1、 本科毕业论文 （ 20 届） 龙头鱼遗传多样性的研究 所在学院 专业班级 生物科学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 本科毕业论文 目录 目录 摘要 .错误 !未定义书签。 Abstract .错误 !未定义书签。 引言 . 1 1 材料与方法 . 2 1.1 实验材料 . 2 1.1.1样品 . 2 1.1.2试剂 . 2 1.1.3主要设备 . 3 1.2 实验方法 . 4 1.2.2 PCR 扩增 . 5 2 实验结果与分析 . 7 2.1 数据处理 . 7 2.2 遗传多样性与遗传分化分析 . 8 2.3 遗传距离与遗传相似性指数分析 . 9 3 讨论 . 10 参考
2、文献 . 13 本科毕业论文 中文摘要 I 摘要 摘要 龙头鱼 是 我国沿海 常见的 一种 经济鱼类，然而其遗传多样性的研究还 刚刚起步 。SRAP (Sequence-related amplified polymorphism) 即相关序列扩增多态性 , 是 Li Shannon information index in ascending order of XS (0.3465), YQ (0.4042), ZH (0.4379), XM (0.4612); gene flow (Nm) values ranged from 0.7911 and 57.2349, the greater
3、 gene flow (Nm) the greater ,the lower the degree of genetic differentiation, ,however, all sites are small loci, which indicating a higher degree of population genetic differentiation. By comparison, polymorphic loci and Shannon information index were higher, gene flow (Nm) values was smaller, whic
4、h indicating four populations of Harpodon nehereus abundant genetic diversity. Using POPGENE software to calculate the genetic distance and the genetic similarity index of four populations of Harpodon nehereus: two population of Harpodon nehereus genetic similarity coefficient between the 0.8484-0.9
5、351, between genetic distance between 0.0364-0.1632.According to the genetic distance between the various populations, using UPGMA analysis to cluster analysis (Fig 1),we can see :four groups in the phylogenetic tree is divided into two groups, the XM and ZH populations ,as a group, the XS and YQ po
6、pulations as another group. Key words Harpodon nehereus ;SRAP ;genetic diversity 本科毕业论文 引言 1 引言 龙头鱼属狗母鱼科，龙头鱼属，也称虾潺。为广分布型鱼类，在我国南海、东海和黄海均有分布，是近海张网的主要渔获物之一。由于近年来海洋资源结构发生变化，龙头鱼资源富增。现龙头鱼已成为我国沿海常见的经济鱼类，且具有很高的经济价值，近年来越来越受到科研工作者的关注，但国内外对龙头鱼的研究仅限于形态分类、地理分布、年龄、生长和繁殖等生物方面，而对其遗传多样性的研究很少见。 SRAP(Sequence-related
7、amplified polymorphism)即相关序列扩增多态性 , 是 Li 和Quiros 1 发展的一种基于 PCR 的新型分子标记技术。 SRAP 标记原理是利用基因外显子里 G、 C 含量丰富，而启动子和内含子里 A、 T 含量丰富的特点设计两套引物，对开放阅读框架进行扩增。该标记具有简便、稳定、产率高、便于克隆目标片段的特点，并已被应用于图谱构建 13 、性状的标记 15,14 和遗传多样性分析 。该标记具有多态性丰富、简便、稳定、快速、成本低等特点 3,2 , 已被广泛应用于油菜 4 、桃 5 、野牛草 6 、西葫芦 7 、甜菜 8 、豌豆 9 、黄秋葵 10 、紫菜 11 等
