1、 本科毕业论文 （ 20 届） 艾叶抗菌物质提取和脱色工艺的研究 所在学院 专业班级 食品科学与工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 目 录 摘要 1 ABSTRACT 2 1 前言 3 2 材料与方法 3 2.1 材料与试剂 3 2.2 结果与分析 5 3 材料和方法 8 3.1 材料、试剂与仪器 8 3.2 多糖分离工艺流程 9 3.3 多糖脱色 9 3.4 多糖保留率的测定 9 3.5 多糖抑菌性 10 4 结果与分析 10 4.1 多糖脱色率分析 10 4.2 多糖保留率分析 13 4.3 抑菌分析 13 5 讨论 14 5.1 多糖脱色方法 14 5.2 艾叶多糖的
2、应用前景 14 6 结论 14 参考文献 15 致谢 16 摘要 用自来水作为溶剂 , 研究艾叶中抑菌物质的提取条件 , 得出了最佳的提取条件。对艾叶提取物的脱色方法进行研究。 对艾叶提取物 分别采用过氧化氢、次硫酸钠、活性炭和大孔阴离子 D315 进行脱色。通过比较艾叶提取物的 脱色率、保留率及抑菌性可以发现，这四种方法对艾叶提取物都有脱色效果。双氧水和次硫酸钠脱色后抑菌物质保留率较低，抑菌效果较差。活性碳的脱色率是 87.8%，多糖保留率是 81.4%。树脂 D314 的脱色率是 83.3%，多糖保留率是 76.5%。可以看出树脂和活性炭脱色法明显优于过氧化氢和次硫酸钠脱色法，但是活性炭脱
3、色后的多糖溶液中残留下的活性炭很难清除，影响了多糖的品质，最好的方法是树脂脱色。 关键词 艾叶；抗菌物质；提取物；脱色 Abstract Use tap water as solvent, and research in the fungus suppression of moxa out the best extraction conditions, the extraction conditions. The leaf extract of ai discoloring method study. Moxa were used to extract hydrogen peroxide, t
4、imes and large orifice, activated carbon sodium D315 for decoloring anionic. Through comparing the extracts of moxa determined.the decolored rate, BaoLiuLv and antibacterial property can be found, the four methods of moxa extract of decolorization are. Hydrogen peroxide and times sodium bacteriostat
5、ic material after BaoLiuLv decolorizes low, antibacterial effect is poorer. The decolouring ratio is activated BaoLiuLv 81.4% 87.8%, polysaccharide is. Resin D314 determined.the decolored rate is the BaoLiuLv 9, polysaccharide is 76.5 percent. Can see resin and activated carbon decoloring method obv
6、iously better than the hydrogen peroxide and times discoloring method, but sodium sulfite is the polysaccharide solution after carbon decolouring of activated carbon is difficult to remain in the clear, influenced polysaccharide quality, best method is resin decoloring. Key words moxa； Antifungal su
7、bstances； extract； decoloring 1 前言 艾叶 （ Folium Artemisia argyi）它有叫大艾叶，杜艾叶，萎蒿，为菊科植物艾（ Artemisia argyi Levl et Vant）的叶子。它是一 种广泛分布的多年生草本植物 1。艾叶是常用的中医药，微温，味苦，无毒， 有理气血，逐寒湿 、 止血 、 温经、安胎等作用。用于少 腹冷痛，宫冷不孕，经寒不调，吐血，妊娠下血，崩漏经多；外治皮肤瘙痒。艾叶的主要成分为挥发油，艾叶挥发油的化学成分非常复杂，根据环境和气候条件的不同 , 不同产地的艾叶化学成分也有明显的差异 2。 其次艾叶中还含有多糖类 、 黄
