1、 本科毕业论文 （ 20 届） 一株共附生微生物对真菌性植物病害防治的试验 所在学院 专业班级 生物科学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 本科毕业论文 目录 目 录 摘要 .I 引言 . 1 1 材料与方法 . 2 1.1 实验材料 . 2 1.1.1 供试菌株 . 2 1.1.2 培养基 . 2 1.2 实验方法 . 2 1.2.1 共附生放线菌的分离 . 2 1.2.2 发酵及发酵液提取 . 3 1.2.3 发酵液提取物对植物病原真菌的抑制作用测定 . 3 1.2.4 发酵 上清液对白粉病病原真菌生长抑制的野外试验 . 3 2 结果 . 4 2.1 海葵共附生放线菌 DH
2、102 菌株的分离 . 4 2.2 海葵共附生放线菌 DH102 发酵液提取物对植物病原真菌抑制作用 . 4 2.3 海葵共附生放线菌 DH102 发酵上清液对白粉病病原真菌生长抑制的野外试验结果 . 5 3 讨论 . 7 3.1 海洋放线菌作为防治真菌性植物病害的潜力 . 7 3.2 海葵共附生放线菌 DH102 对植物白粉病的防治 . 7 参考文献 . 8 本科毕业论文 目录 附译文 . 错误 !未定义书签。 附译文原文 . 错误 !未定义书签。 致谢 . 错误 !未定义书签。 本科毕业论文 中文摘要 摘要 摘要 采用琼脂扩散法测定海洋放线菌 DH -102 菌株发酵液对 12 种植物病原
3、真菌的抑制作用。对未定种海葵进行共附生放线菌分离，共分离到共附生海洋放线菌 4 株 ，其中菌株 DH102 从海葵的触手部位分离到，由于发现该菌的菌液提取物有较好的抗虫作用 ,结果表明：菌株 DH102 的发酵液提取物的普遍对三株病原真菌有较好的抑菌效果，表现出较明显的抑制作用，其对 香蕉根霉腐烂病 病菌和番茄早疫病病菌抑菌圈分别为 12、 11mm；海葵共附生放线菌菌株 DH102 的发酵液以 1/3体积的 PBS 缓冲液稀释后，野外施用发现对狭叶十大功劳白粉病抑制效果不甚明显，两个月不定期的处理后病叶仍然较高， 但可以看得出白粉的斑状有所缩小 关键词 海洋放线菌；植物病原真菌；抑菌作用 本
4、科毕业论文 英文摘要 Abstract Abstract Agar diffusion method using marine actinomycetes DH -102 Strains on 12 species of plant pathogenic fungi. A total of undetermined species of sea anemones were isolated epiphytic actinomycetes were isolated from the epiphytic marine actinomycetes were 4 strains, including
5、 strains DH102 isolated from sea anemone tentacles to the site, due to the strain of the bacterium found in extracts of a more the role of a good insect, the results show that: strain DH102 extracts of the fermentation broth of the three pathogenic fungi generally have good antibacterial activity, s
6、howing a more pronounced inhibition of its banana pathogen Rhizopus rot and tomato early disease bacteria inhibition zone was 12,11 mm; anemones were epiphytic strain DH102 Actinomyces broth 1 / 3 volume of PSB buffer, diluted, field application of narrow-leaf Mahonia found to inhibit the effects of
