1、 本科毕业论文 （ 20 届） 厚壳贻贝抗菌肽的分子多样性分析 所在学院 专业班级 生物科学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 本科毕业论文 目录 目录 摘 要 .I Abstract . II 引言 . 1 1 材料与方法 . 2 1.1 动物与试剂 . 2 1.1.1 实验动物 . 2 1.1.2 试剂 . 2 1.2 实验方法 . 2 2 实验结果与分析 . 4 2.1 厚壳贻贝血淋巴抗菌肽的分离纯化 . 4 2.2 厚壳贻贝血淋巴抗菌肽的质谱鉴定 . 6 2.3 厚壳贻贝血淋巴的抑菌活性 . 9 2.4 部分厚壳贻贝血淋巴抗菌肽的鉴定 . 10 3 讨论 . 12 3.
2、1 讨论 . 12 小结 . 15 参考文献 . 17 致谢 .错误 !未定义书签。 本科毕业论文 中文摘要 I 摘要 摘要 厚壳贻贝 （ Mytilus coruscus） 广泛分布于中国东部海域， 具有重大经济价值 ，是浙江省重要经济养殖贝类。厚壳贻贝的血淋巴中含有多种抗菌肽分子，为了了解血细胞和血清抗菌肽分子的组成特点，采用多维高效液相色谱（ HPLC）对厚壳贻贝血清及血细胞的抗菌肽进行分离纯化，从中鉴定了多种具有抗菌活性的抗菌肽分子。利用质谱鉴定结合 cDNA 文库数据分析表明厚壳贻贝血细胞和血清的抗菌肽主要属于 Mytilin 和Myticin 抗菌肽家族，分子量在 30007000
3、 Da 之间，此外还发现有分子量在 10000 Da左右的新型抗菌肽分子。厚壳贻贝血细胞和血清抗菌肽在分子组成、抗菌谱方面均存在差异。以上工作为深入了解厚壳贻贝 Mytilin 抗菌肽的分子多样性、了解厚壳贻贝的免疫机制以及从中筛选具有开发价值的抗菌肽分子奠定了基础。 关键词 厚壳贻贝；抗菌肽；血细胞；血清；质谱 本科毕业论文 英文摘要 II Abstract Abstract： Mytilus coruscus is widely spreaden all through the littoral extent of East China Sea and of important econo
4、mic value. Abundant peptides with antimicrobial activity were identified from hemocytes of mussel in previous works. To elucidate the compositive characterization of antimicrobial peptides from blood cell and serum of Mytilus coruscus hemocytes, high performance liquid chromatogram were used and sev
5、eral fractions with distinct antimicrobial activity were isolated from blood cell and serum of Mytilus coruscus, respectively. Mass spectrometry combined cDNA data analysis were performed to characterize the molecular mass and annotation of some peptides. Some of antimicrobial peptides identified in
6、 this work were considered belong to Mytilins or Myticins family with molecular mass ranged from 3000 to 7000 Da. The difference between blood cell and serum antimicrobial peptides mainly exists in molecular composition and antimicrobial spectrum. In addition, a novel peptide with strong antimicrobi
7、al activity was found in serum of Mytilus coruscus and the molecular mass of this peptide is more than 10000 Da. The results of this work build the foundation for further research on the molecular diversity of antimicrobial peptides, immune mechanisms of Mytilus coruscus, and screening for new pepti
