、兼性厌氧海生弧菌，适宜温度为 1735 【 3】 。溶藻弧菌广泛分布于世界各地海水及河口处 【 4】 ，为海洋中正常菌群之一，存在于多种海洋动物中，是鱼、虾、贝等海水养殖动物的条件致病菌。溶藻弧菌为嗜温菌，其对养殖动物的致病性多发生在夏季 【 5】 ，在水温 25 32下容易流行 【 6】 ，另外动物
13、体免疫机能下降或环境恶化时也容易发生 ,如台湾一些学者研究了虾在氨氮 ( 1. 10 21. 60 mg/ L)【 7】 、亚硝氮( 1. 12 21. 40 mg/ L)【 8】 Cu2+( 1 20 mg/ L)【 9】 胁迫下对溶藻弧菌的敏感情况 , 结果表明虾的免疫力降低、 死亡率升高。此外溶藻弧菌对人的致病性也有大量报道 ,可引起人食物中毒 【 10】 、耳炎 【 11】 等等。 哈维氏弧菌是一种革兰氏阴性、发光的海洋细菌（并非所有菌株），菌体呈弧状，极生单鞭毛 【 12】 。它广泛分布于近岸温暖的海水、海洋沉积物、海洋动物的体表、海洋发光鱼类和头足类动物等各种海洋场所，也是许多海洋
14、脊椎动物和无脊椎动物的正常菌群 【 13】 。它是最近 10 多年才被认识到的水产养殖动物的重要致病菌。哈维氏弧菌 既是印尼、泰国、 印度、澳大利亚、厄瓜多尔及中国 (包括台湾 )等国家和地区养殖对虾的重要致病菌。目前，哈维氏弧菌的致病机理尚不十分清楚，国内对哈维氏弧菌致病性的研究也刚刚起步。多年以来，它也曾被命名为哈维氏发光杆菌 (Lucibacteruim harveyi ) 和哈维氏贝内克氏菌。随后， Baumann 等 【 14】 于 1980 年将其命名为哈维氏弧菌，并于 1981年被确认 【 15】 。 2 创伤弧菌为非霍乱弧菌，以前称贝内克菌属 ( beneckea vulnif
15、ica)，是嗜盐性海生革兰氏阴性菌杆菌属， Roland【 16】 在 1970年首先报道由创伤弧菌感染引起小腿坏疽和内毒素性休克。 Hollis等 【 17】 在 1976年随后报道从血液中培养分离该细菌 ,并且鉴定为乳酸阴性嗜盐弧菌。 1979 年 Farmer【 18】 将它再命名为创伤弧菌。从那时起，美国、荷兰、丹麦、西班牙、以色列、土耳其、 我国台湾等一些沿海城市相继有创伤弧菌感染的临床报告。而且国外有关创伤弧菌感染的临床报道以及研究逐渐增多，然而在国内大陆沿海关于创伤弧菌感染的病例报道十分罕见。 费氏弧菌是一种生长在海洋中的革兰氏阴性菌，普遍存在于海洋环境及海洋生物体中，是 某些海
16、洋鱼类的致病菌 【 19】 ，对费氏弧菌的日益重视源于它的发光现象，研究人员发现当菌群密度达到一定阈值时费氏弧菌会产生集体发光现象；后来的研究表明此生物发光现象是因为一自诱导剂的积累引起的；微生物通过该自诱导剂进行相互交流，启动相关基因的表达，从而引起微生物表型的变化 【 20】 。同时费氏弧菌也是一种常见的致病菌。 鳗弧菌为有鞭毛的革兰氏阴性细菌，无荚膜，不形成芽孢，能运动，具有典型的弧菌属细菌特征。莫照兰等报道的导致牙鲆出血症的鳗弧菌呈短杆状，有 1根很长的极生单鞭毛，可运动；在 2216E培养基上培养 24h的菌 落呈圆形、半透明；在 TCBS培养基上培养 24h的菌落呈黄色。鳗弧菌是危
17、害鱼类的主要的条件性病原菌之一，能引起世界范围内的多种海水、淡水养殖鱼类及其他养殖动物发生弧菌病，也是我国鲈鱼、牙鲆、 大菱鲆等海水养殖动物的重要的病原菌，常给水产养殖业造成较大的危害 【 21】 。 目前，养殖基层对海水鱼类弧菌病的防治主要是依赖抗生素。抗生素是 由 微生物（包括 细菌 、 真菌 、 放线菌 属）或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类 次级代谢产物 ，能干扰其他生活 细胞 发育功能的 化学物质 。虽然抗生素使用方便、见效快和疗效好，但在实际生产中存在的盲目使用和滥用抗生素现象这不仅破坏了养殖环境微生态，导致耐药性生物的产生，而且 存在的药物残留也会危及人
18、类健康 【 22】 。 自从 美国在 1967年率先提出“向海洋要药 (Drug from the sea)”的口号开始 ,“蓝色药物”引起了各国的重视 ， 目前已从海洋微生物中分离到许多海洋生物活性物质，这些物质化学结构丰富多样，许多分子结构新颖独特，是陆地生物所不具有的。随着科学的不3 断进步及人们对抗生素存在的不足不断认识，在未来的时间里细菌素将取代抗生素发挥其极其重要的作用。细菌素是由细菌产生的通常只作用与产生菌同种的其他菌株或亲缘关系近的种的一种蛋白类抗菌物质。它是一种多肽与糖和脂的复合物，但许 多广谱细菌的发现，细菌素的概念得到了扩大 【 23】 。 1925年 , Gratia等