7、 powdery mildew is not very clear, two months after the diseased leaves from time to time the treatment is still high, but yo u can see patchy white powder has narrowed Key words: marine actinomycete; botanic pathogenic fungi; antibacterial effect 本科毕业论文 引言 - 1 - 引言 随着陆生生物资源的减少 ,人们开始把目光转向其他生态系统 ,其中占
8、地球资源 71%的海洋更成为国内外新药研究的重点和热点海洋微生物资源极其丰富 ,而且在特殊的生存环境中 ,海洋微生物能产生结构新颖和功能天然的活性物质 ,越来越多的试验证明 ,海洋微生 物是海洋动植物活性物质的真正生物源。目前 ,海洋微生物活性物质研究发展迅速 ,国内外已有从放线菌、真菌、细菌、微藻等海洋微生物中分离出具有抗肿瘤、抗病毒、抗细菌、免疫调节功能以及其他用途的生物活性物质的相关报道 ,其中许多海洋生物代谢产物具有杀灭害虫、除杂草、抗农林业病原菌等多种作用 ,可用于生物农药的开发。有关专家预测 ,海洋微生物将会成为新的医用和农用抗菌素的重要资源。 病虫害是我国农林生产的大敌 ,据不完
9、全统计 ,近几年我国粮食产量因病虫害每年损失近 1000亿 kg, 占全年粮食的 1/ 10,而且受异常气候影响 ,我国农作物病虫害处于多发、频发、重发态势。人们已经开始意识到传统化学农药所造成的污染环境、损害人类健康、破坏生态环境等缺点 ,对生物农药的研究越发关注。海洋中蕴藏极其丰富的药用资源 ,而且很多天然产物特异结构和药理作用都是陆生生物无法比拟。现代药理研究表明 ,很多海洋微生物次生代谢产物具有较好的防治农业害虫效果。目前 ,国内外研究较多的主要是微生物杀虫剂、杀菌剂和农用抗生素。 本科毕业论文 材料与方法 - 2 - 1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 供试菌株 放线菌 D
10、H102菌株：由采自舟山东部朱家尖海域的海葵样品，从其触手处分离获得并保存 。 图 -1 采集的海葵样 Tab-1 Samples collected from sea anemones 植物病原真菌：所用三株植物病原真菌为：毛霉菌 (Mucor miehei)，番茄早疫病病菌 (Alternaria solani)，和 香蕉根霉腐烂病 病菌（ Rhizopus stolonifer）。由南京农业大学提供。 1.1.2 培养基 放线菌发酵培养基：发酵培养基用蛋白胨 10g, 酵母提取物 2g, 面粉 2g, 人工海水 1000ml, pH 7.8。 真菌抑制实验培养基：半海水配置的 PDA培养
11、基； 1.2 实验方法 本试验 于 2010年 8月到 2011年 3月进行。 1.2.1 共附生放线菌的分离 共附生放线菌的分离与同组翁周能同学的论文相同，用高氏一号培养基 ( 人工海水 ) 为分离培养基。使用前加入终浓度为 50 10 -6的重铬酸钾作为细菌和真菌的抑制剂。 将采集到的海葵样品先用 0.2 m 滤膜过滤除菌的海水充分冲洗数次，以除去本科毕业论文 材料与方法 - 3 - 海葵表面松散附生的微生物，然后用 70%的乙醇浸泡 3min，做表面消毒，再用除菌海水洗净残留乙醇。用无菌刀片小心削割，切取小块组织于灭菌 Eppendorf 管中研磨，然后加入 1ml 灭菌海水，振荡混匀即
