1、 本科毕业论文 （ 20 届） 厚壳贻贝三个野生群体遗传多样 ISSR分析 所在学院 专业班级 生物科学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 中文摘要 I 目录 摘要 . II Abstract . III 引言 . 1 1 材料与方法 . 2 1.1 实验材料 . 2 1.2 实验仪器 . 2 1.3 实验方法 . 2 1.3.1 厚壳贻贝基因组 DNA的提取 . 2 1.3.2 凝胶电泳检测 DNA . 3 1.4 实验设计 . 3 1.5 数据统计与分析 . 4 1.6 本章小结 . 4 2 结果 . 5 2.1 厚壳贻贝 DNA提取结果 . 5 2.2 ISSR-PCR扩
2、增结果 . 5 2.3 群体多样性分析 . 6 2.4 本章小结 . 7 3 讨论 . 8 3.1 厚壳贻贝群体间遗传多样性比较 . 8 3.2 厚壳贻贝群体间遗传距离比较 . 8 3.3 本章小结 . 9 小结 . 10 参考文献 .11 致谢 . 错误 !未定义书签。 中文摘要 II 摘要 摘要 利用 ISSR-PCR 技术对舟山、温州和福州三个野生厚壳贻贝群体 90 个个体进行遗传多样性分析。 3 个 ISSR 引物共获得 40 个扩增位点，其中多 态位点 39 个，多态位点比例 97.50%， 3个群体的多态位点分别为 35、 38、 34，多态位点比例分别为 87.5%、95.0%、
3、 85.0%， Nei 基因多样性分别为 0.3292 0.1694、 0.3233 0.1649、 0.28210.1852， Shannon 信息指数分别为 0.4857 0.2304、 0.4825 0.2168、 0.42460.2483。舟山群体与福州群体遗传距离最远（ 0.1323），舟山群体与温州群体次之（ 0.1276），温州群体与福州群体最近（ 0.0720）。结果表明 3个厚壳贻贝群体的遗 传多样性均较丰富，但是群体间地理遗传分化差异不明显。 关键词 厚壳贻贝； ISSR；遗传多样性 。英文摘要 III Abstract Abstract:To assess the gen
4、etic diversity of the wild Mytilus coruscus, Inter2 Simple Sequence Repeat ( ISSR) molecular marker was applied from Zhoushan,Wenzhou and Fuzhou. A total of 40 rep roducible DNA fragments were amp lified by the 3 ISSR primers from all the 90 individuals, in which 39 fragments were polymorphic, and t
5、he percentage of polymorphic loci was 97.50%. The polymorphic of 3 wild Mytilus coruscu population were 35,38 and 34.The percentages of polymorphic loci of three wild populations were 87.5% ,95.0% and 85.0% , respectively . The Neis gene diversity was 0.3292 0.1694,0.3233 0.1649 and 0.2821 0.1852, r
6、espectively . Shannons information indices were 0.4857 0.2304,0.4825 0.2168 and 0.4246 0.2483, respectively. The genetic distances of inter2 population were 0.1323, 0.1276 and 0.0720, respectively . The farthest genetic distance occurred between Zhoushan and Fuzhou populations, and the nearest betwe
