1、 本科毕业论文 （ 20 届） 鱼腥藻藻蓝蛋白提取优化和抑菌研究 所在学院 专业班级 生物科学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 目录 I 目录 摘要 . I Abstract .II 引言 .1 1 材料与方法 .2 1.1 实验材料 .2 1.1.1 材料 .2 1.1.2 试剂和药品 .2 1.2 实验方法 .3 1.2.1 鱼腥藻的扩大培养 .3 1.2.2 藻蓝蛋白提取条件的优化 .4 1.2.3 高效液相谱进一步提纯藻蓝蛋白 .5 1.2.4 藻蓝蛋白的 SDS PAGE 电泳 .5 1.2.5 藻蓝蛋白的抑菌实验 .6 2 结果与分析 .7 2.1.1 不同固液比
2、对藻蓝蛋白提取的影响 .7 2.1.2 不同冷冻时间对藻蓝蛋白提取的影响 .8 2.1.3 不同的硫酸铵沉淀 饱和度对藻蓝蛋白光密度的影响 .8 2.1.4 高效液相谱进一步提纯藻蓝蛋白结果 .9 2.1.5 藻蓝蛋白的抑菌实验 .10 3 讨论 .12 3.1 不同固液比对藻蓝蛋白提取的影响 .12 3.2 不同冷冻时间对藻蓝蛋白提取的影响 .12 3.3 不同的硫酸铵沉淀饱和度对藻蓝蛋白光密度的影响 .12 3.4 高效液相谱进一步提纯藻蓝蛋白结果 .12 3.5 藻蓝蛋白的 SDS PAGE 电泳 .12 3.6 藻蓝蛋白的抑菌实验 .12 参考文献 .26 致 谢 . 错误 !未定义书
3、签。 中文摘要 I 摘要 摘要 本实验主要以鱼腥藻为实验材料，对鱼腥藻藻蓝蛋白的提取进行了优化，利用液相色谱进行分离纯化和凝胶电泳以及抑菌作用进行了研究。 结果表明： 1）藻蓝蛋白提取的最佳条件为，采用反复冻融法，固液比是 1： 1，冷冻时间是 60min，硫酸铵饱和度为 60%。 2）藻蓝蛋白的最大吸收光是 620nm。 3）高效液相色谱所用分子筛柱为： SRT SEC 1007.8*300mm 5um，分离得到 3 个最大吸收峰，分别在每个峰处收集蛋白质，标记为 pc1， pc2， pc3。 4） SDS PAGE 电泳可知， pc1 和 pc2 的分子量在14kDa18kDa 之间。 5
4、） pc2 对 苏云金芽孢杆菌和腾黄叠球菌有较弱的抑菌作用。 关键词 鱼腥藻；藻蓝蛋白；液相色谱； SDS PAGE 电泳；抑菌 英文摘要 II Abstract Abstract In this study, mainly Anabaena as experimental materials, Anabaena phycocyanin extraction were optimized, purified by liquid chromatography and gel electrophoresis and inhibition were studied. The results show
5、ed that: 1) phycocyanin optimal conditions for extraction by freezing and thawing method, the ratio is 1:1, the freezing time is 60min, 60% ammonium sulfate saturation.2) The maximum absorption of phycocyanin light 620nm.3) molecular sieve HPLC column was used: SRT SEC-1007.8 * 300mm 5um, isolated t
6、hree maximum absorption peaks were collected in each protein, labeled pc1, pc2, pc3. 4) SDS-PAGE electrophoresiswe can see, pc1 and pc2 molecular weight between the 14kDa 18kDa.5) pc2 Bacillus thuringiensis bacteria and Teng Huang stacked with weak inhibition. Key Words Anabaena; phycocyanin; liquid
