1、 本科毕业论文 （ 20 届） 长蛸不同群体 ISSR 分析 所在学院 专业班级 生物科学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 本科毕业论文 目录 目录 摘要 . 错误 !未定义书签。 Abstract . 错误 !未定义书签。 引言 .1 1 材料与方法 .3 1.1 实验材料 .3 1.2 实验仪器 .3 1.3 实验方法 .3 1.3.1 长蛸基因组 DNA 的提取 .3 1.3.2 检测长蛸基因组 DNA .4 1.3.3 长蛸 ISSR-PCR.4 1.3.4 长蛸数据统计分析 .4 2 实验结果与分析 .6 2.1 不同居群的遗传多样性 .6 2.2 遗传变异与分化
2、.7 3 讨论 .8 3.1 长蛸的遗传多样性 .8 小结 .9 参考文献 . 11 致谢 . 错误 !未定义书签。 本科毕业论文 中文摘要 摘要 摘要 本文采用 ISSR-PCR 技术对长蛸基因组 DNA 进行扩增， 筛选分析了 ISSR-PCR扩增时的主要影响因子 ： 包括 Mg2+浓度、引物浓度、 dNTPs 浓度、 Taq 酶浓度以及退火温度等，建立了 长蛸 ISSR 优化体系。最终确立的 25 l 优化体系为： Mg 2+， 1.5 m mol/L， Taq DNA 聚合酶 1.0 U， 引物 0.15mol/L， dNTPs 2.0 m mol/L，退火温度为 52.2 。并用 7
3、条 ISSR引物对舟山 、温州两个野生 群体进行 了 遗传多样性分析，共得到 118 个清晰的扩增位点，其中多态性位点 55 个，多态位点率为 46.59%。其中舟山群体多态位点比例为 46.61%， Neis 基因多样性为 0.16330.2044 ，Shannons 多样性指数为 0.24170.2916。 温州多态位点比例为 44.07%。 Neis 基因多样性为0.15100.1971， Shannons 多样性指数为 0.22530.2830， 研 究结果 表明 舟山长蛸野生 群体遗传多样性水平高于温州长蛸野生群体 。 关键词 长蛸； ISSR；体系优化；遗传多样性。本科毕业论文 英
4、文摘要 Abstract Abstract This study adopted ISS R-PCR amplification technology on Octopus variabilis genome DNA, and analyzed the main influencing factors, including the concentration of Mg2+, Taq DNA polymerase, dNTPs, the primers, as well as the annealing temperature, and established the suitable ISS
5、R-PCR system for Octopus variabilis. The reaction system with a total volume of 25l was as the following: Mg2+ 1.5 mmol/L, Taq DNA polymerase 1.0 U, primer 0.15 mmol/L, dN TPs 2.0 mmol/L, the annealing temperature is 52.2 . And the ISSR technique was used to assess the genetic diversity of Zhoushan
6、population and Wenzhou population, 7 ISSR primers was used to PCR amplification. O f the 118 ISSR loci tested, 55 (46.59%) were polymorphic, the results of Zhoushan population showed that the proportion of polymorphic loci was 46.61%, Neis genetic diversity is 0.16330.2044, Shannons information inde
7、x is 0.24170.2916. The results of Wenzhou population showed that the proportion of polymorphic loci was 44.07%. Neis genetic diversity is 0.1510 0.1971, Shannons information index is 0.22530.2830. The results showed that the genetic diversity of Zhoushan population is higher than that of Wenzhou pop
