1、 本科毕业论文 （ 20 届） 重金属 Zn、 Cd 对田菁生理生化指标的影响 所在学院 专业班级 生物科学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 I 目 录 摘要 .I Abstract . II 引言 . 1 1 材料与方法 . 3 1.1 实验材料 . 3 1.2 试剂和药品 . 3 1.2.1 营养液： . 3 1.2.2 梯度培养液： . 4 1.2.3 实验主要试剂： . 4 1.3 仪器和工具 . 6 1.4 实验方法 . 6 1.4.1 种子萌发率的测定 . 6 1.4.2 叶绿素含量的测定 . 7 1.4.3 植物叶片电解质外渗的测定 . 7 1.4.4 可溶性蛋
2、白含量测定 . 7 1.4.5 脯氨酸含量测定 . 8 1.4.6 超氧化物歧化酶（ SOD）活性的测定 . 9 1.4.7 过氧化物酶（ POD）活性的测定 . 9 1.4.8 过氧化氢酶（ CAT）活性的测定 . 10 1.4.9 根系活力的测定（甲烯蓝吸附法） . 11 2 结果与讨论 . 12 2.1 不同浓度的 Zn2+处理对田菁的生理生化指标影响 . 12 2.1.1 不同浓度的 Zn2+处理对田菁种子发芽率和发芽势的影响 . 12 2.1.2 不同浓度的 Zn2+处理对田菁叶绿素的含量的影响 . 12 2.1.3 不同浓度的 Zn2+处理对田菁叶片电解质外渗的影响 . 13 2.
3、1.4 不同浓度的 Zn2+处理对田菁可溶性蛋白含量的影响 . 14 2.1.5 不同浓度的 Zn2+处理对田菁脯氨酸含量的影响 . 15 2.1.6 不同浓度的 Zn2+处理对田菁叶片 SOD 活性的影响 . 15 2.1.7 不同浓度的 Zn2+处理对田菁叶片 POD 活性的影响 . 16 2.1.8 不同浓度的 Zn2+处理对田菁叶片 CAT 活性的影响 . 17 2.1.9 不同浓度的 Zn2+处理对田菁根系活力的影响 . 17 2.1.10 本章小结 . 18 2.2 不同浓度的 Cd2+处理对田菁的生理生化指标影响 . 18 2.2.1 不同浓度的 Cd2+处理对田菁发芽率发芽势的
4、影响 . 18 2.2.2 不同浓度的 Cd2+处理对田菁叶绿素的含量的影响 . 19 II 2.2.3 不同浓度的 Cd2+处理对田菁叶片电解质渗透的影响 . 20 2.2.4 不同浓度的 Cd2+处理对 田菁可溶性蛋白含量 的影响 . 21 2.2.5 不同浓度的 Cd2+处理对 田菁叶片脯氨酸含量 的影响 . 21 2.2.6 不同浓度的 Cd2+处理对 田菁叶片 SOD 活性 的影响 . 22 2.2.7 不同浓度的 Cd2+处理对 田菁叶片 POD 活性 的影响 . 23 2.2.8 不同浓度的 Cd2+处理对 田菁叶片 CAT 活性 的影响 . 23 2.2.9 不同浓度的 Cd2
5、+处理对 田菁根系活力 的影响 . 24 2.2.10 本章小结 . 25 3 讨论 . 26 4 小结 . 29 参考文献 . 30 致谢 . 错误 !未定义书签。 I 摘要 摘要 重金属锌、镉广泛存在于自然环境中，对各种植物尤其对农作 物产生重要影响。本试验以田菁为材料，采用水培试验的方法在 Hoagland 营养液的基础上，人工模拟不同浓度的重金属锌（ Zn）和镉（ Cd）胁迫田菁种子和幼叶，分别设计 Zn2+浓度为 0mgL-1、 20mgL-1、 50mgL-1、 100mgL-1、 150mgL-1、 200mgL-1 、 400mgL-1 和 Cd2+浓度为 0mgL-1、 0.