7、en Wenzhou and Fuzhou. It showed that the three populations have high genetic diversity, but geographical genetic differentiation was not obvious among inter- population . The results also p rovided basic information for the protection and utilization of natural res ource of Mytilus coruscu . Key wo
8、rds:Mytilus coruscus ;ISSR; Genetic diversity. 引言 1 引言 厚壳贻贝是一种常见的海洋 生物 ,属于软体动物门、双壳纲、翼形亚纲、贻贝目。 贻贝作为一种优质的海产养殖贝类，易大量人工养殖，是我国传统的养殖贝类，有很高的食用价值，而且具有独特的保健功能。是我国目前主要的养殖品种之一，在山东、浙江、广东等沿海省份都有大面积的养殖，尤其在浙江舟山 ,其养殖产量极大。关于贻贝的报道主要集中在营养价值 1-2、养殖育苗 3-4 、生理发育 5-6等方面，而有关遗传学方面的文章较少。 ISSR (Inter-simple Sequence Repeats)，
9、即简单重复序列区间，是 Zietkiewicz等 18于 1994 年创建的一种 DNA 分子标记技术，具有模板需要量少，操作简单、稳定、可重复性好及多态性丰富等优点，此外还可以快速、高效和灵敏地检测出基因组 DNA的多态性。目前， ISSR 技术已广泛应用于植物品种鉴定、遗传作图、基因定位、遗传多样性、进化及分子生态学研究中 7-9。 ISSR inter simple sequence repeats 是一种新型微卫星类分子标记技术。这种技术扩增整个基因组并且具有操作简单、稳定、可重复性好及多态性高等优点 ,克服了 RFLP和 RAPD 的缺陷 ,是一种较好的指纹 库构建方法 ,对品种鉴定
10、和亲缘关系的分析具有重要作用 。该技术在文蛤 （ Meretrix meretrix）10、青虾 （ Penaeus chinensis ） 11等遗传多样性研究中已经得到了很好效果， ISSR技术在厚壳贻贝中的应用尚比较少。 ISSR分子标记技术即利用了基因组中丰富的 SSR序列信息，同时克服了 RAPD 标记稳定性较差、 RFLP 技术费用高、 AFLP 技术操作繁琐和 SSR 技术需预先根据其靶序列设计引物等缺点。 ISSR具有操作简单、标记重复性好、稳定程度高、多态性丰富、 DNA用量少以及成本 低等优点。 本研究以三个野生厚壳贻贝群体 DNA为模板，利用 ISSR分子标记技术 ,分析
11、了浙江舟山、浙江温州和福建福州 3个野生厚壳贻贝群体的遗传多样性 ,为进一步研究厚壳贻贝不同地理种群之间的遗传分化提供基础数据 ,同时也为我国厚壳贻贝种质资源的评价、保护和合理利用提供遗传学上的依据。材料与方法 2 1 材料与方法 1.1 实验材料 实验用三个野生厚壳贻贝群体样本分别从浙江舟山、浙江温州、福建福州码头附近海鲜市场购买，取下闭壳肌，用酒精保存，带回实验室 4 摄氏度保存。 Taq 酶、 10PCR Buffer 缓冲液、 25mmol/L MgCl2、 2.5mmol/L dNTPs、电泳 Marker、 6Loading-Buffer 、蛋白酶 K；无水乙醇、 STE 缓冲液、
12、 SDS、 Tris 饱和酚、氯仿、异戊醇、 5mol/L NaCl 溶液、琼脂糖、 EB染色液、去离子水。 1.2 实验仪器 立式高压蒸汽灭菌锅（ YXQ-LS-OS11 型，上海博讯实业有限公司）； PCR 仪（ PTC-200 型， BIO-RAD）；移液器（ 1000l、 200l、 100l、 10l、 2.5l， 国产金花牌）；水平电泳仪（ DYY-8C 型，北京六一仪器厂）；电子天平（ EL104 型， METTLER-TOLEDO）；数显水浴锅（ HH-6 型，国华电器）；凝胶成像系统（ VH II 型， BIO-RAD）；冷冻离心机（ GL-16G-II 型，国产飞鸽牌）。
