1、 本科毕业论文 （ 20 届） 三疣梭子蟹 hyastatin 抗菌肽原核表达的构建 所在学院 专业班级 生物科学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 本科毕业论文 目录 目录 摘要 .I Abstract . II 引言 . 1 1 材料与方法 . 2 1.1 实验材料、试剂与仪器设备 . 2 1.1.1 实验材料预处理 . 2 1.1.2 实验仪器设备 . 2 1.1.3 实验试剂 . 2 1.1.4 引物 . 3 1.2 方法 . 3 1.2.1 三疣梭子蟹血淋巴细胞总 RNA 的提取 . 3 1.2.2 目的基因 RT-PCR扩增 . 3 1.2.3 添加接头 . 4 1
2、.2.4 扩增产物纯化 . 5 1.2.5 目的基因片段克隆载体的构建 . 5 1.2.6 pET-28a 原核表达载体的构建 . 6 2 实验结果与分析 . 9 2.1 三疣梭子蟹血淋巴细胞总 RNA 的提取 . 9 2.2 目的基因扩增 . 9 2.3 克隆载体的构建 . 10 2.4 表达载体的构建 . 10 2.5 本章小结 . 11 3 讨论 . 12 3.1 目前常用的抗菌肽重组表达技术 . 12 3.2 抗菌肽在大肠杆菌中表达的影响因素和优化策略 . 12 参考文献 . 14 致谢 .错误 !未定义书签。 本科毕业论文 中文摘要 I 摘要 摘要 抗菌肽 Hyastatin 是 S
3、perstad 等 42009 年首次在蛛形互爱蟹 (Hyas araneus)血细胞中纯化鉴定的一种对 G+/G-菌、真菌均有抑制活性的新型抗菌肽 ， 其 C 端结构域与对虾抗菌肽 Penaeidins 同源 ， 也有 6 个保守的 Cys 残基 ， 形成 3 对分子内二硫键 ， 因此 Hyastatin 属于 Penaeidins 家族抗菌肽。 本实验室在前期的研究中从 三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus) 血细胞 中也克隆到了一个 与蛛形互爱蟹 Hyastatin 同源 、 但结构存在显著差异的新型 Hyastatin (命名为 Pthyastatin) 抗菌肽
4、全长 cDNA 序列 ，为研究Pthyastatin 的理化性质与生物学功能，本研究 采用 Trizol 法提取 三疣梭子蟹 血细胞 总RNA， RT-PCR 扩增目的基因，以 pET28a 为表达载体、大肠杆菌 Transetta 和 BL21 两菌株为宿主细胞，采用原核表达体系表达重组抗菌肽 rPthyastatin。研究结果表明：三疣梭子蟹总 RNA 的抽提、目的基因片段的 RT-PCR 扩增、克隆载体的构建、 pET28arHyastatin 表达载体的构建 等研究均 获得成功。本研究为抗菌肽 Pthyastatin 的重组表达及抗菌肽 Pthyastatin 后续的理化性质及生物学功
5、能研究奠定了良好的基础。 关键词 三疣梭子蟹； 抗菌肽 ； Pthyastatin；原核表达 本科毕业论文 英文摘要 II Abstract Abstract： Sperstad and other antimicrobial peptides Hyastatin is the first time in 2009, Hyas araneus in the blood cells of a purified and identified on the G + / G-bacteria, fungi have the inhibitory activity of new antimicrobia
6、l peptide, the C-terminal domain and homologous peptide Penaeidins shrimp, there are six conserved Cys residues, forming three pairs of intramolecular disulfide bonds, so Hyastatin family of antimicrobial peptides are Penaeidins. In the previous study in our laboratory from Portunus trituberculatusi
7、n the blood cells are cloned to form a mutual love with the spider crab Hyastatin origin, but there are significant differences in the structure of new Hyastatin (Pthyastatin) full-length cDNA antimicrobial peptide sequence for the study of Pthyastatin physical and chemical properties and biological
