1、 本科毕业论文 （ 20 届） 厚壳贻贝抗菌肽基因的真核表达 所在学院 专业班级 生物科学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 目录 目录 摘要 .I Abstract . II 引言 . 1 1 材料与方法 . 3 1.1 实验材料 . 3 1.2 试验方法 . 3 1.2.1 引物设计及 PCR 扩增 . 3 1.2.2 myticin 表达载体的构建与鉴定 . 4 1.2.3 表达载体的转化以及重组毕赤酵母的发酵 . 6 1.2.4 发酵产物的纯化与 tricine-SDS-PAGE 蛋白电泳检测 . 7 2 结果 . 10 2.1 目的基因的 PCR 扩增 . 10 2.
2、2 真核表达载体的构建 . 10 2.3 重组表达质粒毕 赤酵母表达产物的纯化与蛋白电泳分析 . 11 小结 . 13 参考文献 . 15 致谢 .错误 !未定义书签。 I 摘要 摘要 在抗菌肽研究中，贻贝抗菌肽占有重要的一席之地，也是目前海洋生物抗菌肽研究的重点。贻贝是一种常见的海洋生物，其血清中富含各种具有杀菌活性的多肽成分。 厚壳贻贝（ Mytilus coruscus）是我国东部海域广泛分布的具有重大经济价值的水产养殖贝类，其血淋巴中含有多种抗菌肽分子，但对于其抗菌肽的研究目前尚不多见。贻贝抗菌肽以其特殊的结构和高效抗菌活性而成为海洋生物抗菌肽研究的重要内容。但贻贝体内天然抗菌肽含量极
3、低，采用固相化学合成成本昂贵，因此，利用基因工程技术对抗菌肽进行表达成为获得大量 抗菌肽并进行后续研究的有效途径。在前期研究的基础上，我们以厚壳贻贝抗菌肽 myticin-3 为研究对象， pPIC9K 为载体，成功构建了myticin-3 的真核表达载体，并将其电转化到毕赤酵母 GS115 中进行表达，表达产物纯化鉴定结果表明，厚壳贻贝 myticin-3成熟肽基因在毕赤酵母 GS115中成功表达。 上述研究结果为进一步研究厚壳贻贝贻贝抗菌肽的抗菌机制和将来的开发利用以及采取基因工程手段批量表达厚壳贻贝抗菌肽 myticin奠 定了基础。 关键词 厚壳贻贝； myticin；真核表达；毕赤酵
4、母 GS115II Abstract Abstract In the antimicrobial peptide study, mussel antimicrobial peptides occupy an important place, is currently the focus of the study of marine biological peptides. Mussel is a common marine life, rich in a variety of serum bactericidal activity of the peptide with composition
5、. Mytilus coruscus widely spreads all through the littoral extent of East China Sea with important economic value. Abundant peptides with antimicrobial activity were identified from hemocytes of mussel in previously works. Mussel antibiotic peptide has been increasingly popular in marine antibiotic
6、peptide researches for its unique structures and high performance of antibacterial activity. However, the abundance of natural antibiotic peptide is extremely low in mussels and the cost of chemical synthesis is quite large, hence the recombinant expression through genetic engineering becomes a reas
7、onable way to obtain enough antibiotic peptides for further researches. Antibiotic peptides myticin-3 from Mytilus coruscus was chosen as the research subject and the eukaryotic expression vectors were constructed and transformed into Pichia pastoris GS115 followed by expression. The identification