19、 【 24】 发现大肠杆菌的 V菌株产生的代谢物能抑制菌株的生长，随后 Gratia和 Fredericq对 V菌株分泌物质进行分离研究，发现是一种物质在起作用， Fredrericq称这种物质为大肠杆菌素。这是首次对细菌素进行的报道，随后发现在其他革兰氏阴性菌中这种现象。 1928年 Rogers L A等首次在革兰氏阳性菌中发现类似于大肠杆菌素的代谢物 【 25】 ， 1933年 Whitehead H R等 【 26】 从乳酸菌分离出一类细菌素，在 1947年将其命名为尼生素 ( nisin)【 27】 。 1952年， Jacob【 28】 建议将这种细菌代谢物称为细菌素，并且用其产生
20、菌来进行命名。 Fredrericq等 【 29】 (1957, 1963年 )建立一系列完整的大肠杆菌素的检测、 分析以及分型方法。同时 Fredrericq及其同事对细菌素产生的遗传机制进行了研究，表明产生细菌素的基因可以从一个细胞传递到另一个细胞中。 DiMasi等 【 30】 1973年证明了产生细菌素的基因由一个可以转移的因子编码。 1953年 ,由乳酸菌分泌产生的尼生素首先在英国上市，随后在 48个国家开始利用尼生素 【 31】 ， 1988年尼生素通过美国 FDA批准作为食品添加剂。 2000年片球菌素 PA-1作为一种肉制品添加剂，可以杀死肉类中单核增生李斯特菌 (L. m o
21、nocy togenes)，在美国及欧洲的国家得到应用。由于单一的细菌素作用范围窄，将多种细菌素混合使用作为食品保护剂能够取得更好的抗菌效果。近些年来由于细菌素在商业上的成功，许多国家掀起研发细菌素的热潮 【 32】 。 毋庸置疑，来自海洋的活性物质如细菌素必将解决在水产养殖病害防治上做出巨大贡献。海洋的活性物将在未来的世界中发挥的作用将 是任何物质无法取代的。 本研究从东海舟山海域深海底泥中 分离筛选 有抑制 溶藻弧菌 ，哈维氏弧菌，创伤弧菌，费氏弧菌及鳗弧菌的海洋细菌，目的在于为后期进一步分析提取抗菌物质且分析抗菌物质的理化性质及在水产病害防治的潜在应用进一步研究提供基础资料。 4 1 材
22、料与方法 1.1 材料 1.1.1 仪器与设备 YXQ-LS-50A 型压力蒸汽灭菌锅，上海云泰仪器仪表有限公司； SB JC IA 型超净工作台，上海博迅实业有限公司医疗设备厂； HHS 型电热恒温水浴锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；恒温培养箱，上海 -恒科学仪器有限公司； ZHWY211B 型 摇床，上海智城分析仪器制造有限公司； PH070A 型干燥箱，上海 -恒科学仪器有限公司； BS124S 型电子天平，塞多利斯科学仪器 (北京 )有限公司； DPWS-T-20L/H 型超纯水器，杭州永洁达净化科技有限公司；可调式封闭电炉，上海锦凯科学仪器有限公司。此外还有锥形瓶（容量 200m
23、L， 250mL， 500mL 中国医药（集团）上海化学试剂公司）；烧杯（容量 50mL， 100mL， 500mL， 1000mL，国药集团化学试剂有限公司）；量筒（容量 50mL， 100mL， 500mL 中国医药（集团）上海化学试剂公司）；陶瓷杯（容量 1000 ml）；玻棒。 1.1.2 药品与试剂 琼脂，蛋白胨，胰蛋白胨， 酵母提取物，氯化钠，氯化高铁，陈海水， 5 mol/L NaOH， 0.1 mol/L HCl。 1.1.3 样品 2007 年 4 月 - 7 月从中国东海海域舟山海区海底采集底泥样品 9 个，按样品的水深度及海泥层次来源分别标记 SH1-SH9， -70冰箱
24、保存。其中 SH1 来自水深为 79 米的海底 0 3cm泥层； SH2 来自水深为 47 米的海底的 0-3cm， 3-5cm的泥层； SH3 来自水深为 33 米的海底 0-3cm， 3-5cm， 5-8cm， 8-10cm 的泥层； SH4 来自水深为 26 米的海底 0-2cm， 2-4cm， 4-6cm， 6-10cm 的泥层； SH5 来自水深为 36 米的海底 3-5cm 的泥层； SH6 来自水深为 40 米的海底 3-5cm， 5-8cm的泥层； SH7 来自水深为 50 米的海底0-3cm， 3-5cm， 5-8cm， 8-10cm 的泥层； SH8 来自水深为 8 米的海