8、酮类 、 微量元素等，正因为其成分的复杂性，艾叶的药理作用也表现出多样性，现代研究表明其有抗病毒 、 止血 、 平喘 、镇痛 、 抗菌 、 抗过敏 等作用 3。目前通过反复硅胶柱色谱、 Sep hadex LH220凝胶柱色谱、重结晶、制备 TLC等方法进行分离纯化的方法 ,共分离得到了 10个化合物 ,通过理化常数的测定和波谱分析等手段进行鉴定其化学结构 , 分别为 isotanciloide ( 1 ) 、伞形花内酯 ( um belliferone,2) 、瑞香素 ( daphnetin, 3 ) 、圣草酚 ( e riod ictyol,4) 、鼠李素 ( rham netin, 5)
9、 、高车前素 ( hisp idu lin,6) 、 L 222O 2甲基 2手 2肌醇 (L 222O 2m e thy l2ch iro2ino2s ito l, 7) 、豆甾醇 ( s tigm as terol, 8) 、胡萝卜苷 ( dau2cos te rol, 9) 、42甲氧基 232羟基苯酚 ( 42m e thoxyl232hydroxyphenol, 10) 。其中 ,化合物 10为新天然产物 ,化合物 1-5、 7为首次从艾叶中分离得到的。 艾叶挥发油的化学成分非常复杂，根据环境和气候条件的不同 , 不同产地的艾叶化学成分也有明显的差异。其次艾叶中还含有多糖类、黄酮类、
10、微量元素等，正因为其成分 的复杂性，艾叶的药理作用也表现出多样性，现代研究表明其有抗病毒、止血、平喘、镇痛、抗菌、抗过敏等作用 .有害微生物危害着人类的健康，所以研究防腐剂对食品安全所起的作用意义非常。研究表明艾叶中富含抗氧化活性物质，抑菌效果明显，所以研究艾叶的提取与脱色工艺非常重要。艾叶具有很强的抗氧化性，而且价格便宜，分布非常广泛。所以提高艾叶的提取和脱色工艺具有非常广阔的市场前景，对社会和市场经济具有非常重大的意义和价值。 2.材料与方法 2.1材料与试剂 艾叶 :购自舟山的一家药店 ;石油醚 (AR:天津大茂化学试剂厂 ); 无 水乙醇 (AR:湖南汇虹试剂有限公司 ); 浓硫酸 (
11、AR:湖南省株州开发区石化玻璃有限责任公司试剂厂 ); 苯酚 (AR:长沙市湘科精细化工厂 ); 葡萄糖 (AR:广州化学试剂厂 ); 三氯甲烷 (AR:长沙分路口塑料化工厂 ); 正丁醇 (AR:湖南师大化学试剂厂 )。 标准葡萄糖溶液 (0.04mg/mL):精确称取 105干燥恒重的葡萄糖 0.02g，加入适量蒸馏水溶解，定量转移到 500mL的容量瓶中，定容到刻度，摇匀，即得到葡萄糖标准溶液。 苯酚溶液 (5%):取苯酚 100g，加入铝片 0.1g， NaHCO30.05g，蒸馏 收集 180一 182馏分。称取 12.5g精制苯酚加入适量水溶解后转移至 250mL容量瓶中定容，置冰
12、箱内备用。 2.1.1仪器设备 电热恒温水浴箱 (上海浦东物理光学仪器厂 );101一 ZAB型电热鼓风干燥箱 (天津市泰斯特仪器有限公司 );四两装高速中药粉碎机 (武义县屹立工具有限公司 );队 2104伽 )系列电子天平 (上海民桥精密科学仪器有限公司 );200分光光度计 (尤尼柯 (上海 )仪器有限公司 );RE52一05旋转蒸发器 (上海亚荣生化仪器厂 );FT-IR360红外光谱仪 (美国尼高力公司 );SHB一 m循环水式多用真空 泵 (郑州长城科工贸有限公司 ) 2.1.2研究内容 2.1.2.1艾叶粗多糖提取的工艺流程 艾叶经 50烘干粉碎后，过 80目筛，精确称取一定量艾
13、叶粉加一定量蒸馏水，用频率为 20KHz的超声波处理，水浴浸提多糖，然后于 4000r/min离心 10min，弃沉淀，上清液在 0.095MPa， 60下浓缩至原体积的 l/5，再将浓缩液与预冷 4的 95%乙醇按 1:3(V/V)混合以沉淀多糖，置 4冰箱里过夜后，在 4000r/min下离心 10min，弃上清液，沉淀中加 50mL蒸馏水使其重新溶解，按 1.1加入 sevag试剂即 (正丁醇 ):(CHC13)=l:5脱蛋白， 4000r/min下离心 10min，冷冻干燥上层的糖液，得粗多糖。 2.1.2.2糖浸提过程中的单因素实验 超声波处理与水浸提是粗多糖提取的关键步骤，为此，选
