1、 本科毕业论文 （ 20 届） 大肠杆菌天然复合防腐剂研究 所在学院 专业班级 食品科学与工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 目录 摘要 2 ABSTRACT3 1 前言 . 3 1.1 概述 . 3 2 实验材料、主要仪器与试剂 . 4 2.1 实验材料 . 4 2.2 主要仪器 . 4 2.3 主要试剂 . 4 3 实验方法 . 4 3.1 菌种来源 . 4 3.2 培 养基制备 . 5 3.3 乌梅和鱼腥草天然抑菌剂的制备 . 5 3.4 实验方法 . 5 4 实验方案 . 5 4.1 乌梅提取液和鱼腥草提取物复合抑制大肠杆菌效果研究 . 5 4.2 乌梅提取物和鱼腥
2、草提取物复合抑制大肠杆菌的效果研究 . 6 5 结果分析 . 6 5.1 乌梅提取液和鱼腥草提取物复合抑制大肠杆菌的效果及分析 . 6 6 小结 .11 致谢 18 附录 119 附录 223 1 摘要 食品防腐到目前为止仍然是食品行业关注热点之一，随着食品安全问题的不断发生，化学防腐剂的食品安全问 题日益突出，安全性高、防腐效果好的天然防腐剂成为今后食品保藏的主要研究方向。本文以我国资源保有量大的天然植物为原料，以大肠杆菌为实验菌种，研究了乌梅和鱼腥草对大肠杆菌的抑菌效果研究，分别研究了其对大肠杆菌的最低抑菌浓度等特性，以此为基础进行了复配，并优化了两种天然防腐剂的最佳配比。 关键词 最低抑
3、菌浓度；大肠杆菌；防腐剂；复配 2 Study on the natural compound preservative of E.coli Abstract With the continuous improvement of living standards and growing concern on health, it is the safety of food preservatives put forward higher requirements. This preliminary study of the ebony and Houttuynia antimicrobial
4、effect,the study result showd their minimal inhibitory concentrations(MIC). On this basis, the two components were mixed, and optimize complex Houttuynia ebony and the best ratio of natural preservatives. Key words MIC;E.coli; Preservative ;Complex; 3 1 前言 1.1 概述 天然防腐剂是目前食品保藏的研究热点之一，同化学防腐剂 相比 ，天然防腐剂
5、具有以下优点：如防腐能力强、食品安全性好、溶解度及热稳定性较好。但实际应用中天然防腐剂也有较大的缺点，如抑菌谱较窄，应用于食品保藏中如仅采用单一天然防腐剂则抑菌效果较差 1。为了解决上述问题，在了解不同生物防腐剂抑菌谱的基础上，利用几种生物防腐剂抑菌谱交叉后能够扩大抑菌范围、提高抑菌效果的原理，实行天然防腐剂的复配成为今后天然防腐剂应用的重要方向。 近年来，我国食品工业发展极为迅速，产值逐年提高，到目前为止已成为我国工业产业 中的龙头产业。但到目前为止，食品防腐仍然是我国食品工业中亟待解决的问题之一。据联合国粮农组织有关数据统计：全世界每年因食品保藏手段落后而导致的粮食和食品的损失高达 20%
6、。以此计算，全世界每年由于食品腐败而导致的损失高达数十亿美元。食品腐败不仅会造成食品营养价值的降低和损失，严重时还可导致食物中毒。因此，发展现代保藏技术、降低由于食品腐败而导致的损失刻不容缓。总体而言，食品腐败变质的原因主要是由于微生物的作用。微生物广泛存活于环境中，食品原料如保藏条件不适，很容易发生腐败变质，尤其是蛋白质、碳水化合物含量丰富 的肉类食品原料。食品保藏手段的发明和发展也是针对这一主要因素，如烟熏、盐渍、冷冻或干燥等。但就保藏手段的成本和投入而言，使用防腐剂是目前所有食品保藏手段中最为经济、简单的方法。目前食品工业中使用防腐剂是最为常见的方法。所使用的防腐剂按其来源可分为连大类：