6、5mgL-1、 1mgL-1、 5mgL-1、 10mgL-1、 25mgL-1 和50mgL-1 胁迫田菁种子及幼苗。通过研究不同浓度 Zn2+、 Cd2+对其种子发芽率发芽势、幼苗叶绿素含量、电解质渗透、蛋白质含量、脯氨酸含量、抗氧化酶活性、根系活力的影响，探讨了田菁对重金属胁迫的生理生化响应及抗性机理。 研究结果表明：低浓度 Zn2+促进了田菁种子的萌发，低浓度的 Cd2+对种子萌发无影响；低浓度 Zn2+、 Cd2+提高了田菁叶绿素的合成及根系活力；在高浓度 Zn2+、Cd2+胁迫下，种子萌发受抑制，田菁幼叶叶绿素 a、叶绿素 b 合成和根系活力不同程度的下降；随着 Zn2+、 Cd2
7、+浓度增加，田菁叶片电解质渗透率和脯氨酸积累量持续上升，而叶片可溶性蛋白质含量持续下降； SOD、 POD 活性随着 Zn2+、 Cd2+浓度增加先上升后下降， CAT 活性则在 Zn2+、 Cd2+胁迫下表现为不同，低浓度的 Zn2+促进CAT 合成，高浓度则使 CAT 活性下 降， Cd2+胁迫下 CAT 活性与 Cd2+浓度呈负相关。 关键词 田菁；锌胁迫；镉胁迫； 生理生化指标 英文摘要 II Abstract Abstract Heavy metals such as Zinc and Cadmium are widely exist in the nature, which hav
8、e some outstanding influence on the plants especially on crops. This study selected the plant Sesbania cannabina Pers. as research subject, using of indoor water culture testing method, and on the basis of the Hoagland nutrient solution. Different concentrations of heavy metal zinc (Zn) and cadmium
9、(Cd) by artificial simulation stressed Sesbania cannabina Pers. Seedlings, respectively designed a concentration of Zn2+ concentrations for 0mgL-1, 20mgL-1, 50mgL-1, 100mgL-1, 150mgL-1, 200mgL-1, 400mgL-1 and Cd2+concentrations for 0mgL-1, 0.5mgL-1, 1mgL-1, 5mgL-1, 10mgL-1, 25mgL-1 , 50mgL-1. Throug
10、h the research of Zn2+, Cd2+ of different concentrations of seed germination rate and sprout potential,chlorophyll content, electrolyte penetration, protein content, proline content, antioxidant enzymes activity, root vigor impact,discussesed Sesbania cannabina Pers. physiological response and resis
11、tance mechanism under heavy metals stress. The results of the study showed that: Low concentration Zn2+ promoted the Sesbania cannabina Pers. seed germination, Low concentration Cd2+ had no effects on seed germination; Low concentration Zn2+, Cd2+ improved chlorophyll synthesis and root vigor; Seed
12、germinations are inhibited, chlorophyll-a and chlorophyll-b synthesis reduced and root vigor dropped in different degree under high concentration Zn2+, Cd2+; With increasing concentrations of Zn2+ and Cd2+, leaf electrolyte penetration and proline accumulation continued to rise, while soluble protei
13、n content of leaves continued to decline;SOD,POD activity increased and then decreased with Zn2+, Cd2+ concentration, CAT activity showed different undeer the Zn2+ and Cd2+ stress,low concentration of Zn2+ for CAT synthesis, high concentrations so that CAT activity decreased ;CAT activity under Cd2+