8、植物的遗传多样性分析。目前已知Esposito 9 对相关豌豆性状的 SRAP 标记， Xiaoyan Han 19 对 ree peony bud sport 的描述，以及杨平 21 对 25 份来自四川高原的青稞育成品种进行了遗传多样性研究，王从彦 12 关于芫花遗传多样研究；以及 Budak 以野牛草为材料比较了 RAPD、 SSR、 ISSR和 SRAP 4 种分子标记技术的研究，表明 SRAP 有最丰富的多态性和很强的区分能力。这些研究均表明 SRAP 标记是一个研究遗传多样性的有效工具。一方面， SRAP 标记采用 PCR 扩增，不需要像 RFLP 标记那样要求高纯度和高浓度的 D
9、NA 或使用放射性同位素，减少了对试剂质量、仪器设备的要求，同时也减少了对实验操作人员身体方面的伤害；另一方面， SRAP 标记也不需像 RAPD 16 和 SSR 17 标记那样花费大量人力、物力进行引物设 计、开发，也不需像 AFLP 18 那样需要预扩增和连接，减少了对人力、物力的需求和依赖，多次重复试验结果稳定，克服了 RAPD重复性、稳定性差的缺点。最为重要的一点是 SRAP 标记比 RAPD 标记稳定且其多态性可与 AFLP 标记相媲美。 SRAP 标记技术现已广泛应用于植物的种质鉴定、亲缘关系的分析和遗传多样性的检测，但在鱼类中研究较少，为此， 本研究以 4 个 龙头鱼群体 作为
10、研究对象，利用 SRAP标记分析 龙头鱼 遗传结构和多样性，以期为后续的 龙头鱼种质资源分析提供理论依据。 本科毕业论文 材料与方法 2 1 材料与方 法 1.1 实验材料 1.1.1 样品 实验采用的 龙头鱼 采自 厦门（ XM）、珠海 (ZH)、象山 (XS)、乐清 (YQ)，每个群体选取 20 个样品 。 1.1.2 试剂 5M NaCl溶液： NaCl 73.1g 溶于 200mL 水中，定容至 250mL，高压蒸汽灭菌， 4保存； 70%乙醇溶液： 350mL 无水乙醇与 150mL 水混匀； 0.5M EDTA 溶液： EDTA 146.12g溶于 300mL 水中，加入少量 Na
11、OH浓溶液，使之完全溶解，加少量浓盐酸调整 pH 至 8.0，加水定容至 1000mL，分装成 500mL 后，高压蒸汽灭菌， 4 保存； 50TAE 缓冲 溶液： Tris 242g，冰乙酸溶液 57.1mL， 0.5M EDTA（ pH=8.0） 100mL，加水定溶至 1000mL； 10% SDS 溶液：电泳级 SDS 25g 溶于 200mL 水中（水浴加热至 68 ），加少量浓盐酸调整 pH 至 7.2，加水定溶至 250mL，高压蒸汽灭菌， 4 保存； 1M Tris-HCl溶液： Tris 121.14g溶解于 500mL 水中，加少量浓盐酸调整 pH至 8.0，加水定溶至 1
12、000mL； TE 抽提缓冲液： 5mL 1M Tris-HCl溶液， 10mL 0.5M EDTA 溶液，加水定溶至 500mL，高压蒸汽灭菌， 4 保存； TE 溶模板： 5mL 1M Tris-HCl溶液， 100uL 0.5M EDTA 溶液，加水定溶至 500mL，高压蒸汽灭菌， 4 保存； 蛋白酶 K（ 20mg/mL）： 20mg 可溶性蛋白酶 K 加入到溶解缓冲液（ 1mL 50mM Tris-HCl PH=8.0，加 0.237mg 乙酸钙，终浓度 1.5mM）中，充分溶解混匀，用 PCR 管分装成每管 100uL， -20 冷冻保存； 氯仿异戊醇（ 24:1）溶液： 4mL
13、 异戊醇溶于 96mL 氯仿溶液中，混匀 4 保存； 本科毕业论文 材料与方法 3 1.5%的琼脂糖凝胶：琼脂糖 0.45g放入锥形瓶中，加入 30mL 1TAE 缓冲溶液，置微波炉加热至完全溶解，取出混匀，则为 1.5%琼脂糖凝胶液。 冰乙酸：国药集团化学试剂有限公司 酚：国药集团化学试剂有限公司 异戊醇：国药集团化学试剂有限公司 蛋白酶 K：宝生物工程（大连）有限公司 乙二胺四乙酸（ EDTA）：北京鼎国生物技术发展中心 三羟甲基氨基甲烷（ Tris）：国药集团化学试剂有限公司 十二烷基硫酸钠（ SDS）：宝生物工程（大连）有限公司 去离子水：实验室自制 琼脂糖：中国医药上海化学试剂公司
14、氯仿：国药集团化学试剂有限公司 NaCl：国药 集团化学试剂有限公司 浓盐酸 ： 国药集团化学试剂有限公司 无水 乙醇 ： 国药集团化学试剂有限公司 乙酸钙： 国药集团化学试剂有限公司 以上试剂均为国产分析纯 20 ； 1.1.3 主要设备 （ 1） PCR 扩增仪： PTC-200 型 ,美国伯乐 BIO-RAD 公司 （ 2） BIO-RAD 凝胶成像仪： GDXI 型 ,美国伯乐 BIO-RAD 公司 （ 3）海尔冰箱（ 4 、 -20 ）：海尔 BCD-539WF 型 ,对开门 ,中国海尔集团 （ 4）上菱超低温冰箱（ -70 ）：上菱 BCD-123 型 ,上海上菱电器制造有限公司
15、（ 5） Gilson 移液器：量程为 2.5l、 10l、 20l、 100l、 200l、 1000l,法国 Gilson公司 （ 6） Thermo 排式移液枪：十二道可调式（ 0.510l） ,Thermo Electron Corporation （ 7）电子天平： BS-224S 型 ,北京奥多利斯仪器系统有限公司 （ 8）恒温金属浴锅： CHB-100 型 ,杭州博日科技有限公司 （ 9）超纯水器： direct-Q3UV,密理博（ MILLIPORE）公司 （ 10）美的微波炉： MM823ESJ-PA 型 ,广东美的微波炉制造有限 公司 本科毕业论文 材料与方法 4 （ 11