12、得组 织匀浆。以上匀浆做 10-1、 10-2、10-3、 10-4 倍的梯度稀释。吸取四个稀释浓度即原液、 10-1、 10-2、 10-3，各 200 l 涂布于高氏 I 号和 CSA 分离培养基平板，每个浓度 3 个重复。 将涂布好的平皿放入恒温培养箱培养，于 28下培养 21-28 天。 1.2.2 发酵及发酵液提取 纯化后的菌株经斜面活化后，将孢子用无菌水洗下制成孢子悬液，接种于发酵培养基 ( 500 mL 锥形瓶装液量 200 mL，分批进行总共 5L 的发酵量 )， 28 130r/min 摇床培养 5.5 d；发酵结束后， 将培养好的发酵液 离心过 滤 ， 辅以流动水 减压抽滤
13、，滤液 在分液漏斗中 用 250ml 乙酸乙酯萃取得 提 取液；滤渣用乙酸乙酯浸泡超声波提取 30min，过滤得滤液。合并上述乙酸乙酯提取液，用 EYELA 旋转蒸发仪蒸干，再用氯仿 /甲醇溶解转移到 Eppendorf 管中， 各菌株的发酵提取液分别 用 1:1 的氯仿 /甲醇定容 至 1ml，置于 4C 冰箱中保存备用。 本部分于本校医学院 5 楼实验室进行。 1.2.3 发酵液提取物对植物病原真菌的抑制作用测定 采用琼脂扩散法。参照吴少杰 , 王淑军 , 李富超 , 等 . 胶州湾海洋放线菌的分布及其抗微生物活性 中国海洋药物 , 2006, 25(5): 10. 将病原真菌的孢子用无菌
14、水洗下制成孢子悬液，涂布接种于 PDA 培养基。取直径 6mm 的滤纸片，蘸取海洋放线菌 DH102 菌株的发酵提取液约 100 L 贴于含菌平板上 , 25倒置恒温培养，观察病原菌菌落生长状况，培养 12d 后观察、测量抑菌圈直径。 1.2.4 发酵上清液对白粉病病原真菌生长抑制的野外试验 无菌发酵液的制备：发酵结束后，除少部分用于提取发酵液提取物外， 将 其它培养物的 发酵液 用棉纱布过滤，滤液以 5000rpm 离心，按 1（稀释液）： 3（母液）的比例用 PBS 磷酸缓冲剂稀释发酵母液，贮存于水瓶中 备用。 野外试验以舟山定海区东山路旁绿化带某段患白粉病的狭叶十大功劳为试验对象。对十大
15、功劳灌木丛的一个固定的小块用喷花壶装上发酵液喷洒叶片，从 3 月至 5 月根据晴雨等气候情况不定期进行，多在傍晚喷洒，施用量以叶片略湿滴水即停。白粉病的病情描述参照沈洁的分级标准。 本科毕业论文 结果 - 4 - 2 结果 2.1 海葵共附生放线菌 DH102 菌株的分离 对未定种海葵进行共附生放线菌分离，共分离到共附生海洋放线菌 4 株，其中菌株 DH102 从海葵的触手部位分离到，由于发现该菌的菌液提取物有较好的抗虫作用，因此拿来做进一步对植物病原菌的防治试验。 图 -2 分离出的海葵共附生放线菌菌株 DH102 Tab-2 Were isolated from the sea anemo
16、ne epiphytic strains of actinomycetes 2.2 海葵共附生放线菌 DH102 发酵液提取物对植物病原真菌抑制作用 实验发现，菌株 DH102 的发酵液提取物的普遍对三株病原真菌有较好的抑菌效果，表现出较明显的抑制作用，其对 香蕉根霉腐烂病 病菌和番茄早疫病病菌抑菌圈分别为 12、 11mm（图 3） 。 本科毕业论文 结果 - 5 - 图 3 海葵共附生放线菌菌株 DH102 的发酵液提 取物对 香蕉根霉腐烂病 病菌和番茄早疫病病菌抑菌效果。 Tab 3 Anemones were epiphytic strain DH102 Actinomycetes f
17、ermentation broth of Rhizopus extract on banana rot bacteria and antibacterial activity of tomato early blight pathogen 2.3 海葵共附生放线菌 DH102 发酵上清液对白粉病病原真菌生长抑制 的野外试验结果 海葵共附生放线菌菌株 DH102 的发酵液以 1/3 体积的 PBS 缓冲液稀释后，野外施用发现对狭叶十大功劳白粉病抑制效果不甚明显，两个月不定期的处理后病叶仍然较高， 但可以看得出白粉的斑状有所缩小（图 4）。按照沈洁的病叶分类标准，起初局部处于 9 级及以上的病叶经两个月的不定期处理后可见病叶斑点面积缩小，达到 7 级，但仍有大部分叶子病斑面积没有改观。 （ A）