8、des with applicable value. Key words： Mytilus coruscus; antimicrobial peptides; blood cell; serum; Mass spectrometry 本科毕业论文 引言 1 引言 抗菌肽是 一类由特定基因编码的具有抗菌活性的小分子多肽 ，分子量通常分布于20007000 Da 左右，由 2060 个氨基酸残基组成 1,它们广泛分布于整个生物界，在脊椎动物、无脊椎动物和植物中均有发现。至今已在各种生物中发现了 1200 多种抗菌肽。 低等生物由于缺乏特异性免疫系统，因而抗菌肽对于低等生物的免疫系统具有特别重要的意
9、义，同时，抗菌肽也因其高效的抗 菌活性而备受 研究者 关注 2。 海洋生物由于其特殊的生活方式和代谢方式，体内常常含有较多具有药用价值的生理活性物质。贻贝是浙江省的一种重要经济养殖贝类，其体内的 抗菌肽 作为非特异性免疫系统中十分重要的一类体液免疫因子， 是海洋生物抗菌肽研究中的 热门 内容，目前已从贻贝血细胞和血清中分离鉴定了 4种抗菌肽家族，分别为 Mytilin， Myticin， MGD 和Mytimycin，主要分离自地中海贻贝 （ Mytilus galloprovincialis） 和紫贻贝 （ Mytilus edulis） 3-7。 而厚壳贻贝是广泛分 布于中国东部沿海的一种
10、具有重要经济价值的贝类，对于其血淋巴中的抗菌肽研究目前尚不多见，在前期工作中，通过构建厚壳贻贝血细胞的 cDNA 文库，从中克隆了 Mytilin 和 Myticin 抗菌肽的基因家族 8-9。此外还从厚壳贻贝血清中分离鉴定了 3 种 Mytilin 抗菌肽的同分异构体 10。为深入了解厚壳贻贝血细胞和血清中抗菌肽分子的组成特点以及组成差异，可以采取高效液相色谱（ HPLC）以及质谱（ MS）分析方法，结合厚壳贻贝血细胞的 cDNA 文库数据分别对厚壳贻贝血细胞和血清的抗菌肽分子组成、抗菌活性等进行了研究。 本科毕业论文 材料与方法 2 1 材料与方法 1.1 动物与试剂 1.1.1 实验动物
11、 成年 厚壳贻贝（ Mytilus coruscus）采自浙江舟山 东极岛 海域 ， 以洁净海水在通氧条件下 饲养于恒温水族箱（ 1820 ） 。 1.1.2 试剂 三氟乙酸（ TFA）、 -氰基 -4-羟基 -肉桂酸（ CCA）来自于 Sigma 公司；所有测序试剂均来自 Applied Biosystems 公司；色谱纯乙腈购自美国 TEDIA 公司； 其余试剂均为进口或国产分析纯试剂。 试验 用 去离子水 由 Millipore synergy纯水系统（ 法 国 Millipore公司）制取。 抑菌试验所测试的菌种为该试验保存。 1.2 实验方法 1.2.1 厚壳贻贝的诱导与血淋巴的收集
12、 采集的厚壳贻贝经恒温（ 18-20）饲养 24 h 后，参照文献方法 4，用微量进样器向厚壳贻贝体内肌肉组织注射灭活的大肠杆菌进行诱导， 100L /只，重新放入海水中饲养。诱导 24 h后，以 内含抗凝剂（ Alsever Solution）的注射器 从后闭壳肌初插入贻贝体内 收集血淋巴，立即离心（ 4 ， 800g， 15 min）， 分别收集上清及沉淀。将上清部分以含 0.1%三氟乙酸（ TFA）的去离子水按 1:1 比例稀释后，调 pH 值至 3.75，低温（ 4 ）搅拌 20 min，离心 （ 4 ， 10000g， 20 min） ，随即收集上清保存于 -20冰 箱备用 ，弃沉淀
13、 ； 而血淋巴 沉淀部分以 PBS 缓冲液（ pH 值为 7.4） 洗涤后，再次离心后收集上清，使用光学显微镜检测。经显微镜下确认是厚壳贻贝的血细胞之后，参照文献方法 3，采取超声法完全破裂细胞，再经手持式组织匀浆器匀浆，匀浆液经离心（ 4 ， 10000g， 20min） 后收集上清，保存于 -20冰 箱备用 。 1.2.2 厚壳贻贝血淋巴抗菌肽的分离纯化 采用高效液相色谱对厚壳贻贝血淋巴抗菌肽进行分离纯化，所有分离步骤均在Waters 600E型高效液相色谱仪（美国 Waters 公司）上完成，检测器为 Waters 2487 型紫外检测器（美国 Waters 公司），检测波长为 280
14、nm和 254 nm双波长。 本科毕业论文 材料与方法 3 1.2.2.1 预分离 预分离使用的反相色谱柱为半制备型 C18 反相色谱柱（ SunfireTM Prep， 10250 mm， Waters 公司 ），上样后分别以含 0.1%TFA 的 5%乙腈、 45%乙腈和 90%乙腈洗脱，流速为 3 mL/min，柱温为 40，收集各浓度洗脱组分。收集的组分经冻干机冷冻干燥后进行抑菌活性测试。 1.2.2.2 分子筛分 离 预分离得到组分经抗菌活性测试挑选出具有抗菌活性的组分分别上样反相高效液相色谱做进一步分离，此次使用色谱柱为分析型 C18 反相色谱住 （ 218TP54， 4.6250
15、 mm， Vydac 公司） ，流动相分别为含 0.1%TFA 的水（ A）和乙腈（ B），流速为 1 mL/min，柱温为 40；血清样品的洗脱梯度为 40 min 内 B 液浓度由 15%增加到45%，血细胞样品的洗脱梯度为 40 min 内 B 液浓度由 5%增加到 60%。根据洗脱峰出峰顺序收集各洗脱组分，收集的组分经冻干机冷冻干燥后进行抑菌活性测试。 1.2.3 抗菌活性 检测 参照文献方法 3测定 各洗脱组分的 抗菌活性。 测试菌分别为藤黄叠球菌（ Sarcina lutea） ，枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis），哈维氏弧菌（ Vibrio harveyi），以