8、of expression product indicates that the gene of myticin-3 was expressed successfully in Pichia pastoris GS115. The results above and further investigation of these data may lead to better understanding of molecular responses of Mytilus coruscus hemocytes to infection and build the foundation for th
9、e quantity expression of antibiotic peptides myticin-3 from Mytilus coruscus through genetic engineering. Key words Mytilus coruscus； myticin； eukaryotic expression； Pichia pastoris GS115 1 引言 抗菌肽 (antibacterial peptides）广义上是指存在于生物体内具有抵抗外界微生物侵害、消除体内突变细胞的一类小分子多肽 1。抗菌肽是由生物细胞特定基因编码 ,经特定外界条件诱导产生的一类多肽， 其
10、广泛存在于动物的免疫细胞 (如吞噬细胞 )、各种脏器的粘膜、皮肤以及植物的花、果、叶中，具有防范病原菌入侵的突出作用。抗菌肽显示出高速的杀菌能力和广谱的抗菌活性，包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、寄生虫、包被病毒和肿瘤细胞 2。目前为止，已经分离出千余种抗菌肽 3。尽管来源、抗菌谱、结构各不相同，但大体上具有一些共同点。 当前，抗生素的大量使用致使抗药性（尤其是多耐药性）菌株产生，发展克服抗药性问题的新型抗生素显得越来越重要 4。由于抗菌肽具有小分子的特点 ,可以快速合成并易于大量存储 ,与特异性免疫反 应相比能更加迅速地对病原菌作出反应 ,使其成为生物机体先天性非特异性防御系统的重要组分
11、 5。此外 ,抗菌肽还具有稳定、水溶性好、抗菌机制独特、对高等动物正常细胞无害等特点 ,显示了在医学和农业上潜在的研究价值和应用价值。近年来，通过对贝类等无脊椎动物免疫系统的深入研究，发现贝类体液中富含多种抗菌肽。贻贝属于软体动物门 ,双壳纲 ,翼形亚纲 ,贻贝目 .其本身缺乏类似于高等脊椎动物那样的特异免疫系统，它们的免疫防御主要由细胞和体液免疫系统所组成 ,通过血细胞或淋巴细胞的吞噬、包囊作用排除异己的微生物和病原体。其体内富含各种具有杀菌活性的多肽成分 (抗菌肽 )这些抗菌肽构成了贻贝的天然防御屏障 ,其特殊的结构与高效的抗菌功能使其具有重要的理论研究价值和开发前景 ,是目前海洋生物抗菌
12、肽研究的重要对象 .抗菌肽被认为是贝类防御系统的主要成分之一 ,作为一种免疫因子在无脊椎动物中广泛存在 ,在生物体内迅速合成 ;具有广谱抗菌活性 ,对细菌、真菌、原生动物等都有作用 ,但对真核细胞无毒害性。而贻贝素又在贻贝抗菌肽中扮演了一个重要的角色 ,尤其是最近新发现其可以在活体内阻止病毒的感染 ,希望以后通过研究贻贝素的同分异构体之间抗菌活性的差异 ,有助于进一步扩大贻贝 素的抗菌谱。随着对水产养殖品种抗菌肽的分离、结构与功能的研究 ,改造并合成既具有稳定高效抗菌活性又具有特异抗菌谱且同时对宿主无害的抗菌肽基因 ,并通过基因工程在原核细胞、真核细胞或某些藻类中进行表达 ,以实现批量生产。
13、在抗菌肽研究中，贻贝抗菌肽占有重要的一席之地，也是目前海洋生物抗菌肽研究的重点。贻贝是一种常见的海洋生物，其血清中富含各种具有杀菌活性的多肽成分，根2 据其序列特征可归纳为 4 个家族，分别为 MGD(包括 MGD-1 和 MGD-2) 6,7, Mytilin(包括 Mytilin A， B， C， D 和 G1) 8,9, Myticin (myticin A,B)和 Mytimycin 10。目前已鉴定了超过 20 个成员，主要来自地中海贻贝（ Mytilus galloprovincialis)和紫贻贝(Mytilus edulis)等。在上述四种贻贝抗菌肽家族中， mytilin 和
14、 myticin 是发现成员最多，也是贻贝体内最重要的抗菌肽家族。 厚壳贻贝在我国东部海域广泛分布，是我国重要的经济贝类之一，但对于其抗菌肽的研究目前尚在少数，在前期研究的基础上我们构建了厚壳贻贝血细胞的 cDNA 文库 11，在这个基础上对厚 壳贻贝抗菌肽 myticin家族做了初步的基因克隆及序列分析，从中我们共得到 9 种 myticin 的 cDNA 序列。为了深入了解厚壳贻贝抗菌肽 myticin 的结构与功能，我们需要获得足够样品，所以我们构建厚壳贻贝抗菌肽 myticin-3 的真核表达载体，并将其电转化到毕赤酵母 GS115 进行真核表达。研究结果表明，抗菌肽myticin-3