14、 stress was negatively correlated with Cd2+ concentration. Key words Sesbania cannabina Pers.;zinc stress; cadmium stress; physiological and biochemical引言 1 引言 田菁 （ Sesbania cannabina Pers.）， 又叫碱菁，涝豆，是一年生草本植物。田菁原产于热带和亚热带，在中国广东、海南、福建、浙江、江苏等地均有分布 1。在目前栽培的绿肥作物中，田菁的耐盐能力最强。因此，在海滨、海滩、盐碱地都种植有田菁。 田菁是一种优良的夏季
15、绿肥作物，也可作为饲料。田菁固氮能力较强，植株养分含量丰富，种植田菁后可使土壤增产效果显著；田菁可有效较低耕层土壤盐分， s所以近年来在渤海盐碱地区种植栽培用作 绿肥，效果甚为良好；田菁茎叶可作为饲料，茎秆可用于造纸；其种子内胚乳制成的田菁粉用作水基酸化压液的稠化剂，可供多种工业利用 2。 目前，由于矿山开采，金属冶炼以及工业污水和污泥在农业上的广泛应用，大量的有毒有害重金属元素进入了土壤生态系统。土壤的重金属污染是指由于人类的生产和活动，使土壤中重金属含量明显高于其背景值的现象。加上重金属离子具有难以迁移、长期滞留和不可降解的特性，易对土壤生态环境造成极大的破坏。锌和镉是目前土壤中比较常见的
16、重金属之一 3。锌是植物必需的营养元素，具有重要的生理功能和营养作用。 锌可以作为六大类功能酶中不同的辅助因子，调节酶的活性4；影响 DNA 及 RNA 聚合酶的活性进而影响核酸和蛋白质的合成 5；维持和稳定生物膜功能的完整性 6。因此缺少 Zn2+会引起植物的生理病害，但并非含 Zn2+越多越好，高浓度的 Zn2+会对植物造成伤害，影响植物的生长发育。有研究发现，当植物含锌量 50mg/kg 时，就会引发锌中毒 7。镉是植物的非必需元素，也是毒性最大的重金属元素。当植物体内 Cd2+达到一定浓度，就会产生毒害作用，通常会使植株表现为发育缓慢、植株矮小、叶片失绿等症状，并能抑制植物各种 功能酶
17、活性，从而影响植物品质和产量 8。 海滨是重金属主要宿集之地，重金属被植物根系吸收进入植物体内，进而影响植物的生长。田菁是海滨地区的重要作物，同时也是畜牧业的重要食物来源。人类作为食物链的最顶端，会使重金属富集于人体，引起一系列疾病。研究重金属对田菁的生理生化的影响可以了解海滨地区的重金属污染状况，并且提供治理生态环境的方法。植物提取修复技术就是目前利用植物改善生态环境的一种有效方法。 植物提取修复技术（ phytoextraction）是 20 世纪 90 年代发展起来的一种“通过引言 2 金属富集植物去除土壤或水体 中有害金属的一种有效的、低成本的绿色环境净化技术” 9。其主要包括两个方面
18、，即植物对重金属的耐性和富集力的研究，和利用植物进行污染土壤修复的应用研究。因其治理效果永久、治理成本低廉、后期处理简易等特点而迅速得到了公众和学术界的广泛认可和关注。 超富集植物是重金属污染土壤植物提取修复技术的基础，所以超富集植物的筛选一直都是污染土壤修复研究的热点。有关超富集植物的最早报道，是 1583 年意大利植物学家 Cesalpino 在意大利托斯卡纳“黑色的岩石”上发现的特殊植物（后被命名为“ Alyss um berbolonii”，其叶片中 Ni含量达 7900mg/kg） 10。 有关 Zn2+超富集方面的最早报道则是 1885 年 Baumann 等的研究发现，发现了遏蓝
19、菜属 (Thlaspicalaminare)植物茎叶灰分中的氧化锌含量高达 17%11。根据 Cd2+超富集植物的标准，只有几种植物属于 Cd2+超富集植物。而目前发现 Cd2+富集浓度最高的是 Bkaer 在 1989 年在欧洲中西部的富集 Cd2+高达 2130mg/kh 的十字花科植物天蓝褐蓝菜 12。 “盐沼植物在促使重金属元素在滩地上发生沉降和积累等方面发挥着重要作用” 13。而田菁作为耐盐性强的植物，必然对其他金属离子的富集能力也很强。然而目前对田菁的超富集研究较少，而且主要集中在耐盐性方面，对重金属的超富集研究还是空白。因此，本文从植物生理学和生物化学的角度，从微观水平上丰富田菁
20、对生态污染的研究，同时希望提供一种有效的缓解生态污染的方案。 材料与方法 3 1 材料与方法 1.1 实验材料 在石化学院花园取 5 个 0.5m0.5m 的样方，分别在其中采集田菁幼苗；种子在舟山市种子公司购得。 1.2 试剂和药品 1.2.1 营养液： 改良霍格兰 （ Hoagland） 配方 ：（ pH=6.0） 四水硝酸钙 945mgL-1 硝酸钾 506mgL-1 硝酸铵 80mgL-1 磷酸二氢钾 136mgL-1 硫酸镁 493mgL-1 铁盐溶液 2.5ml 微量元素液 5ml 铁盐溶液： （ pH=5.5） 七水硫酸亚铁 2.78g 乙二胺四乙酸二钠（ EDTA.Na） 3.