8、 functions, this study extracted using Trizol portunus blood cell total RNA, RT-PCR amplification of the target gene to the expression vector pET28a, Escherichia coli BL21 Transetta and two strains of host cells , the use of recombinant prokaryotic expression system of antimicrobial peptides rPthyas
9、tatin. The results show that: trituberculatus the extraction of total RNA, gene fragments amplified by RT-PCR, cloning vector, pET28a-rHyastatin expression vector and the success of such studies. This study of recombinant peptide expression and antimicrobial peptides Pthyastatin Pthyastatin subseque
10、nt physical and chemical properties and biological function of laying a good foundation. Key words： Portunus trituberculatus; Antimicrobial peptides; Pthyastatin; Prokaryotic expression 本科毕业论文 引言 1 引言 抗菌肽又称抗微生物肽（ antimicrobial peptide），广泛存在于生物界是天然免疫防御系统的一部分。是生 物先天免疫的重要防御物质 , 是一类极具潜力的肽类抗生素 。抗菌肽和抗生素杀菌
11、机制完全不同，抗生素作用位点为特定的受体，容易导致变异 ;抗菌肽作用时没有特定靶点，可以通过物胞膜穿孔，线粒体攻击，分解细胞骨架，损伤核染色体等多种途径抑杀靶细胞，因此不易发生耐药。根据抗菌肽作用对象不同，可以分为抗细菌肽、抗真菌肽、抗肿瘤肽、既抗细菌又抗真菌的抗菌肽、既抗肿瘤又抗微生物的抗菌肽等类型。根据抗菌肽来源不同也可以将抗菌肽分为昆虫抗菌肽、两栖类抗菌肽、水产动物抗菌肽、哺乳动物抗菌肽、植物类抗菌肽等类型。根据氨基酸组成和结构特 征的不同，抗菌肽又可分为 4 类 :天蚕素 (杀菌肽， Ceeropins)类，防御素 (Defensins)类，富含脯氨酸的抗菌肽和富含甘氨酸的抗菌 (Gl
12、yeine rieh peptides)。抗菌肽可以通过以下 3 种途径获得：从生物体提取纯化；化学合成；构建抗菌肽基因工程菌株。由于生物体中抗菌肽含量低，提取难度大，对技术和成本要求高，难以规模化生产。化学合成多限于研究用途，对多肽合成则很昂贵，无法应用。比较而言，快速发展的基因工程技术则为抗菌肽开发利用提供了更有希望的契机。以细菌或酵母为宿主表达抗菌肽时，为克服抗菌肽对宿主的毒害作用，多采用融合表达策略，但仍有表达产物少、纯化效率低的问题。 Park 等 23分离得到 parasin1，分子量为 2000.4Da，氨基酸序列与组蛋白 Histone 2A 的 N 端完全相似。 Oren 等
13、 5从豹蝎中分离到 1 种 33 个氨基酸残基的抗菌肽，命名为 pardaxin。 1996 年， Schnapp 等首先从青园蟹的血细胞中分离得到 3 种具有杀菌作用的肽，其中分子量为 6.5kDa 肽富含脯氨酸。 Relf 等 3从岸蟹颗粒细胞中分离到 1 种11.5 kDa 的抗菌肽 .2006 年。该基因是甲壳动物中第 1 个被鉴定为主要在雄性生殖腺中特异性转录表达的抗菌肽基因，分子量约为 10.8 kDa，等电点 PI 为 6.09，为阴离子抗菌肽。 抗菌肽 Hyastatin 是 Sperstad 等 4(2009b)从蛛形互爱蟹 (Hyas araneus) 血细胞中纯化鉴定的一
14、种对 G+/G-菌、真菌均有抑制活性的新型抗菌肽 ,其 C 端结构域与对虾抗菌肽Penaeidins 同源 ,也有 6 个保守的 Cys 残基 ,形成 3 对分子内二硫键 ,因此 Hyastatin 属于Penaeidins 家族抗菌肽。本研究将为阐明该基因的表达特性和进一步探 索该抗菌肽的免疫机制奠定基础。 本科毕业论文 材料与方法 2 1 材料与方法 1.1 实验材料、试剂与仪器设备 1.1.1 实验材料预处理 三疣梭子蟹 (Portunus trituberculatus)，采集自浙江舟山海域。 1.1.2 实验仪器设备 灭菌锅； 移液枪； 恒温摇床； 电子天平； 高速离心机； 恒温培养