7、 chromatography; SDS-PAGE electrophoresis; antibacterial 浙江海洋学院毕业论文 引言 1 引言 藻蓝蛋白是一种深蓝色粉末，色泽美观。它既是一种蛋 白质，又是一种极好的天然食用色素，同时又是良好的保健食品。据科学研究表明，藻蓝蛋白具有刺激红细胞集落生成，类似红细胞生成素的作用；藻蓝蛋白具有补血、调整白血球和提高淋巴细胞活性的作用；增加体能、促进红血球增长，能增进机体免疫功能，促进生长发育；藻蓝蛋白还具有抑制某些癌细胞的作用；具有很高的营养价值和医疗价值。 藻蓝蛋白作为天然食用色素，它可以改善食品的色泽，不仅能提高食品的档次，而且能增加食品中
8、的功能成份。藻蓝蛋白是少见的色素蛋白之一。它不仅颜色鲜艳，而且本身是一种营养丰富的蛋白质，其氨基酸组成齐全 ，必需氨基酸含量高。藻蓝蛋白是水溶性色素，清亮鲜艳，外观悦目可爱，可作为食品、化妆品的添加剂。 目前藻蓝蛋白的产品绝大部分来自螺旋藻，但由于螺旋藻需在碱性环境 (pH11)下生产，在培养过程中需添加大量 Nahco3，不仅增加成本，同时产品中残留的NaHCO3 不易去除干净。不适合作食品添加剂及药物等使用。同时，生产中螺旋藻藻体要清洗三遍才能用于提取，因此培养基和清洗液的排放也会对环境造成污染。鱼腥藻 (Anabeana)属淡水藻，培养过程中操作简单易控制，生长速度快、产量高、成本低、适
9、应性强，一年四季均可生产，其 中藻蓝蛋白含量高于螺旋藻，同时鱼腥藻还具有固氮能力，产生的有机氮作为饲料蛋白。因此，利用鱼腥藻提取藻蓝蛋白，不仅可以避免采用螺旋藻提取藻蓝蛋白的高成本，高污染的弊端，也可大大降低成本，是一种价廉易得的藻蓝蛋白资源。 因此对从鱼腥藻中提取藻类蛋白工艺进行改进就非常有必要，本实验不仅在提取工艺方面进行改进并对提取获得的藻类蛋白进行各种测得以获得更多的情况，方便他人对藻蓝蛋白的理解和应用。 材料与方法 2 1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 材料 鱼腥藻 (Anabaena Cylindrica)藻种由湖北武 汉中科院水生生物所藻种库提供。 1.1.2 试剂和
10、药品 (1)鱼腥藻培养基 Component Amount Stock Solution NaNO3 100 mL/L 15 g/1000mldH2O K2HPO4 3H2O 10 mL/L 2.62 g/500 mL dH2O MgSO47H2O 10 mL/L 3.75 g/500 mL dH2O CaCl22H2O 10 mL/L 1.8 g/500 mL dH2O Citric acid H2O(柠檬酸 ) 10 mL/L 0.33 g/500 mL dH2O Na2CO3 10mL/L 1.0g/500ml dH2O 硫酸铁铵 10mL/L 0.5160g/500ml dH2O ED
11、TA-Na2 2H2O 10mL/L 0.055g/500ml dH2O Trace mental solution 1ml/L H3BO3 2.86g/L dH2O MnCl24H2O 1.86g/L dH2O ZnSO47H2O 0.22g/L dH2O Na2MoO4.2H2O 0.39g/L dH2O CuSO4. 5 H2O 0.08g/L dH2O Co(NO3)2.6 H2O 0.05g/L dH2O (2)试剂的配置 pH7.8 的磷酸缓冲液 : 50mmol/L 磷酸缓冲液 (pH=7.8)：取 8.5mL0.1mol/L NaH2PO4与 91.5 mL0.1mol/L N