25、底 0-3cm， 3-5cm，5-8cm， 8-10cm 的泥层； SH9 来自水深为 10 米的海底 0-3cm， 3-5cm， 5-8cm， 8-10cm的泥层。 5 1.1.4 指示菌 指示菌溶藻弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、费氏弧菌及鳗弧菌由浙江海洋水产研究所提供。 1.2 实验方法 1.2.1 制备培养基 1） LB 培养基（指示菌培养基）： 胰蛋白胨 10g/L，酵母提取物 5g/L， NaCl 10g/L，琼脂 15g，去离子水， pH 为 7.6-7.8， 121灭菌 30min【 33】 。 2） Zobell 2216E 培养基（海洋细菌分离培养基）：蛋白胨 5g/L，酵母提
26、取物1g/L，氯化高铁 0.11g/L，琼脂 15g/L，陈海水， pH 为 7.6-7.8， 121灭菌 30min【 34】 。 3）海洋细菌活化培养基：上述液体 Zobell 2216E 培养基。 1.2.2 样品处理 制备土壤稀释溶液：称取土样 10 g， 放入盛有 90 mL 无菌陈海水并带有玻璃珠的锥形瓶中，振动约 20 min，使土样与水充分混合，将细菌分散。再用一支 1mL 移液枪从中吸取 1 mL土壤悬液加入盛有 9 mL 无菌陈海水的大试管中充分混匀，然后用移液枪从此试管中吸取 1 mL 加入另一个盛有 9 mL 无菌陈海水的试管中，混合均匀，即制成稀释度为 10-1。以此
27、类推再制成 10-2， 10-3二种不同稀释度的土壤溶液 【 35】 。按以上步骤分别对采集的泥样、水样制备土壤稀释溶液。 1.2.3 涂布接种分离海洋细菌 将 10 ml40左右的已灭菌过的 LB培养液倒入灭菌过的培 养皿中，静置冷却，待其凝固。再用无菌移液枪分别由 10-1， 10-2， 10-3土壤稀释液中各取 0.1 mL 对号放入相应稀释度的培养基平板中，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置 510 min，培养基充分吸收菌液后将其放于 20下倒置黑暗培养 20天 【 36】 。 1.2.4 平板划线纯化 菌株培养过程中，每天观察菌落生成情况，并根据菌株生长速度及菌落
28、特征，对长出来的菌落进行标记后再进行无菌操作挑选单菌落，然后在 Zobell 2216E 平板培养基上作 Z 字连续划线。之后将其放于 20黑暗中倒置培养。按照上述方法 连续进行划线培养 23 次。最后得到的单菌落即为纯化后的菌株。 6 1.2.5 菌种保存 配制 Zobell 2216E 固体培养基，等培养基冷却至 50左右时，将培养基灌入试管中至试管的 1/3 左右。将试管培养基 121灭菌 20min，之后制成试管斜面培养基。对已生长好的纯化的单落菌种接种至空白斜面培养基上。经接种好的空白斜面培养基置于20黑暗培养。待菌株长好后，将其放于 4的冰箱中保存（保存 16 个月）。 1.2.6
29、 纯化菌种菌落的观察 观察纯化后海洋细菌菌株的单个菌落的外观特征，并记录下菌落的大小、颜色、干湿情况、形状（折皱、平坦、隆 起）、透明程度、边缘状况（光滑情况，规则情况）等。 1.2.7 建立简易菌种库 根据记录下的菌落具体的特征，建立东海舟山海域海洋细菌的简易菌种库 【 37】 。 1.2.8 海洋细菌菌液制备 配制 1000ml左右的 Zobell 2216E液体培养基，将其分装于 100ml的锥形瓶（ 50ml左右）中，再 121灭菌 20min。无菌操作挑取分离出的海洋细菌一环各自接种灭好菌的液体培养基中，密封， 25， 140r/min，振荡培养 48h【 38】 。 1.2.9 抗
30、弧菌海洋细菌的筛选 配制 500mlLB液体培养基，将其分装于 100ml的锥形瓶（ 50ml左右）中 ，再 121灭菌 20min。将 5种指示菌接种于灭好菌的培养基中，振荡培养过夜。制成指示菌的菌液。 采用 滤纸片法 ，分别以鳗弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、费氏弧菌、创伤弧菌为指示菌。将供试指示菌的菌液，取 0.15ml 滴在平板中心部位，再倒入 10ml 40左右的 LB 培养基，均匀混合，凝固制成含指示菌的平板培养皿。制备直径 5mm 的三层滤纸片，置于平皿内放于 160干燥箱中灭菌 12h。用灭过菌的滤纸片沾取待筛选的海洋细菌的菌液（经 48h 培养后的海洋细菌），将滤纸片贴在含指示菌的平板特定位置上。静置 2030min 后 ，再放于 25恒温培养 48h，定期观察滤纸片周围是否初选明显的抑菌圈。对于出现抑菌圈的菌株做好记录。