15、箱； 电热恒温水浴； 电泳仪 （ DYY-6C） ； PCR 扩增仪 （ PE9700） ； 超净工作台 （ ZHJH-C1115C） 等。 1.1.3 实验试剂 琼脂糖； 70%乙醇； 无水乙醇； Trizol试剂 盒 ； LB 液体培养基； LB 固体培养基； 表达载体 pET-28a； DH-5感受态细胞； 3mol/ml PH5.2 NaAc； EasyPure Quick Gel Extraction Kit 试剂盒； 克隆载体 pEASY- Blunt Simple Cloning Vector。 本科毕业论文 材料与方法 3 1.1.4 引物 表 1-1 Tab 1-1 引物名称
16、 引物序列 （ 5- 3） EhyaS1 CGACGACAAGTACAACGCCAAGGT EhyaS2 TCGCGAATTCGACGA CGACGACAAG TAC EhyaR2 CTGCAAGCTTTCAGCCTTTGTAAGGGATTG T7 Primer TAATACGACTCACTATAGGG M13 Reverse Primer AACAGCTATGACCATG M13 Forward Primer GACGTTGTAAAACGACGGCC 1.2 方法 1.2.1 三疣梭子蟹血淋巴细胞总 RNA 的提取 选健康三疣梭子蟹断肢采血 10 ml，加入 10ml 抗凝剂（ NaCl 8
17、.2 g、葡萄糖 19.8 g、柠檬酸 6.3 g、柠檬酸钠 7.6 g、 EDTA3.7g， pH7.4，加蒸留水定容至 1L， 121 灭菌15min）， 3000 rpm离心 5 min，弃上清，用 marine saline 洗涤沉淀一次（ NaCl 33.9g、CaCl2 2.95 g、 KCl 0.90 g、 Na2HPO4 0.2 g、 Tris-碱 6.05 g， pH7.4，加水定容至 1 L，121 灭菌 15 分钟），加入 0.5 ml Trizol，用枪头抽吸混匀，用 1 ml针筒， 6#针头抽吸匀浆液两次以剪切基因组 DNA后移入 1.5 ml Eppendoff管（
18、 DEPC 处理），加 100 ul氯仿 /异戊醇（ 24 1），剧烈震荡混匀 30 sec， 12,000 rpm室温离心 5 min，将上清液（约450 ul）转移到 1.5ml离心管中，加 150 ul无水乙醇，混匀后转移到 UNIQ-10柱中，室温放置 2 min， 8,000 rpm室温离心 1 min，弃去收集管中的废液，将柱放回收集管中，加入 450 ul的 RPE Solution， 10,000 rpm室温离心 30 sec，再用 450 ul 的 RPE Solution洗涤一次， 10,000 rpm室温离心 15 sec，小心取出柱，放到无菌 RNAase-free 的
19、 1.5 ml离心管里，在柱内膜的中央小心加入 50 ul DEPC-H2O，室温或 5580 放置 2 min，10,000 rpm，室温离心 1 min。离心管内的溶液为 RNA 样品，测 OD260 和OD260/280，于 1%的琼脂糖凝胶检测。 1.2.2 目的基因 RT-PCR 扩增 根据表达载体 pET28a 序列和实验室克隆测定的 Pthyastatin 基因 cDNA 核苷酸序列设计引物，引物由上海捷瑞生物技术公司合成 ,引物序列见 下表 。 RT-PCR 实验步骤按上海捷瑞生物技术公司 AMV 一步法 RT-PCR 试剂盒操作说明进行。 上游引物： EhyaS1： 5- C
20、GACGACAAGTACAACGCCAAGGT - 3； 下游引物： EhyaR2： 5- CTGCAAGCTTTCAGCCTTTGTAAGGGATTG - 3。 本科毕业论文 材料与方法 4 1. 加下列组分倒置于冰上的小离心管中。如果同时进行多个反应可将各组分混合到一管中，然后再分到各个管中。 表 1-2 Tab 1-2 组分 加入体积 终浓度 2RT-PCR Buffer 25ul 1 模板 RNA 4 ul 10pg1ug EhyaS1（ 10umol/L） 1ul 0.2umol/L EhyaR2（ 10umol/L） 1ul 0.2umol/L RT/Taq Mix 1ul 无菌双
21、蒸水 18ul 至 50ul 2. 轻轻混匀，可稍离心确保所有组分都在管底，如需要可在上面覆一层石蜡油，然后进行热循环。 3. 进行热循环扩增： 表 1-3 Tab 1-3 1 循环 3740 cDNA 合成 3045 分钟 94 预变性 2 分钟 3540 循环 PCR 扩增 94 变性 15 秒 5560 退火 30 秒 6872 延伸 1 分钟 /kb 1 循环 72 延伸 510 分钟 4. 1琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物。 1.2.3 添加接头 1. 将下列组分加入置于冰上的小离心管中 ,模板为一次 PCR 产物 50 体系 表 1-4 Tab 1-4 组分 加入体积 PCR Buff