13、1.3 实验方法 1.3.1 厚壳贻贝 基因组 DNA的提取 1. 剪取小块的厚壳贻贝肌肉组织 0.1g放入 2000 lEP 管； 2. 加 600l 的 STE缓冲液 +60l的 SDS(10%)，剪碎后加 6l 的蛋白酶 K； 3. 55水浴消化 3-3.5h，至溶液澄清，无沉淀（其中前半个小时消化时，每5min 摇一次，使溶液充分混合，充分消化）； 4. 加入 330l氯仿 /异戊醇二相混合液（氯仿：异戊醇 =24:1） +330l (等体积 ) Tris 饱和酚 ，缓慢摇晃 15min，使之充分混合； 5. 离心，控温 4， 12000rpm，离心 15min； 6. 取上清至新的离
14、心管重复 4、 5步骤两次（等体积 2 相 +1相混合）； 7. 加入等体积的二相（氯仿：异戊醇 =24:1）充分，缓慢摇晃 15min，控温4， 12000rpm，离心 15min； 材料与方法 3 8. 取上清加入新的离心管中，加入 1/25 体积的 5mol/L NaCl 溶液 和 2.5 倍体积无水乙醇（ -20），充分混匀（摇 15min）， -20下静置 1h 后离心15min； 9. 去上清，留沉淀，加入 70%酒精（ -20）摇晃几次，静置 7-8min， 控温4， 12000rpm，离心 8min； 10. 重复第九步一次，去上清，留沉淀，使酒精挥发干，加入 100l 灭菌去
15、离子水， -4保存。 1.3.2 凝胶电泳检测 DNA 1. 1%琼脂糖凝胶制备， 1.0 克的琼脂糖，加入 100ml 的 0.5 TBE，微波加热，至溶液 澄清即成 1%琼脂糖凝胶； 2. 倒平板，等待胶冷却成型，倒胶的时候注意胶内不能有气泡，以免影响胶成像的效果； 3. 混合 2.5l 6 Loading-buffer 和 5lDNA 溶液； 4. 控制电压 100V，电泳分离 40min； 5. 将电泳之后的 凝胶放入 EB溶液中染色 20min； 6. 紫外凝胶成像系统观察结果，拍摄照片。 1.4 实验设计 依据加拿大哥伦比亚大学公布的第 9套 ISSR引物序列，共 100条，引物由
16、上海英骏公司合成。初次筛选引物时，从 100条 ISSR引物中筛选出扩增产物稳定、条带清晰、重复性好且多态性丰富的 3条引物对群体进行 PCR扩增。 表 1 本实验用到的引物及其序列 Table 1 Primers NO., sequences and TM value in the experiment 引物编号（ Primers NO.） 引物序列号（ Primers sequences） 816 CAC ACA CAC ACA CAC AT 817 CAC ACA CAC ACA CAC AA 873 GAC AGA CAG ACA GAC A 用已筛选出的 3条引物（如表 1）对群体进
17、行 PCR扩增， PCR扩增在 Biometra PCR 仪材料与方法 4 上进行。总反应 25 L,内含 10 Taq Buffer 2.5 L、 25mmol/LMg2 + 2.0 L、10mmol/L dNTPs 0.5 L、 10 mol/LPrimer 1 L、 5U / L Taq 酶 0.2 L、 30ng/ L 模板 DNA 1.5 L,最终加灭菌双蒸水至 25 L。阴性对照不加模板 DNA。扩增程序为 95预变性 5min,接着 94变性 45s、 52退火 40s、 72延伸 90s共 38个循 ,最后在 72终延7min。产物在 1.5%琼脂糖凝胶上电泳分离，经溴化乙锭染
18、色，凝胶成像系统拍照记录结果 。 1.5 数据统计与分析 在琼脂糖凝胶电泳图谱上，同一引物扩增产物中电泳迁移率一致的条带被认为属于同一位点。进行人工读带，统计各个样品的扩增带，同一引物扩增的电泳迁移率一致的被认为具有同源性，即同一位点的产物， 有带记为 1，无带记为 0，建立 (0、 1)数据矩阵。并对下列指标进行统计分析。 （ 1）多态位点比例 P = 多态位点数 /位点总数 100%。 （ 2） Nei 的基因多样性 Xi2-1H 。 （ 3） Shannon 信息指数 I = - Xi Ln Xi，其中， Xi为位点 i在某一群体中的出现频率。以上分析采用 POPGENE Version