16、及 大肠杆菌（ Escherichia coli）。 Poor-Broth 液体培养基培养 测试菌 至对数生长期， 以 相应培养基稀释至 光密度值（ OD630） 为 0.001，在事先已经过 灭菌处理的 96 孔板 的每个孔中都加入90 L菌液 。 上述高效液相色谱分离后的各洗脱组分经冷冻干燥后， 以灭菌处理的纯水溶解， 经蛋白质定量（ Broadford 蛋白质定量试剂盒，美国 Bio-Rad 公司，以牛血清白蛋白做标准参照）后 ，将各多肽 组分 溶液加入 96 孔板中， 各 10 L， 使得样品终浓度为 100 g/mL，纯水作为阴性对照。然后用 灭菌处理 过 的锡箔纸覆盖 96 孔板，
17、 以防杂菌污染 。 每个样品设 3 组平行试验。 本科毕业论文 实验结果与分析 4 2 实验结果与分析 2.1 厚壳贻贝血淋巴抗菌肽的分离纯化 厚壳贻贝经灭活大肠杆菌诱导后，收集血淋巴，经离心分别收集血细胞部分和血清部分。将血细胞部分在光镜下进行检测，结果如图 2.1 所示，在 1000 倍光镜下，所收集的厚壳贻贝血细胞形态完整，可明显看出有透明 细胞以及颗粒细胞。 图 2.1 厚壳贻贝血细胞及细胞内颗粒经放大 1000 倍后的图谱 Figure 2.1 Mytilus coruscus hemocytes enlarge 1000 times 血细胞经超声波破裂及匀浆后，取上清液。将该上清液
18、上样反相高效液相色谱，分别经含 0.1%TFA的 5%乙腈、 45%乙腈和 90%乙腈洗脱，收集各洗脱组分。洗脱组分冷冻干燥后进行抑菌活性测试，测试结果表明在 45%乙腈洗脱的组分具有相对较好的抑菌活性。将该部分组分经冷冻干燥后再次上样反相高效液相色谱，本次使用分析型 C18色谱柱做进一步分离，结果见图 2.2A。观察图 2.2A 可见，血细胞中具有抑菌活性的组分成分复杂，包含有数十个洗脱峰，收集的各洗脱峰经冷冻干燥后分别进行抑菌活性检测。抑菌检测结果表明，图 2.2A 中所收集的各洗脱峰中，有 5 个洗脱组分具有明显的抑菌活性，这 5 个洗脱组分均在乙腈浓度 20%40%之间洗脱，分别命名为
19、 C1C5（图2.2A）。 本科毕业论文 实验结果与分析 5 图 2.2 厚壳贻贝血细胞及血清经分析型 C18 反相色谱分离后的图谱 A：厚壳贻贝血细胞经 45%乙腈洗脱后上样分析型 C18 反相色谱柱进一步分离的图谱，收集 5 个具有抑菌活性的 洗脱组分，命名为 C1C5； B：厚壳贻贝血清经 45%乙腈洗脱后上样分析型 C18 反相色谱柱进一步分离的图谱，收集 6 个具有抑菌活性的洗脱组分，命名为 S1S6。 Fig.2.2 The further C18 reversed-phase HPLC separation of Mytilus coruscus blood cell and s
20、erum A: The further C18 reversed-phase HPLC separation of Mytilus coruscus blood cell after 45% methyl cyanide elution collecting 5 elutions with antibacterial function named C1 C5; B: The further C18 reversed-phase HPLC separation of Mytilus coruscus serum after 45% methyl cyanide elution collectin
21、g 6 elutions with antibacterial function named S1 S6. 厚壳贻贝血清样品经酸抽提后，上样进入半制备型 C18 反相柱进行预分离，分别以含 0.1%TFA 的 5%乙腈、 45%乙腈和 90%乙腈洗脱，收集各洗脱组分，经冷冻干燥后进行抑菌活性测试，结果表明 45%乙腈洗脱的组分具有较强的抑菌活性，该部分组分经分析型 C18 色谱柱做进一步分离，结果见图 2.2B。观察图 2.2B可见，厚壳贻贝血清中具有抑菌活性的组分成分与厚壳贻贝血细胞中具抑菌活性的组分成分同样很复杂，包含有数十个洗脱峰。由于其峰型较杂，因此采取分部收集的方式，所收集的各洗脱峰
22、分别经冷冻干 燥后进行抑菌活性检测。该检测结果表明，图 2.2B 中所收集的各洗脱峰中，其中有 6 个洗脱组分具有明显的抑菌活性，这 6 个洗脱组分均在乙腈梯度20%30%之间洗脱，分别命名为 S1S6（图 2.2B）。 本科毕业论文 实验结果与分析 6 2.2 厚壳贻贝血淋巴抗菌肽的质谱鉴定 将上述步骤分离纯化后收集的具有抑菌活性的厚壳贻贝血细胞以及血清组分分别利用质谱进行分子量检测。厚壳贻贝血细胞的抑菌组分 C1C5 的质谱检测图谱见图 2.3，其分子量分布见表 2.1。观察图 2.3及表 2.1可见，厚壳贻贝血细胞中各抑菌组分的分子量主要分布于 30005000 Da 之间，少 数成分在 50007000 Da 之间。 图 2.3 厚壳贻贝血细胞抑菌组分 C1C5 的质谱分析图谱 Fig. 2.3 The Mass Spectrum Results of antibacterial component C1C5 of Mytilus coruscus blood cell