16、） LX-100 手掌型离心机：海门市麒麟以用仪器厂 （ 12）微型离心机： 200-020-001 型 , 北京百晶生物技术有限公司 （ 13） 250ml锥形瓶：中国医药（集团）上海化学试剂公司 （ 14）烧杯：量程 500ml,国药集团化学试剂有限公司 （ 15） 100ml量筒：中国医药（集团）上海化学试剂公司 （ 16）高速台式冷冻离心机： GL-166-II 型 ,上海安亭科学仪器厂 (17)MUPID-exu 最便捷的水平电泳槽： Mupid-exu 型 ,日本 Mupid 公司 （ 18）移液器吸头： 0.1-10l,1-100l,10-1000l,北京金麦克生物技术有限公司
17、1.2 实验方法 1.2.2 DNA 提取 （ 1）组织裂解：选取 来自珠海、象山、乐清以及厦门的 龙头鱼样品， 剪取每条鱼的鳍条 。加入 50l 10% SDS 溶液，混匀后加入 5l 20mg/ml蛋白酶 K。离心管置于恒温金属浴锅中消化 3-4h,温度为 55 ，消化完全 (液体变澄清状）后取出冷却。 （ 2）酚 -氯仿法抽提：基因组总 DNA 的提取采用常规的 “酚 -氯仿 ”抽提法。上述裂解液中加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（ 25:24:1）溶液，轻摇 10-20min, 12000rpm（转/min）冷冻离心 10min，用扩口吸头移出含 DNA 的上清液 .重复上述步骤两次 ,直
18、至有机相之间无蛋白层为止。再次去上清液，加入等体积的氯仿异戊醇（ 24:1）溶液 , 轻摇 10min，12000rpm冷冻离心 10min，用扩口吸头小心吸出上层含 DNA 的水相。 （ 3）无水乙醇沉淀：加入 50l或 100l（ 1/10）体积的 3M/L NaAc 溶液和 2-3 倍体积的预冷的无水乙醇，上下颠倒数次，可见白色絮状 DNA， -20 沉淀 30min， 12000 转/min 冷冻离心 10min，弃上清液。用 70%乙醇溶液 300ml 清洗沉淀两次， 12000rpm冷冻离心 10min。弃上清液，自然干燥至乙醇全部挥发。加入一定灭菌的超纯水和0.5lRNase(1
19、00mg/l)， 4 冰箱保存备用 。 （ 4） DNA 检测：轻摇提取液，并用微型离心机稍微离心，至管壁液珠入底部。取样品 5l，上样缓冲液 1l，混匀后按顺序将混合液加入加样孔。于 MUPID-exu 最便捷的水平电泳槽 （日本 MUPID 公司产）中，时间为 30min，温度为 37 。电泳完成后，经溴化乙锭染色液染色 5min。 GDXI 型 BIO-RAD 凝胶成像仪拍照，电泳图。 本科毕业论文 材料与方法 5 1.2.2 PCR 扩增 1.2.2.1 PCR 反应体系 反应物 体积 /l 无菌 ddH2 0 14.3 10buffer(Mg2+） 2.5 25mM MgC12 2.
20、5 10mM dNTP 2 r 引物 1 f 引物 1 模板 DNA 1.5 5u/ul Taq 酶 0.2 配制体系时 ， 可在 1.5ml 离心管中加入 25 倍的上述反应液。然后分装进 30 个 PCR管 ， 置于美国伯乐 BIO-RAD 公司 PTC-200 型 PCR 扩增仪中反应。 1.2.2.2 PCR 反应程序 PCR 扩增在 PTC200TM 型 PCR 仪上进行 , PCR 反应程序依次如下 : 反应步骤与温度（ T/ ) 时间（ t） 循环（次） 预变性 94 5min 变性 94 1min 5 退火 53 1min 35 延伸 72 1min 延伸 72 5min 4
21、取 5l PCR 产物上琼脂糖电泳检测，确认 PCR 是否成 功。 用筛选出的 4 对 SRAP 引物（见表 1）组合对 4 个采 自 厦门（ XM）、珠海 (ZH)、象山 (XS)、乐清 (YQ)的龙头鱼群体共扩增出了 19 个清晰、稳定的多态性位点。 本科毕业论文 材料与方法 6 表 1 采用的 SRAP 引物名称及序列 Table 1 Adoption the name of SRAP primer and primer sequence f 引物 r 引物 me1 5 -TGAGTCCAAACCGGATA-3 em1 5 -GACTGCGTACGAATTAAT-3 me2 5 -TGA
22、GTCCAAACCGGAGC-3 em2 5 -GACTGCGTACGAATTTGC-3 me3 5 -TGAGTCCAAACCGGAAT-3 em3 5 -GACTGCGTACGAATTGAC-3 me4 5 -TGAGTCCAAACCGGACC-3 em4 5 -GACTGCGTACGAATTTGA-3 注： f引物 ：上游引物； r 引物 ：下游引物 Note: f引物 ： Forward primers;r 引物 ： Reverse primers 1.2.2.3 基因组 DNA电泳 检验 取扩增后的样品 5l,上样缓冲液 1l， 混匀后 按顺序将混合液加入加样孔。于水平电泳槽中 ， 时间为 30min， 电压 100V。电泳完成后 ， 经溴化乙锭（ EB）染色液染色 15min。于 GDXI 型 BIO-RAD 凝胶成像仪拍照 。