21、73g 蒸馏 水 500ml 微量元素液： 碘化钾 0.83mgL-1 硼 酸 6.2mgL-1 硫酸锰 22.3mgL-1 硫酸锌 8.6mgL-1 钼酸钠 0.25mgL-1 硫酸铜 0.025mgL-1 氯化钴 0.025mgL-1 材料与方法 4 1.2.2 梯度培养液： Zn2+胁迫 ： CT： Hoagland 营养液； T1： 20mgL-1 Zn2+Hoagland 营养液； T2： 50mgL-1 Zn2+Hoagland 营养液； T3： 100mgL-1 Zn2+ Hoagland 营养液； T4： 150mgL-1 Zn2+ +Hoagland 营养液； T5： 200
22、mgL-1 Zn2+Hoagland 营养液； T6： 400mgL-1 Zn2+ +Hoagland 营养液。 Cd2+胁迫 ： CT： Hoagland 营养液； T1： 0.5mgL-1 Cd2+ +Hoagland 营养液； T2： 1mgL-1 Cd2+ +Hoagland 营养液； T3： 5mgL-1 Cd2+ + Hoagland 营养液； T4： 15mgL-1 Cd2+ +Hoagland 营养液； T5： 25mgL-1 Cd2+ +Hoagland 营养液； T6： 50mgL-1 Cd2+ +Hoagland 营养液。 1.2.3 实验主要试剂： 1.2.3.1 粗酶
23、液提取试剂（所有试剂均用蒸馏水配置） 50mmolL-1 磷酸缓冲液 (pH=7.8) ：取 8.5mL0.1molL-1NaH2PO4 与 91.5 mL0.1molL-1Na2HPO4 相混合后，在加入 100mL 蒸馏水 ； 100mmolL-1 磷酸缓冲液（ pH=6.0 ）：取 87.7mL0.1molL-1NaH2PO4 与 12.3 mL0.1molL-1Na2HPO4 相混合 ； 100mmolL-1 磷酸缓冲液（ pH=7.0 ）：取 39.0mL0.1molL-1NaH2PO4 与 61.0 mL0.1molL-1Na2HPO4 相混合 ； 酶提取液：以 50mmolL-1
24、 磷酸缓冲液 pH=7.8 的 PBS 配制，含有 0.1mmolL-1EDTA、质 量浓度为 0.3% Triton X=100 和质量浓度为 4%聚乙烯聚吡咯烷酮（ PVPP） 。 1.2.3.2 电解质相对外渗率测定 : 去离子水。 1.2.3.3 叶绿素含量测定试剂 ： 材料与方法 5 纯 丙酮； 80%丙酮：量取 80ml丙酮溶于 20ml H2O 中 。 1.2.3.4 蛋白质含量测定试剂 ： 考马斯亮蓝 G-250：称取 100mg 考马斯亮蓝 G-250，溶解于 50mL95%乙醇中，加入 100mL80%（ W/V）的磷酸，用水定容至 1000mL，过滤，此药品试剂常温下可保
25、存 30d； 标准蛋白质溶液：精确称取结晶牛血清蛋白 10mg，加水溶解并定容至100mL，即为 100g/mL 的标准蛋白质溶液； 1.2.3.5 脯氨酸含量测定 : 0.3mmol/L 甘露醇（ 54.65g 甘露醇溶于 1000mL 蒸馏水中） 标准脯氨酸溶液（ 10mg 脯氨酸溶于 100mL80%乙醇中，浓度为 100g/L） 酸性茚三酮试剂（ 2.5g 茚三酮于 60mL 冰醋酸和 40mL6mol/L85%磷酸中，加热（ 70 ）溶解。试剂 24h 内稳定） 1.2.3.6 超氧化物歧化酶活性测定 : 14.5mmolL-1dl-甲硫氨酸：取 0.2163g dl-甲硫氨酸用水定
26、容至 100ml； EDTA 溶液：用 50mmolL-1 PBS pH7.8 配制 3umolL -1 EDTA。用前配制、避光保存； NBT 溶液：用 50mmolL-1 PBS pH7.8 配制 2.25mmolL -1 NBT。用前配制、避光保存； 核黄素溶液：用 50mmolL-1 PBS pH7.8 配制 60umolL -1 核黄素。用前配制、避光保存。 1.2.3.7 过氧化物酶活性的测定： 愈 创 木酚 ， 30% 过氧 化氢 ， 20mmol/LKH2PO4 ， 100mmol/L 磷酸缓冲液（ pH6.0） 反应混合液： 100mmol/L 磷酸缓冲液（ pH6.0） 50mL，加入愈创木酚 28L，于磁力搅拌器 上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入 30%过氧化氢19L，混合均匀，保存于冰箱中。 1.2.3.8 过氧化氢酶活性的测定 ： 0.2mol/L pH7.8 磷酸缓冲液（内含 1%聚乙烯吡咯烷酮）； 0.1mol/L H2O2（用 0.1mol/L 高锰酸钾标定） 1.2.3.9 根系活力测定：
