1、 本科毕业论文 （ 20 届） 三疣梭子蟹血细胞微生物诱导前后数量变化研究 所在学院 专业班级 生物科学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 本科毕业论文 目录 目录 摘要 .I Abstract . II 引言 . 1 1 材料与方法 . 2 1.1 材料 . 2 1.2 试剂及仪器 . 2 1.2.1 培养基及试剂配制 . 2 1.2.2 仪器 . 2 1.3 方法 . 3 1.3.1 诱导菌的准备 . 3 1.3.2 注射用菌的准备 . 3 1.3.3 三疣梭子蟹的诱导和血细胞计数 . 4 1.3.4 数据统计 . 5 2 结果 . 6 2.1 对照组血细胞变化 . 6 2
2、.2 藤黄微球菌诱导后血细胞变化 . 6 2.3 副溶血弧菌诱导后血细胞变化 . 7 2.4 酵母诱导后血细胞变化 . 8 3 讨论 . 9 参考文献 . 10 致谢 . 11 本科毕业论文 中文摘要 I 摘要 摘要 近年来三疣梭子蟹 （ Portunus trituberculatus） 病害呈现逐年上升趋势，成为制约该产业健康发展的重要因素。 一般认为，甲壳动物的成熟血细胞由透明细胞、小颗粒细胞和大颗粒细胞组成。甲壳动物的大颗粒细胞具有酚氧化酶原系统，在受到免疫刺激后可以激活酚氧化酶原及具有细胞毒作用；小颗粒细胞具有包囊作用和有限的吞噬作用；透明细胞主要具有吞噬功能。但在不同微生物感染后，
3、是由那一类型细胞发挥主要作用，或是不同类型细胞协同清除目前还不清楚。本研究通过注射藤黄微球菌，副溶血弧菌及酵母菌三种不同类型微 生物，观察统计三疣梭子蟹血细胞的动态变化，推导不同类型血细胞在清除不同类型微生物中的地位，为研究血细胞的功能奠定基础。研究中注射微生物量为 20ul，浓度为 107个 /ml，在微生物诱导前及诱导后 0.5h、 1h、 2h、 4h、 8h、16h、 24h、 48h， 分别从每组中随机选 3只梭子蟹抽取血细胞观察并计数。用 Excel处理数据并统计其是否具有显著变化，并作图分析得出最后结论。 实验结果显示 对照组与 3个诱导组血细胞的波动范围并不显著，没有哪个细胞群
4、在不同微生物的诱导中出现显著变化，表明三疣梭子蟹血细胞在免疫中可能是协调 作用的， 没有某种类型血细胞 在不同微生物 的清除 过程中起到主导作用。 关键词 三疣梭子蟹；血细胞；微生物诱导；数量变化 本科毕业论文 英文摘要 II Abstract Abstract In recent years, Portunus trituberculatus disease showed an upward trend year by year, as a constraint to the healthy development of the industry, an important factor.