12、aH2PO4相混合后，在加入 100mL 蒸馏水； 0.1%TFA（三氟乙酸）： 1gTFA 用重蒸水定容到 1000ml 0.1%TFA+乙腈： LB 培养基： 胰蛋白胨 (Tryptone) 10g/L 酵母提取物 (Yeast extract) 5g/L 氯化钠 (NaCl) 10g/L LB 固体培养基 1L 和液体一样，加 15g 琼脂粉，一定要在温度降下之前加好抗生素 材料与方法 3 仪器和工具 烧杯 国药集团化学试剂有限公司 量筒 中国医药（集团）上海化学试剂公司 研钵 国药集团化学试剂有限公司 秒表 宁波奥博有限公司 广口瓶 国药集团化学试剂有限公司 锥形瓶 国药集团化学试剂有
13、 限公司 移液枪 北京华北科创科技有限公司 离心机 上海宇工机械有限公司 离心管 中科晨宇 (北京 )实验设备有限公司 培养皿 中国医药（集团）上海化学试剂公司 试剂瓶 中国医药（集团）上海化学试剂公司 容量瓶 中国医药（集团）上海化学试剂公司 玻璃棒 江苏省泰兴市振科仪器厂 试 管 国药集团化学试剂有限公司 电子天平 余姚市金诺天平仪器有限公司 洁净工作台 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 电热恒温箱 上海森信实验仪器有限公司 智能光照培养箱 宁波江南仪器厂 紫外分光光度计 日本岛津（ UV-2401） 高效液相色谱仪 waters 600E 电热恒温水浴锅 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 7
14、22S 型分光光度计 上海天普分析仪器有限公司 冰箱 西门子冰箱 酶标仪 美国热电 MK-3 电泳仪 北京六一 1.2 实验方法 本试验始于 2010 年 7 月中旬至 2011 年 3 月中旬结束。购买鱼腥藻藻种后，用 BG11 培养基扩大培养，用多次冷冻破壁方法提取鱼腥藻藻蓝蛋白，用紫外分光光度法测定藻蓝蛋白纯度，用液相色谱对获得的藻蓝蛋白进行提纯，用 SDSPAGE 电泳测定提纯后的藻蓝蛋白纯度，最后用获得的纯品进行抑 菌实验。 1.2.1 鱼腥藻的扩大培养 鱼腥藻 10mL 藻液接种到 40mL BG11 培养基中，在 25 , 40uE（ m-2 s-1），光暗时间比 L:D=12h
15、:12h 的人工气候箱 (JumboLRH-250-G3)中培养，每天摇动 1-2次。将藻种逐步扩大培养，取对数生长期的鱼腥藻进行藻蓝蛋白的提取。 材料与方法 4 图 1 培养中的鱼腥藻 Figure 1Culture of Anabaena 1.2.2 藻蓝蛋白提取条件的优化 （ 1）藻蓝蛋白的粗提：取已经扩大培养的鱼腥藻置于 50ml 离心管中， 4000r/min离心 10min，去掉上清液， 取沉淀得藻类，离心两次。取 50ml 的烧杯，分别加入1g 左右的新鲜鱼腥藻。在各个烧杯中加入不同体积的 pH7.0 的磷酸缓冲液，置于 -20冰箱中冰冻不同时间，反复冻融 5 次。置于 38水浴
16、中溶解（如鱼腥藻成块状可对其进行适当的研磨），最后将烧杯中的鱼腥藻倒入 10ml 离心管，加入一定量的 Ph=0.7 的磷酸缓冲液，充公混匀。 5000r/min 离心 10min。获得藻蓝蛋白粗提取液。用饱和度为 60%的硫酸铵盐析进一步提纯。 （ 2）藻蓝蛋白提取条件的优化： 设置单因子实验：分别比在同样冰冻时间下不同固液比对鱼腥藻藻蓝蛋白 提取的影响，和相同固液比时不同冰冻时间对提取藻蓝蛋白的影响。 不同的固液比：设置冰冻时间为 30分钟，而固液比分别设置为 1:1,1:3,1:5，反复冷冻 5次，比较提取藻蓝蛋白的结果 不同的冰冻时间：设置固液比为 1:1，冰冻时间分别为 30min，