15、 的真核表达载体构建成功且能够在毕赤酵母 GS115 中成功表达。上述研究结果为进一步研究厚壳贻贝贻贝抗菌肽的抗菌机制以及厚壳贻贝贻贝抗菌肽将来的开发利用奠定了基础。 3 1 材料与方法 1.1 实验 材料 我们所用的 Taq 酶来自 TaKaRa公司；表达载体 pPIC9K，毕赤酵母 GS115由湖南师范大学赠送， E.coli DH5为本实验室保存； DNA 纯化系统（ Cat.#A1330）和 PCR Clean-Up System（ Cat.#A9281）购于 Promega 公司、限制性内切酶 Not和 EcoR、T4DNA 连接酶为 Beyotime 产品、一站式 Tricine-
16、SDS-PAGE 电泳套装、酵母提取物、胰蛋白胨和琼脂粉购自于上海生工公司；三氟乙酸（ TFA）为 Sigma 产品；色谱纯乙腈购自美国 TEDIA公司； DEPC、氨苄青霉素（ Ampicillin）购自上海捷瑞公司。实验用去离子水由 Millipore synergy 纯水系统（美国 Millipore 公司）制取。 1.2 试验方法 1.2.1 引物设计及 PCR扩增 1.2.1.1 应用软件 Jellyfish 设计正反向引物 我们从厚壳贻贝抗菌肽 myticin 家族中选取编码 myticin-3 成熟肽的 cDNA 序列来设计正反向引物。 myticin-3F 为正向引物，在 5端
17、加入 GC 两个保护碱基，紧随其后是 EcoR内切酶识别位点 GAATTC，另外我们的目的基因需要插入 pPIC9K AOX1 基因（用于毕赤酵母 编码醇氧化酶，用来分解毕赤酵母代谢甲醇所产生的 H2O2）中。翻译从AOX1 基因 mRNA 的 5末端开始，目的基因插在 EcoR和 Not两个酶切位点之间，当翻译到达 EcoR酶切位点时，已经在此之前翻译产生了 Kex2 信号肽切割酶，会把起引导作用的信号肽切割下来。在这之后是 Ste13 信号肽酶切位点，但是接下来的 TACGAT及 EcoR的编码序列翻译所产生的假尿嘧啶核苷 胸腺嘧啶核糖核苷环、缬氨酸、谷氨酸和苯丙氨酸则无法切割，所以在引物
18、设计时需额外添加一个 Kex2 信号肽酶切位点GAGAAAAGA接在 EcoR酶切 位点之后，这样翻译产生的成熟肽可彻底解决多余的四个氨基酸残基的问题。反向引物 myticin-3R的设计原理与其相同。引物序列如下： myticin-3F： GCGAATTCGAGAAAAGACATTCGCATGCTTG myticin-3R： GCGCGGGCCGCTTACTTGCTGCAATTAAC 1.2.1.2 PCR扩增目的基因及琼脂糖凝胶电泳检测 从大肠杆菌 E.coli DH10B 菌液中提取质粒 pCMV sport6，根据前面设计的引物和质4 粒为模板进行 PCR，体系见下： 1) (NH4)
19、2SO4 Buffer 5.0 L 2) MgCl2 3.0 L 3) dNTP 1.0 L 4) 10mM 正向引物 1.0 L 5) 10mM 反向引物 1.0 L 6) 模板质粒 0.5 L 7) Taq DNA 聚合酶 0.5 L 8) 无菌 ddH2O 38.0 L 总计 50.0L 扩增条件： 95预变性 10min,95变性 1min， 55退火 1min， 72延伸 1min（ 30个循环） ,72延伸 10min. 配制 2%琼脂糖凝胶（ 1 TAE）， 6 L PCR 扩增产物 +1 L 6 Loading Dye，恒功率 7W，电泳 30min。紫外投射仪观察记录电泳结果
20、。 1.2.2 myticin 表达载体的构建与鉴定 1.2.2.1 pPIC9K 载体质粒的提取 我们使用 Promega 公司生产的 DNA 纯化系统进行 pPIC9K 质粒抽提，方法如下： 从 pPIC9K 大肠杆菌平板上挑取单菌落至装有 3mL 含 1%（体积比） Amp+的 LB液体培养基中， 37， 220r/min 振荡培养过夜； 1) 将菌液离心， 12000r/min， 5min，去掉上清后，倒置在滤纸上； 2) 加入 250 L 的 Cell Resuspension Solution（ CRA），反复吸打充分悬浮细胞； 3) 加入 250 L 的 Cell Lysis S
21、olution，上下颠倒四次混匀； 4) 加入 350 L 的 Neutralization Solution，立即混匀（上下颠倒四次）； 5) 离心 12000r/min， 10min； 6) 将 Spin Column 插入 Colletion Tube； 7) 将离心后 的上清转移入 Spin Column； 8) 离心， 12000r/min， 1min，去掉下液； 9) 加入 750 L Wash Solution，离心 12000r/min， 1min，去掉下液； 10) 加入 250 L Wash Solution，离心 12000r/min， 1min，去掉下液； 11) 离心