14、择浸提过程中的温度、超声波处理时间、总浸提时间和液料比 (w/w)为因素，研究各因素下浸提液中的多糖提取率。 2.1.2.3多糖浸提过程中最佳工艺条件的确定 在单因素实验的基础上选择各个因素的 3个水平进行 L9(34)正交实验，以优化浸提过程的工艺条件。 2.1.2.4多糖浸提最佳工艺条件验证实验 在 正交实验确定的最佳工艺条件下进行放大实验，以验证粗多糖浸提过程中工艺条件的可靠性。 2.1.3测定方法 2.1.3.1测定葡萄糖含量的标准曲线制作 :苯酚一一硫酸法 4 测得标准曲线的回归方程为 : C=74.97A+4.5394 r=0.9993 其中 :x为葡萄糖含量 ( g);A为波长为
15、 490nm下的吸光度。 2.1.3.2艾叶粗多糖含量与葡萄糖含量间的换算因子的计算 精确称取 20mg自制艾叶粗多糖用少量 50热水完全溶解后，用蒸馏水定容至 100mL。吸 0.5mL糖液加 1.5mL的蒸馏水，另吸 2mL蒸馏水作空白对照 ;向 2管内各加人 1mL6%苯酚和5mL浓 H2SO4;静置 10而 n后，于 40水浴加热 30min，冷却后于 49Onm下测吸光度 A，代人标准曲线回归方程得粗多糖相当于葡萄糖含量（ g)，按下式计算艾叶粗多糖与葡萄糖之间的换算因子 F: F=W/(C*D) 式中 w，为称取粗多糖的质量（ g）， D为粗多糖稀释倍数 (实验中 D一 200)，
16、求得 F为2.15。 2.1.3.3粗多糖提取率的计算方法 粗多糖提取率 (%)=【 C*D*F/W0*106】 *100 式中 :C为粗多糖浸提液通过苯酚一硫酸法测定 A值再从回归方程求得的粗多糖相当于葡萄糖的含量（ g） ;D为稀释倍数 ;F为换算因子 ;W为艾叶干粉重量 (g)。 2.1.3.4粗多糖得率的计算 粗多糖得率 (%)二 (W2/W0)*100 其中 W2为制得的艾叶粗多糖质量 (g)， W0为艾叶干粉质量 (g)。 2.2结果与分析 2.2.1超声波处理时间对粗多糖提取率的影响 11.051.11.151.21.251.31.3525 30 35 40 45超声波时间/mi
17、n吸光度/A图 1 超声波时间对多糖提取率的影响 称取 5份艾叶粉末，每份 2g，分别放人烧杯并编号。各按液料比为 35:1加入 70mL蒸馏水，依次用超声波破碎细胞 25， 30， 35， 40， 45min后，置 于 80水浴保温浸提多糖，总浸提时间为 120min。各浸提液经离心得上清液，浸提液通过苯酚一硫酸法测定 A值，每份做3个平行样，结果见图 1。再经浓缩、乙醇沉淀、再溶解、 Sevag试剂脱蛋白、再离心后，苯酚一硫酸法测定上清液的 A值并换算成粗多糖提取率。 图 1显示，超声波处理时间对艾叶粗多糖提取率影响较为显著，处理 40min时粗多糖提取率最大。其他的处理时间下粗多糖提取率
18、显著下降。超过 40min，粗多糖提取率下降可能是随着时间增加，超声波的机械剪切作用导致部分多糖降解。因此，用超声波处理多糖浸提液的时间以 40min为宜。 00.20.40.60.811.250 60 70 80 90浸提温度/吸光度图 2 浸提温度对粗多糖提取率的影响 2.2.2浸提温度对粗多糖提取率的影响 称取 5份艾叶粉末，每份 2g，分别放入烧杯并编号。各按液料比为 35:l加入 70mL蒸馏水，超声波 4， min，浸提温度分别为 60， 70， 80， 90， I000C，浸提时间为 120min。各浸提液的后续处理同 2.2.1。结果见图 2。 图 2显示，浸提温度对艾叶粗多糖
19、提取率影响显著。 80时，粗多糖提取率最大。温度增加，溶解度增大，有利于多糖的溶出，但随着温度的，部分多糖水解为单糖或低聚糖，并且易使蛋白质变性，若艾叶 多以糖蛋白形式存在必然导致提取率下降，在实验中也显示高 于 80抽提的液用 Sevag试剂脱蛋白时沉淀明显增加，沉淀上现了一些黄色的胶状物质，推测艾叶多糖确实蛋白或蛋白多糖形式存在。因此，多糖浸提过程浸提温度 80为宜。 2.2.3总浸提时间对粗多糖提取率的影响 称取 5份艾叶粉末，每份 2g，按液料比为 30:1加入 60mL蒸馏水，超声波巧 min粉碎细胞，置于 85水浴保温浸提多糖，浸提时间分别为 60， 90， 120， 150， 1
20、80min。各浸提液的后续处理同 2.2.1结果见图 3。 00.10.20.30.40.50.60.70.80.9160 90 120 150 180浸提时间/min吸光度/A图 3 总提取时间对粗 多糖提取率的影响 图 3显示，总浸提时间对粗多糖提取率的影响较大。当总提取时间为 150min时，粗多糖提取率最高，时间大于 150min时粗多糖提取率下降。原因可能是由于条件下浸提温度较高 (80 )，处理时间过长会使糖中的糖蛋白组分缓慢变性析出，导致粗多糖提下降。实验中也显示随着总的浸提时间增加，用 sevag法脱蛋白时产生的沉淀也增加。因此，多糖总浸提时间以 150min为宜。 2.2.4