17、 60min， 90min，120min，比较提取的藻蓝蛋白的结果 （ 3）藻蓝蛋白含量的测定：取提取的藻蓝蛋白粗制品，定容到 4ml，在紫外分光光度计上测定藻蓝蛋白的含量和 OD值。 材料与方法 5 1.2.3 高效液相谱进一步提纯藻蓝蛋白 用 waters600e液相色谱纯化蛋白质，用分子筛进一步 纯化粗藻蓝蛋白 柱子： 300SB C8 5um 4.6*250mm。 操作步骤如下：（ 1）先打开主机软件、先设 50%.50%、在抽气阀在 draw的位置抽气，抽好后，回到 run位置；抽 3管一样，回到 run位置。（ 2）设速率 0.5ml/min（或者 0.75ml/min， 1ml/
18、min）接 c8柱；平衡冲柱（ 3）当压力稳定时大约冲 1h后进样（ 4） 在 edit中设置先用 0 95%水 +5%乙腈 5 90%水 +10%乙腈 10 45%水 +55%乙腈 15 5%水 +95%乙腈 （ 5）进样前， 把灯打开 shirt+lamp（两次） （ 6）冲洗进样环，在 load位置；用去离子水冲洗 3次 （ 7）进样：吧样品推进去（ run）。按钮旋转到 injut位置 （ 8）点红的停止，点 prepare，点 inject （ 9）接样：到（ 0.01）以上接样，出峰的时候接样 （ 10）样品先合并（同峰的）；先用封口膜封上，插小孔 -70冷冻；然后用冻干机冻干；样
19、品冻干后放入 -20，做电泳。 1.2.4 藻蓝蛋白的 SDS PAGE 电泳 1.2.4.1制胶 1用棉花 *洗涤剂反复擦洗玻璃板，在用自来水反复冲洗，最后用 ddH2O漂洗干净，烘干货 自然晾干货吹风机吹干备用，隔条及梳子用同样的方法洗干净自然晾干或用滤纸吸干。 2调整制胶架使其稳定并保持水平，两块玻璃夹紧隔条装入制胶架。（选取玻璃板较平滑一个底面向上，其上均匀涂抹一薄层凡士林，注意凡士林尽量不要塞入玻璃板缝隙中） 3配置分离胶 15ml（ 10%分离胶） 30%凝胶 *液 分离胶 Buffer（ 4*） ddH2O 12% 6ml 3.75 5.25 15% 7.5ml 3.75 3.7
20、5 混合后搅匀，加入 40ulAP和 10ulTEMED，充分混匀后用玻璃棒（ Tip 头）引流沿玻璃板向夹缝 处注入，上部留出浓缩胶空间，再在胶面上轻轻加一层无水乙醇覆盖，等待凝胶聚合。 4配置 4.8%浓缩胶 5ml 30%凝胶 *液 0.8ml 浓缩胶 Buffer1.25ml， ddH2O2.95ml混合后搅匀，加入20ulAP和 5ulTEMED，充分混匀后用枪小心注入分离胶上层（注意尽量避免气泡产生），插梳子，等待凝胶聚合。 1.2.4.2样品处理 1样品溶于 SDSlysis中（必要时可进行浓缩）， 10ul样品 +10ul裂解液，加入等体材料与方法 6 积样品溶解液，使之充分混
21、匀后置沸水浴中加热 15min，取出冷却， 12000rpm离心 10min，用微量注射器吸取上清液点样。 1.2.4.3电泳 1电泳仪先设置恒流为 15mA,待溴酚蓝线迁移至分离胶于浓缩胶界面时，设置恒流为 30mA进行电泳。待溴酚蓝沿距离胶板底 0.51.0cm处终止电泳。 1.2.4.4剥胶、固定 1电泳停止后用剥胶片将凝胶从玻璃板上剥离，置于固定液（ 4%甲醇 +10%乙醇+50% ddH2O）中固定 30min。 1.2.4.5水洗、染色 1小心倒掉固定液加入 ddH2O覆盖胶面，置于摇床振荡 510min此步骤重复 4次。注意操作过程中需更换干净手套，用力适当不可损坏凝胶 。 2小心倒掉考染液，用 ddH2O清洗胶面方法同步骤 1直至胶面背景透明，即可扫胶。 1.2.5 藻蓝蛋白的抑菌实验 1配置 LB培养基， 121灭菌 20min， 96孔板。 2摇菌 用哈维氏弧菌 G 普通变形杆菌 G 大肠杆菌 G 苏云金芽孢杆菌 G+ 藤黄叠球菌 G+ 做指示菌 接种到 23ml培养基中 37 250rpm摇至浑浊 3加样 对照组加 10um无菌培养基，样品组加 10um培养基溶解其对应样品 4检测 加样后酶标仪检测 记录初始数据 37 100rpm 摇床过夜 12、 24h（也可阶段检测 3-4h检测一次） 可用酶标仪检测，记录数据进行比对分析