5、Crustaceans blood cells are generally believed to be composed of granular cells, semi-granular cells and hyaline cells. Large crustaceans granulosa cells prophenoloxidase system, can be activated by immune stimulation prophenoloxidase, and the cytotoxic effect; small particles with the encapsulation
6、 and limited cell phagocytosis; key with clear cell phagocytosis . However, different microbial infection, by which types of cells play a major role, or different types of cells in combination with removal is unclear. In this study, injection of Micrococcus luteus, Vibrio parahaemolyticus, and three
7、 different types of yeast microbes, statistics Portunus trituberculatus observed the dynamic changes of blood cells, different types of blood cells derived clear the status of different types of microorganisms for studying the function of blood cells basis. In this study, microbial injection volume
8、20ul, the concentration of 107 / ml, respectively, after induction of the bacteria over 0.5h, 1h, 2h, 4h, 8h, 16h, 24h, 48h, randomly selected from each group selected three crab blood cells observed and counting. Process the data and statistics with Excel if it has significant changes, and mapping
9、analysis to draw final conclusions. The results showed that the control group and three induction groups of blood cells fluctuation is not significant, and no cell populations in different microbial induction of any significant changes, indicating that trituberculatus blood cells in immunity may be
10、the coordinating role, not in different microbes play a leading role during induction. Key words Portunus trituberculatus; haemocyte; Microbial induced; quantity change 本科毕业论文 引言 1 引言 三疣梭子蟹 （ Portunus trituberculatus） 是我国重要的经济蟹类 ， 南北沿岸浅海均产。 90年代起，由于虾病的暴发和流行，对虾养殖业受到很大冲击，许多地区开始寻找替代对虾这一主导养殖品种的养殖对象，三疣梭子
11、蟹作为一种优良的海 水甲壳类养殖品种正逐步成为海水养殖的主导产品，仅浙江省 2007年全省三疣梭子蟹养殖面积就达到58320亩，产量 26404吨，产值超过 20亿元。随着梭子蟹养殖业的进一步发展，养殖规模快速扩大，养殖面积和密度不断增加，加上日趋严重的养殖环境污染，使得梭子蟹病害亦呈现逐年上升趋势，成为制约该产业健康发展的重要因素 1。例如， 2001年浙江舟山市出现的暴发性梭子蟹疾病 “乳化病 ”，全市 3万亩养殖梭子蟹发病率达到 30%以上，死亡率达 100%，经济损失巨大。迄今为止，肌肉乳化病、固着类纤毛虫病和弧菌病等仍然困扰着三 疣梭子蟹养殖业发展。因此，如何有效提高三疣梭子蟹的自身