21、液料比对粗多糖提取率的影响 称取 5份艾叶粉末，每份 2g，放人烧杯并编号。按体积比为 20:l， 25:1， 30:l， 35:l， 40:1依次加入 40， 50， 60， 70， 80mL蒸馏水，超声波巧 min，置于 80水浴浸提 120min。各浸提液的后续处理同 2.2.1，结果见图 4。 0.580.60.620.640.660.680.70.720.7420 25 30 35 40料液比吸光度/A图 4 料液比对粗多糖提取率的影响 图 4显示，（图中料液比分别为 20:1； 25:1； 30:1； 35:1； 40:1）液料比对粗多糖提取率的影响较为显著，液料比为 35:1时，
22、粗多糖提取率最大。增加液料比有利于粗多糖的溶出，但太大时使后续浓缩时间明显增加，加上浓缩是在较高温度下 (80 )进行，容易使粗多糖中的糖蛋白变性并在脱蛋白时析出，导致粗多糖提取率下 降。因此，多糖浸提的液料比以 35:1为宜。 2.2.5多糖浸提过程中最佳工艺条件的确定 根据单因素试验结果，选择上述各因素的 3水平进行 L3(34)正交实验，因素与水平的设计见表 l。 表 1 正交实验的因素水平表 水平因素 （ A）浸提温度 / （ B）总浸提时间 /h （ C）超声波 （ D）料液比 1 70 90 35 25:1 2 80 120 40 30:1 3 90 150 45 35:1 称取
23、9份艾叶粉 末，每份 2g，放人烧杯并编号，各试验号按表 2设计的浸提条件对艾叶进行浸提。各浸提液的后续处理同 2.2.1，以吸光度考察指标进行极差分析，结果见表 2。 表 2正交实验结果 水平因素 （ A）浸提温度 / （ B）总浸提时间 /min （ C）超声波处理时间/min （ D）料液比（质量比） 吸光度 A 1 70 90 35 25:1 1.667 2 70 120 40 30:1 1.624 3 70 150 45 35:1 1.552 4 80 90 40 35:1 1.724 5 80 120 45 25:1 1.728 6 80 150 35 30:1 1.808 7 9
24、0 90 45 30:1 1.775 8 90 120 35 35:1 1.791 9 90 120 40 25:1 1.774 1 4.845 5.168 5.268 5.171 2 5.264 5.145 5.124 5.209 3 5.342 5.136 5.057 5.069 K1 1.614 1.722 1.755 1.723 K2 1.753 1.714 1.707 1.736 K3 1.780 1.711 1.685 1.689 极差 R 0.165 0.010 0.069 0.033 表 2显示，在考察的 4个因素中，对粗多糖提取率影响最显著的是浸提温度，超声波处理时间次之，液
25、料比再次之，总浸提时间对提取率影响最小 ;浸提过程的佳工艺条件为A2B3C1D2，即 :浸提温度 80oC、浸提时间 150min、超声波作用 35min，液料比为 30:l。 比较多糖浸提过程的单因素试验与正交试验的果，可发现 2种试验确定的工艺条件有所差异。单因素素试验显示浸提温度为 80、浸提时间为 150min粗多糖提取率最大 ;而正交实验结果显示浸提温度为 80、浸提时间为 4h粗多糖提取率最大。表明浸提度与浸提时间之间 存在着相互影响，即当浸提温度增加，浸提时间应相应减少 ;浸提温度降低，浸提时间可适当增加。这也从另一侧面证实了艾叶多糖中确实含有对温度较为敏感的糖蛋白。 2.2.6
26、最佳浸提条件的验证及放大试验 称取艾叶粉末 25g，加进 1000mL蒸馏水，超声波破碎细胞 40min后置于 80中水浴，总浸提时间为 2h，各浸提液的后续处理同实验 4.2.1，苯酚一硫酸法测定上清液的 A值并换算成粗多糖提取率为 6.43%，高于正交试验的结果，说明试验中 得出的工艺条件是可靠的。将该粗多糖抽提液冷冻干燥得艾叶粗多糖，得率约为 6.13%。 3材料和方法 3.1材料、试剂与仪器 纤维素酶：北京奥博星生物公司；无水乙醇、大孔阴离子交换树脂 D315、活性炭：天津市化学试剂厂。 SIGMA 3K-15台式离心机：德国 Sigma公司 ;RE-3000型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂； 722型可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司。