22、 12000r/min， 2min； 5 12) 将 Spin Column 插入 1.5mL 离心管中（ EP 管）； 13) 加入 100 L Nuclease-Free Water，离心 12000r/min， 1min； 14) 丢掉柱子， 4保存。 取 2 L 质粒进行 1%琼脂糖 凝胶电泳检测。 1.2.2.2 PCR 产物与质粒 pPIC9K 双酶切与连接 将上面得到的 PCR 产物采用 Promega 的 PCR 产物纯化试剂盒纯化，具体过程如下 1) 加入等体积 MBS 到 PCR 产物中； 2) 将 SV 柱插入收集管中；将加了 MBS 的 PCR 产物转入 SV 柱中，室
23、温下孵育5min； 13000r/min， 1min，去下液； 3) 加入 700L MWS， 13000r/min， 1min，去下液； 4) 加入 500L MWS， 13000r/min， 5min，去下液； 5) 再 13000r/min， 1min； 6) 将 SV 柱小心插入干净 1.5mL EP 管中； 7) 加入 适量的 N-F Water 到 SV 柱中，室温温育 5min， 13000r/min， 1min； 8) 弃 SV 柱， 4 保存样品。 PCR 纯化产物与质粒 pPIC9K 分别用 Not 和 EcoR 进行双酶切， 37 ， 3h 以上，酶切体系如下： A pP
24、IC9K 空质粒、 PCR 纯化产物 24.0L B Not 1.5L C EcoR 1.5L D Buffer 0 3.0L 30.0L 酶切产生再次使用 PCR 产物纯化试剂盒纯化。之后，酶切纯化产物用 T4DNA 连接酶进行连接反应， 16 过夜，连接体系如下： A连接酶 Buffer 5.0L B PCR 双酶切纯化产物 3.0L C pPIC9K 双酶切产物 1.0L D T4DNA 连接酶 1.0L 10.0L 1.2.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 1) 在 LB 平板（胰蛋白胨 10g/L，酵母提取物 5g/L， NaCl 10g/L， Agar 15g/L，NaOH
25、调 pH 值至 7.0， 121高压灭菌 30min）上接种大肠杆菌 DH5菌种，6 37培养过夜； 2) 挑取单克隆至 1mL LB 液体培养基中， 37摇床培养（ 240250r/min），之后转到 50mL LB 培养液中，培养至 OD600nm 0.30.6，停止培养； 3) 冰水浴放置 10min，之后分装到两个 50mL 离心管中， 4， 4000r/min，离心10min；倒去上清，沉淀中各加入 10mL 预冷的 0.1M CaCl2，吹打以悬浮细胞， 4冰浴放置 30min； 4) 4 ， 4000r/min ， 离心 10min ，去上清，沉淀中加入 2.1mL 预冷的0.1
26、MCaCl2+0.9mL 预冷的 50%甘油，混匀，冰浴放置 1h 以上； 5) 置 -70冰箱保存备用。 6) 吸取 10 L 连接液加入到大肠杆菌感受态细胞中，混匀，冰上放置 30min； 7) 之后转到 42水浴中静止放置 90s，再迅速放入冰水中 2min； 8) 向管中加入 400 L LB 液体培养基， 37， 200r/min，摇菌 45min；5000r/min，离心 5min，吸弃上清 400 L，剩下的 100 L 混匀，全部涂布到LB+Amp+平板培养基上， 37倒置培养 1216h。 1.2.2.4 菌落 PCR 检测及测序鉴定 挑取单克隆进行菌落 PCR 检测，阳性克
27、隆送上海美季生物公司测序鉴定，测序结果用 DNAStar 序列分析软件进行分析，经序列分析正确的克隆，用含 30%甘油的 LB液体培养基于 -70保种。 1.2.2.5 重组质粒的提取与线性化 采用 Promega 公司生产的 DNA 纯化系统提取大肠杆菌感受态细胞中的重组质粒 ，接着用 Bgl线性化酶，对重组质粒进行线性化，体系如下： 重组质粒 44 L， Buffer3 5 L， Bgl 1 L. 37孵育 3h 以上。 线性化产物纯化： 1) 加入两倍体积的无水乙醇， -20放置 30min； 2) 13000r/min 离心 10min，加入 70%乙醇 1mL， 13000r/min
28、 再离心 10min，去上清； 3) 自然干燥，加入 10 L 无菌 ddH2O 溶解， 4保存。 1.2.3 表达载体的转化以及重组毕赤酵母的发酵 1.2.3.1 毕赤酵母感受态细胞的制备 1) 在 YPD 平板（ Peptone 20g/L， Yeast extract 10g/L， Glucose 20g/L 和 Agar 20g/L， 121灭菌 15min）上接种毕赤酵母 GS115 菌种， 30培养 2-3 天； 2) 挑取单克隆于 3mL YPD 液体培养基中， 30， 250rpm/min，扩大培养 16-18h； 3) 以 1:25 的比例转入 50mL YPD 溶液中， 30， 250rpm/min 扩大培养，测OD600 在 1.1-1.3 之间，停止培养； 4) 将菌液转移至 50mL 无菌离心管内， 4， 1500g/min 离心 5min，收集细胞，用 25mL 预冷的灭菌水悬浮细胞；