12、免疫力，提高其抗病能力，避免或减少由于用药所带来的负面影响，是目前三疣梭子蟹养殖中亟待解决的问题。研究三疣梭子蟹免疫防御系统组成，探索其免疫机制，可为寻找该难题的解决方案提供重要线索。 甲壳 动物 是无脊椎动物的一个重要类群，同时由于甲壳 动物中的 虾蟹类是大宗养殖品种，有巨大经济价值， 研究甲壳动物免疫系统的组成和免疫防御机理可为虾蟹类养殖病害防治及遗传育种提供理论依据和新的思路， 使得甲壳动物非特异性免疫防御机理领域的研究一直是热点问题。已有报道表明：甲壳动物非 特异免疫防御系统组成与其它无脊椎动物一致，可分为细胞免疫和体液免疫，而血细胞在这两种免疫方式中都起关键作用，一方面血细胞通过吞食
13、、包围化以及结节的形成，清除入侵微生物，另一方面部分体液因子如抗菌肽、酚氧化还原酶前体等是在血细胞中合成、储存、释放 2。一般认为甲壳动物的成熟血细胞由透明细胞、小颗粒细胞和大颗粒细胞等 3类组成 345。关于不同类型血细胞功能的研究在 20世纪 90年代之前较多，一般认为，甲壳动物的大颗粒细胞具有酚氧化酶原系统，在受到免疫刺激后可以激活酚氧化酶原，以及具有细胞毒作用678；小颗粒细胞也具有酚氧化酶原系统，具有细胞毒作用，并具有包囊作用和有限的吞噬作用 79108，透明细胞主要具有吞噬功能 111213。但在不同微生物感染后，是由那一类型细胞发挥主要作用，还是不同类型细胞协同清除目前还不清楚，
14、本研究拟通过注射不同类型微生物，观察统计三疣梭子蟹血细胞的动态变化，推导不同类型血细胞在清楚不同类型微生物中的地位，为研究血细胞的功能奠定基础。 本科毕业论文 材料与方法 2 1 材料与方法 1.1 材料 三疣梭子蟹购自舟山市北门农贸市场。 选择附肢完整、无伤口、健康活泼的三疣梭子蟹，体重 150 g-200 g/只， 25 海水暂养备用。 菌种来源：购于广微菌种保藏中心 1.2 试剂及仪器 1.2.1 培养基及试剂配制 10%甲醛的抗凝剂 （ Alsever s抗凝剂 ）： 27 mmol/L柠檬酸钠 ， 336 mmol/L氯化钠 ， 115 mmol/L葡萄糖 ， 9 mmol/L乙二胺
15、四乙酸 ， pH 7.0 LB液体培养基 ： 胰蛋白胨 Tryptone 10 g/L 酵母提取物 Yeast Extract 5 g/L 氯化钠 NaCl 10 g/L LB固体培养基 ： 胰蛋白胨 Tryptone 10 g/L 酵母提取物 Yeast Extract 5 g/L 氯化钠 NaCl 10 g/L 琼脂 15 g/L YPD液体培养基 ： 酵母膏 Yeast Extract 10 g/L 蛋白胨 Peptone 20 g/L YPD固体培养基 ： 酵母膏 Yeast Extract 10 g/L 蛋白胨 Peptone 20 g/L 琼脂 20 g/L 1.2.2 仪器 电子
16、天平（ BS124S 型，塞多利斯科学仪器 (北京 )有限公司）、台式恒温振荡器（ THZ-B）、无菌操作台（ ZHJH-C1209C 超净工作台）、电子显微镜（ YSZ-2）、制冰机（ SIM-F140AY65）、可调式封闭电炉（上海锦凯科学仪器有限公司），干燥箱（ PH070A 型，上海一恒科学仪器有限公司），高压蒸汽灭菌锅等。 本科毕业论文 材料与方法 3 1.3 方法 1.3.1 诱导菌的准备 1.3.1.1 培养基配制 液体培养基配制： 1. 在电子天平上准确称取胰蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，氯化钠 10 g； 2 加入 950 ml去离子水，在电炉上加热至完全溶解； 3
17、用 1 mol/l NaOH调 PH 7.0，定容至 1000 ml； 4 121 oC高压蒸汽灭菌 20 min。 固体培养基配制： 1. 在电子天平上准确称取胰蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，氯化钠 10 g，加琼脂 15 g； 2. 加入 950 ml去离子水，在电炉上加热至完全溶解； 3. 用 1 mol/l NaOH调 PH 7.0，定容至 1000 ml； 4. 121 oC高压蒸汽灭菌 20 min； 5. 待培养基冷却到 50 oC左右后倒平板； 6. 无菌操作台紫外灭菌 30 min后，靠近酒精灯将培养皿打开一小口，迅速倒入固体培养基约 15 ml，酒精灯灭菌后加盖；
18、7. 轻轻晃动培养皿使培养基均匀分布在培养皿底部。平放于无菌操作台上，待培 养基凝固。 1.3.1.2 菌种纯化 1. 将接种环浸在盛有酒精的烧杯中，将沾有少量酒精的接种环在火焰上燃烧，待酒精燃烧后，冷却 8至 10 s； 2. 靠近酒精灯火焰，用接种环沾取少量菌液均匀的在培养基表面划平行线。划线时可转动培养皿，使划线均匀； 3. 接种完毕后，盖上培养皿盖，将培养皿正面放置 30 min后倒置 37 oC培养过夜； 4. 观察生长出来的菌落的形态，并从平板上挑取单个菌落于含 3 ml液体培养基的试管中 37 oC 200 转 /min摇床培养过夜。 1.3.2 注射用菌的准备 1 取洁净的血球