8、ulation. Key words Octopus variabilis; ISSR; System Optimization; Genetic. 本科毕业论文 引言 引言 长蛸 (Octopus variabilis)，隶属 于 软体动物门，头足纲，八腕目，蛸科(Octopodidae)，俗称长八带鱼 （ 短蛸俗称八带鱼 ） 、鲅须 1。在我国南北各海区均有广泛分布，其中北部海区略多。长蛸为沿岸底栖头足类，是肉食性动物，主要以小型蟹类、贝类为食，长蛸个体大、肉质肥厚鲜美、营养丰富，富含蛋白质和氨基酸，可食用部分占总体的 90%以上。肉除鲜食外，还可以加工 成干制品，食用方式多种多样。其内骨
9、骼 (中药名海螵蛸 )和墨囊具有较高的药用价值，有止血、抗癌等功效，因而长蛸具有较高的经济价值。近几年 ， 随着大量出口日本、韩国 ， 市场供不应求现象严重 ， 经济价值不断攀升 ， 已成为北方重要经济头足类。同时 ， 黄渤海捕捞力度加大造成了自然资源严重衰退。国内关于长蛸形态、生态分布、组织学与组织化学的研究已见报道 ， 关于种质资源遗传多样性方面的研究很少报道 ，而 生物群体的遗传多样性是评价生物资源状况的一个重要依据，是物种适应多变的环境条件、维持长期生存和进化的遗传基础，对种群内和种群间遗传多样性 的认识在进行种质鉴定和亲本选择时具有重要的现实意义，所以进行长蛸遗传多样性的研究具有重要
10、的意义 2。 ISSR(inter-simple sequence repeat) 技术作为一种新型的分子遗传标记 ， 是Zietkeiwitcz 等于 1994 年发展起来的一种 微卫星 基础上的分子标记 3-4。其基本原理是 ： 用锚定的微卫星 DNA为 引物 ，即在 SSR 序列的 3端或 5端加上 2-4 个随机核苷酸，在 PCR 反应中，锚定引物可引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间 DNA 片段进行 PCR扩增 5-7。所扩增的 inter SSR区域的多个条带通过聚丙烯 酰 胺凝胶电泳或者琼脂糖凝胶电泳得以分辨，扩增谱带多为显性表现。ISSR 引物的开发不
11、像 SSR 引物那样需测序获得 SSR 两侧的单拷贝序列，开发费用降低。与 SSR 标记相比， ISSR 引物可以在不同的物种间通用，不像 SSR 标记一样具有较强的种特异性 ； 与 RAPD 和 RFLP 相比， ISSR 揭示的多态性较高，可获得几倍于RAPD 的信息量，精确度几乎可与 RFLP 相媲美，检测非常方便，因而是一种非常有发展前途的分子标记。目前， ISSR 标记已广泛应用于植物品种鉴定、遗传作图、基因定位、遗传多样性、进化及分子生态学研究中 8.9.10，而在动物品种研究方面应用很少。运用 ISSR 标记技术时，由于每个引物并不适合于所有物种，需要对研究物种进行引物筛选，以获
12、得适合其 ISSR-PCR 反应体系的引物。本研究的目的就是寻找提取长蛸 DNA本科毕业论文 引言 的最优方法，并以此为基础筛选出适合长蛸 ISSR-PCR 反应体系的引物，为建立起稳定性强，重复性好的长蛸 ISSR-PCR 反应体系奠定基础 。本科毕业论文 材料与方法 1 材料与方法 1.1 实验材料 试 验所用的的长蛸分别采自 舟山 (ZS)、 温州 (WZ)地区。取活体长蛸的肌肉组织为材料 ， 于 -20 无水乙醇中保存备用。每个群体取样 100 个进行 DNA 提取。 ISSR 引物：根据加拿大 British Columbia 大学设计的 ISSR 引物序列合成 7 条引物。 其它材
13、料： Taq 酶 ， 10PCR 缓冲液， MgCl2： 25mmol/L， dNTP： 2.5mmol/L，无水乙醇， STE， SDS， PK，平衡酚，氯仿，异戊醇， NaCL 溶液（ 5moL/L），琼脂糖，去离子水， Loading-buffer 等。 1.2 实验仪器 PCR 仪 为： BIO-RAD 生产的 PTC-200 型 PCR 仪 ； 凝胶成像系统 为： BIO-RAD 生产的 VH II 型凝胶成像系统 ； 冷冻离心机 为： 上海金鹏分析仪器有限公司 生产的 GL-16G-II 型冷冻离心机 ； 高压蒸汽灭菌锅 为： 上海博讯实业有限公司的 YXQ-LS-OS11 型立式
14、高压蒸汽灭菌锅 ； 电泳仪 ： 北京六一仪器厂生产的 DYY-8C 型水平电泳仪 ； 电子天平 为： METTLER-TOLEDO 生产的 EL104 型电子天平 ； 水浴锅 ： 常州国华电器有限公司生产的 HH-6 型数显水浴 锅 ； 移液器 ： 北京青云卓立精密设备有限公司 。 1.3 实验方法 1.3.1 长蛸基因组 DNA的提取 长蛸 DNA 提取的步骤： （ 1）剪取小块的样品组织放入离心管。 （ 2）加 600l的 STE+60l的 SDS(10%)， 剪碎后加 6l的 PK。 （ 3） 55 水溶消化 3-3.5h，至溶液澄清，无沉淀（其中前半个小时消化时，每5min 摇一次，使
15、溶液充分混合，充分消化）。 本科毕业论文 材料与方法 （ 4）加入 330l 二相混合（氯仿：异戊醇 =24:1） +330l （ 等体积 ） 平衡酚，缓慢摇晃 15min,使之充分混合。 （ 5）放入离心机，低温 12000 转，离心 15min。 （ 6）取上清至新的离心管重复 4， 5 步骤两次（等体积 2 相 +1 相混合）。 （ 7）加入等体积的二相（氯仿：异戊醇 =24:1）充分，缓慢摇晃 15 min,12000 转离心 15 min。 （ 8）取上清加入新的离心管中，加入 1/25 体积的 NacL 溶液（ 5mol/L）和 2.5 倍体积无水乙醇（ -20 下静置后再用），充