19、1.32软件进行统计。 1.6 本章小结 实验首先利用苯酚 -氯仿法提取三个群体厚壳贻贝的 DNA，提取结果比较理想。将所得的 DNA利用 816、 817和 873三条引物 进行 PCR扩增，扩增程序为 95预变性 5min,接着 94变性 45s、 52退火 40s、 72延伸 90s共 38个循 ,最后在 72终延 7min。产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳分离，经溴化乙锭染色，凝胶成像系统拍照记录结果 。 在琼脂糖凝胶电泳图谱上，同一引物扩增产物中电泳迁移率一致的条带被认为属于同一位点。进行人工读带，统计各个样品的扩增带，同一引物扩增的电泳迁移率一致的被认为具有同源性，即同一位点的产物，
20、有带记为 1，无带记为 0，建立 (0、 1)数据矩阵。并对下列指标进行统计分析。通过 POPGENE Version1.32软件分析获得相关遗传信息。 实验结果与分析 5 2 结果 2.1 厚壳贻贝 DNA提取结果 利用苯酚 -氯仿法提取三个群体 DNA，效果比较理想。 图 1 厚壳贻贝三个群体 DNA 琼脂糖凝胶电泳图 Fig.1 The agarose gel electrophoresis of wild Mytilus coruscus from three populations. 2.2 ISSR-PCR扩增结果 在筛选出的 3条引物中，共扩增出 40个清晰的扩增位点，其中多态性
21、位点 39个，多态位点率为 97.50%。 每个引物扩增的条带数为 12-15 条。扩增 片段大小在 2002000bp 之间。 3 个群体的多态位点分别为 35、 38、 34，多态位点比例分别为 87.5%、95.0%、 85.0%， Nei 基因多样性分别为 0.3292 0.1694、 0.3233 0.1649、 0.28210.1852， Shannon 信息指数分别为 0.4857 0.2304、 0.4825 0.2168、 0.42460.2483。舟山群体与福州群体遗传距离最远（ 0.1323），舟山群体与温州群体次之（ 0.1276），温州群体与福州群体最近（ 0.072
22、0）。结果表明 3个厚壳贻贝群体的遗传多样性均较丰富，但是群体间地理遗传分化差异不明显。 实验结果与分析 6 图 1 引物 873对厚壳贻贝舟山群体 20个个体的 PCR扩增结果 Fig. 1 PCR amplification results of 20 accessions of Mytilus coruscu from Zhoushan populations use primers 873 2.3 群体多样性分析 3个厚壳贻贝群体的多态位点比例、 Nei的基因多样性和 Shannon 信息指数结果 (表 2) 表 2 三个厚壳贻贝群体的遗传多样性结果 Table 2 Results o
23、f genetic diversity of three populations 群体 Populations 舟山 Zhoushan 温州 Wenzhou 福州 fuzhou 多态位点数 Polymorphic loci 35 38 34 多态位点比例 Ratios of polymorphic loci (% ) 87.5% 95.0% 85.0% Nei基因多样性 Neis gene diversity 0.3292 0.1694 0.3233 0.1649 0.2821 0.1852 Shannon信息指数 Shannons infor mati on index 0.4857 0.2304 0.4825 0.2168 0.4246 0.2483 结果表明 ,3个厚壳贻贝群体的多态位点比例比较，温州 舟山 福州； Nei的基因多样性和 Shannon信息指数都较 ,舟山 温州 福州。这说明 3个厚壳贻贝群体内个体间均具有较大的遗传差异 ,且舟山和温州群体比较突出。 3个厚壳贻贝群体间的遗传相似系数和遗传距离 (表 3)。结果显示 ,群体间的遗传距离较小。 表 3 三个厚壳贻贝群体的遗传相似系数 (对角 线上方 )和遗传距离 (对角线下方 )