19、计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片； 本科毕业论文 材料与方法 4 2. 从计 数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让菌液利用液体的表面张力充满计数区，勿产生气泡，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌液； 3. 静置片刻，使细胞沉降到计数板上，不再随液体漂移； 4 将血球计数板放置于显微镜的载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数； 5 计数得细菌浓度为 108 个 /ml，由于菌液浓度过大因此用无菌水稀释 10倍后备用。 1.3.3 三疣梭子蟹的诱导和血细胞计数 1.3.3.1 诱导前血细胞计数 1将 40只梭子蟹随机分成 4组，每组 10只
20、25 oC海水饲养备用； 2 用洁净的 1 mL一次性注射器吸取 0.1 mL用冰预冷的 10%甲醛固定液，然后从三疣梭子蟹的步足基关节处抽取 0.1 mL血淋巴液，混合至均匀； 3 取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片； 4从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让血淋巴利用液体的表面张力充满计数区，勿产生气泡，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余血淋巴液； 6 静置片刻，使细胞沉降到计数板上，不再随液体漂移； 7 将血球计数板放置于显微镜的载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区 后，再转换高倍镜观察并计 数。 1.3.3.2 菌液诱导 1用 1ml一次性注射
21、器抽取 20 ul藤黄菌液，注射到第一组的 10只梭子蟹中； 2 用 1ml一次性注射器抽取 20 ul酵母菌液 ， 注射到第二组的 10只梭子蟹中 ； 3 用 1ml一次性注射器抽取 20 ul副溶血弧菌菌液 ， 注射到第三组的 10只梭子蟹中 ； 4 用 1ml一次性注射器抽取 20 ul无菌水，注射到第四组的 10只梭子蟹中，作为对照组。 1.3.3.3 诱导后血细胞计数 注射菌液后分别过 0.5 h、 1 h、 2 h、 4 h、 8 h、 16 h、 24 h、 48 h，从每组中随机选 3只梭 子蟹抽取血细胞观察。 1. 用洁净的 1 mL一次性注射器吸取 0.1 mL用冰预冷的
22、10%甲醛固定液，然后从三疣梭子蟹的步足基关节处抽取 0.1 mL血淋巴液，混合至均匀 ； 本科毕业论文 材料与方法 5 2 取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片 ； 3 从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让血淋巴利用液体的表面张力充满计数区，勿产生气泡，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余血淋巴液 ； 4. 静置片刻，使细胞沉降到计数板上，不再随液体漂移 ； 5将血球计数板放置于显微镜的载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高 倍镜观察并计数 。 1.3.4 数据统计 本研究中的统计计算均在 Microsoft office的 Excel中进行
23、。 标准偏差 (Std Dev， Standard Deviation)按公式计算 用以衡量数据值偏离算术平均值的程度。标准偏差越小，这些值偏离平均值就越少，反之亦然。标准偏差的大小可通过标准偏差与平均值的倍率关系来衡量。 以 F检验 比较两组数据的方差，以确定他们的精密度是否有显著性差异。若两总体方差相等，则直接用 t 检验，若不等，可采用 t 检验。 T检验 是用于小样本（样本容量小于 30）的两个平均值差异程度 的检验方法。 计算公式： 它是用 T分布理论来推断差异发生的概率，从而判定两个平均数的差异是否显著。 本科毕业论文 结果与分析 6 2 结果 2.1 对照组血细胞变化 如图 1所
24、示，对照组诱导前后血细胞各类群的细胞总量未发现显著变化，表明实验条件稳定，实验组血细胞各类群的细胞量若发生显著变化，则有统计意义。同时血细胞各细胞群的比值也没有明显的变化趋势，基本保持恒定。 图 1 对照组诱导前后血细胞数量的变化 A. 对照组血细胞变化趋势图 ； B. 对照组血细胞百分率变化图 FIG 1. The control group before and after induction of changes in the number of haemocyte A. Changes in the control group trend of haemocyte; B. Percentage change in the control group Figure haemocyte 2.2 藤黄微球菌诱导后血细胞变化 如图 2 所示， G+藤黄微球菌 诱导前后血 细胞各类群的细胞量虽有先降后升再下降的运行趋势，但与诱导前相比，这种变化趋势没有显著变化，不具备统 计学意义。同时血细胞各细胞群的比值也没有明显的变化趋势，基本保持恒定。表明血细胞在清除 G+藤黄微球菌时可能是协同作用，并没有某种细胞起主导作用 。