16、分混匀（摇 15 min）， -20 下静置 1h 后离心15 min。 （ 9） 去上清，留沉淀，加入 70%酒精（ -20 ）摇晃几次，静置 7-8min， 12000转，离心 8min。 重复第九步一次，去上清，留沉 淀，使酒精挥发干，加入 100l 去离子水， -4 保存。 1.3.2 检测长蛸基因组 DNA 取一锥形瓶，称取 1g 的琼脂糖倒入其中，加入 100ml 的 0.5TBE。放入微波炉中加热，倒平板，等待胶冷却成型后，放入电泳 槽 中，按顺序将 Loading buffer 和 DNA的混合物点入胶孔中，电泳 30 min 后，放入溴化乙锭 溶液 中染色 20min，然后在
17、凝胶成像系统中观察结果并拍照。 1.3.3 长蛸 ISSR-PCR 根据 加拿大哥伦比亚大学公布的序列，由上海生物英俊生物工程技术服务右键公司合成。经优化的 PCR 反应体系为： 25l总体积中包括 1 x PCR 缓冲液、 2.5mmol/L 的Mg2+、 0.25mmol/L 的 dNTP、 0.5mol/L 的 ISSR 引物、 1U 的 Taq DNA 聚合酶、 40ng模板 DNA。 PCR 反应程序为 94变性 40s， 52退火 40s， 72延伸 90s， 38 个循环后 ,72延伸 7min； 4保存。利用优化的 ISSR-PCR 体系，对合成的 100 条引物进行筛选。用筛
18、选出的特异性好，重复性高的引物进行 PCR 扩增，以 100-2000bp 的 DNA 标准分子量为参照，扩增产物在 1X TBE 缓冲液、电压 100V的电泳条件下，用 1.5%的琼脂糖 凝胶进行电泳分离，电泳后再凝胶成像系统下观察并拍照。 1.3.4 长蛸数据统计分析 ISSR 为显性标记，由同一引物扩增的电泳迁移率一致的条带作为同一位点，记录清晰稳定的电泳条带，按条带的有无分别记为“ 1”和“ 0”，构成 ISSR 表型数据矩阵。用 POPGENE(Version 1.32)软件 15计算一下遗传参数： 多态位点比例、观测等位基本科毕业论文 材料与方法 因数、有效等位基因数、 Neis
19、基因多样性指数、 Shannons 信息指数、居群间的遗传分化系数和基因流、遗传相似度和 Neis 遗传距离。以 DCFA(verison1.1)软件 16技 术欧氏距离平方，利用 WINAMOVA(version1.55)软件对居群间和据群内的遗传变异进行分子变异分析 (Analysis of molecular caricnce,AMOVA)17。基于 Neis 遗传距离，用MEGA(version 4.0)软件 18中的邻接法 (Neighbor-joining NJ),分别对 2 个居群以及这些居群中的 100 只个体进行聚类分析。 本科毕业论文 实验结果与分析 2 实验结果与分析 2
20、.1 不同居群的遗传多样性 对长蛸 2 个居群的样品进行扩增的结果显示，扩增产物的分子量大多在 100-2000 bp 之间 ，利用 7 个 ISSR 引物共扩增出 118 个位点，平均每个引物记录 16.8 个位点。长蛸 2 个居群的多态位点比例、观测等位基因数、有效等位基因数、 Neis 基因多样性指数和 Shannons 信息指数 (表 2)。从表 2 可见，舟山居群的多态位点比例明显高于温州。结合 Neis 基因多样性指数 (h)和 Shannons 信息指数 (I)来看，舟山居群的遗传多样性水平较高，温州居群的长蛸遗传多样性相对较低。方差分析的结果表明，基因多样性指数和 Shanno
21、ns 信息指数在 2 个居群之间存在显著差异。 长蛸在居群水平上，平均每个位点的有 效等位基因数 Ne=1.2735， Neis 基因多样性指 (h)和 Shannons 信息指数 (I)分别为 0.1571 和 0.2335；在物种水平上， Ne=1.5317， h和 I 值分别为 0.3145 和 0.4766。总体而言，长蛸仍具有较高的遗传多样性水平 。 图 2 引物 UBC834对长蛸舟山群体的扩增图谱 Fig.2 The amplification patterns of primer UBC834 in Zhoushan population 表 1 筛选引物序列和扩增结果 Tab
22、.1 The sequence of primers elected and amplification results 引物 序列 (53) 总位点数 多态位点数 多态位点比例 (%) Primer Sequence Total loci Polymorphic loci Ratios of polymorphic loci UBC 834 AGA GAG AGA GAG AGA GYT 19 9 47.37 UBC 836 AGA GAG AGA GAG AGA GYA 18 10 55.56 UBC 840 GAG AGA GAG AGA GAG AYT 16 8 50.00 UBC 841 GAG AGA GAG AGA GAG AYC 18 8 44.44