22、er 5ul 模板 2ul Pfu Taq 0.5ul dNTP 2ul EhyaS2（ 10umol/L） 1ul EhyaR2（ 10umol/L） 1ul 无菌双蒸水 38.5ul 2.轻轻混匀，可稍离心确保所有组分都在管底，然后进行热循环。 3.进行热循环扩增： 本科毕业论文 材料与方法 5 表 1-5 Tab 1-5 1 循环 94预变性 5min 25循环 PCR 扩增 94变性 30s 53退火 30s 72延伸 1min 1 循环 72延伸 7min 4.1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物 1.2.4 扩增产物纯化 PCR 扩增产物的纯化按 Easy Pure PCR Purifi
23、ction Kit 试剂盒操作 1. 将反应液移至干净的 1.5 ml 离心管中，加入 3 倍体积的 Binding Buffer I 混匀； 2. 把混合液转移到套放于收集管的 UNIQ-10 柱中，室温放置 2 min，离心 6000rpm 1min； 3. 取下 UNIQ-10 柱，倒掉收集管中的废液，将 UNIQ-10 柱放入同一 个收集管中，加入 500 ul Wash Solution， 8000 rpm，室温离心 1 min； 4. 重复步骤 3 一次； 5. 取下 UNIQ-10 柱，倒掉收集管中的废液，将 UNIQ-10 柱放入同一个收集管中，12000 rpm室温离心 15
24、 s； 6. 将 UNIQ-10 柱放入一根新的 1.5 ml 离心管中，在柱子膜中央加 30 ul 去离子水，室温或 37 放置 2 min； 7.12000 rpm 室温离心 1 min，离心管中的液体即为回收的 DNA 片段，储存于 -20 。 1.2.5 目的基因片段克隆载体的构建 目的基因片段克隆载 体为 pEASY-Blunt simple vector， 操作步骤按试剂盒说明书描述进行。 1. 连接 在微型离心管中依次加入溶液： PCR 产物 0.5-4 l， pEASY- Blunt Simple Cloning Vector 1 l，轻轻混合，室温 (20 -37 ) 反应
25、5 分钟。反应结束后，将离心管置于冰上。 2. 转化 (1) 加连接产物于 50 l E. coli DH5 感受态细胞中（在感受态细胞刚刚解冻时加入本科毕业论文 材料与方法 6 连接产物），轻弹混匀，冰浴 20-30 分钟。 (2) 42 热激 30 s，立即置于 冰上 2 min。 (3) 加 250 l 平衡至室温的 SOC/LB， 200 转， 37 孵育 1 小时。 (4) 取 8 l， 500 mM IPTG， 40 l， 20 mg/mL X-gal混合，均匀地涂于准备好的平板上，在 37 放置 30 分钟。 (5) 待 IPTG， X-gal 被吸收后，取 200 l 菌液铺板
26、，培养过夜（为得到较多克隆， 4000 rpm 离心 1 min，弃掉部分上清，保留 100-150 l，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板，培养过夜）。 3. PCR 方法鉴定阳性重组子 (1) 挑选白色克隆至 10 l 无菌水中，涡旋混合。 (2) 取 1 l 混合液用作 PCR 反应的模板，用 M13 F 和 M13 R 鉴定重组子。 (3) PCR 反应条件： 94 预变性 10 分钟（裂解细胞，失活核酸酶）， 94 变性 30 s， 55 退火 30 s， 72 延伸（ 根据片段的大小确定延伸时间） 30 个循环， 72 后延伸 10 分钟。 (4) 1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。若载体
27、自连，通用引物扩增，自连带大小为101 bp。 4. 测序鉴定 确认包含重组子的克隆，扩大培养， 500 ul 菌液送上海美吉生物技术有限公司测序，测序引物为 M13 F/ T7 promoter 引物测序，进行序列分析。 1.2.6 pET-28a 原核表达载体的构建 1.2.6.1 克隆载体中目的基因片段的分离 （ 1）克隆载体质粒提取按 1.2.1进行 （ 2）按表 1-6加样酶切 表 1-6 Tab 1-6 Nuclease-free water 3 ul 10buffer TangoTM 1 ul DNA (0.5-1 ug/ul) 5 ul EcoRI 0.5 ul Hind 0.5 ul 混匀， 37，过夜 （ 3） 1%琼脂糖凝胶电泳检测