7、 （ 1）化学防腐剂化学防腐剂是人工合成的防腐剂，目前食品工业中常用的化学防腐剂主要包括苯甲酸及苯甲酸盐、山梨酸及山梨酸盐、对羟基苯甲酸及其衍生物等；除上述有机酸累防腐剂外、无机化学防腐剂如二氧化硫、亚硫酸盐等也是常用的化学防腐剂。化学防腐剂在目前食品工业中应 用极为广泛，这主要是由于其生产成本低、溶解度高、应用方便。但随着目前人们对食品安全的日益重视，尤其是近年来食品安全事件屡发，化学防腐剂的食品安全性日益受到怀疑，如有资料证明：苯甲酸及苯甲酸钠可导致豌豆尖细胞发生基因突变。尽管这一现象在大鼠等高等动物身上还未证实，这也为苯甲酸及其钠盐等化学防腐的食品安全性敲响了警钟。 （ 2）天然防腐剂：
8、天然防腐剂是以天然动植物或微生物为原料，从中提取的对微生物具有较强抑制作用的天然物质。按其来源可分为动物源、植物源和微生物源三大类。其中动物源和微生物源这两类天然防腐剂距离实际 应用还有相当一段路要走。这主要是由于目前动物源天然防腐剂主要来源为各种动物体内提取的蛋白肽类物质，此类物质在动物体内本身含量极低，导致提取出来的蛋白肽类天然防腐剂成本极高；而微生物源天然防腐剂目前市场上见到的仅有乳酸链球菌素（ Nisin）和纳他霉素，这两类微生物源天然防腐剂抑菌谱较窄。我国天然植物资源丰富，诸多天然植物均有较好的抑菌效果。这为植物源天然防腐剂的开发和应用奠定了坚实基础。 尽管 天然生物防腐剂具有抗菌性
9、强、安全无毒、水溶性好、热稳定性好等特点，但普遍存在抑菌谱狭窄的问题，仅使用某一种 天然防腐剂以军 效果较差 2。 未改变这一现状 ， 国内外诸多研究人员将注意力转移到4 天然防腐剂的复配上，将几种抑菌谱不同的天然防腐剂进行复配后可扩大其抑菌谱、提高抑菌效果 3。 本文的研究目的就是通过两种天然防腐剂进行一定比例复配，研究其对大肠杆菌抑菌效果。 2 实验材料、主要仪器与试剂 2.1 实验材料 乌梅、鱼腥草，购于舟山存德堂药房，制备成提取液后备用。 2.2 主要仪器 仪器名称 型号 厂家 烘箱 DHG-9023A 上海林频环境试验设备厂 冰箱 BCD-199CHG2A 新飞 摇床 ZD-85（
10、A） 金坛市盛蓝仪器制造有限公司 双功能气浴恒温振荡器 /摇床 培养箱 DNP 型 常州菲普实验仪器厂 水浴锅 HH-S1 金坛市佳美仪器有限公司 灭菌锅 YXQ一 SG46一 2805 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 电子天平 FA1004 型 上海精科天平 超级净化台 SW-CJ 一 1F 苏州净化设备有限公司 紫外可见光分光光度计 UV 一 1201 型 北京瑞利分析仪器公司 2.3 主 要试剂 试剂 厂家 营养琼脂 南京一基生化科技有限公司 蛋白胨 南京一基生化科技有限公司 牛肉膏 南京一基生化科技有限公司 氯化钠 潍坊海巨化工有限公司 氢氧化钠 广东汕头市西陇化工厂 葡萄糖 广东汕头
11、市西陇化工厂 磷酸二氢钾 国药集团化学试剂有限公司厂 3 实验方法 3.1 菌种来源 大肠杆菌 (E.coli)由市售青占鱼、实验室贮藏南美白对虾及自然水体中分离获得。在此实验中我们将青占鱼中的大肠杆菌设为 1 号，南美白对虾中 的大肠杆菌设为 2 号，自然水体中分离的大肠杆菌设为 3 号。 5 3.2 培养基制备 细菌固体培养基 :牛肉高蛋白胨营养琼脂培养基，具体配料为牛肉膏 5g，蛋白胨 10g，氯化钠 5g， PH7.2， 100mL 水 细菌液体培养基 (g/L): 牛肉膏蛋白胨培养基，不加入营养琼脂。 3.3 乌梅和鱼腥草天然抑菌剂的制备 乌梅和鱼腥草抑菌剂的制备方法参考吴传茂 等
12、4和张颖 5。 3.4 实验方法 3.4.1 菌悬液 的 制备 6-7 菌悬液的制备：从试管斜面上以接种环挑取少量菌落接种于 250mL 牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于 37摇床上振荡培养，以未接种的液体培养基做空白，每隔 2h在 600nm波长下比色测定，同时做细菌总数测定，绘制实验菌种浓度与吸光值坐标图，挑取菌浓度为 103cfu/mL 的菌悬液，菌浓度达到要求后立刻将三角瓶保藏于冰箱中备用 8 一 9，三角瓶菌液三天之内使用。菌体浓度检测方法采用细菌总数检测法。 3.4.2 最低抑菌浓度 MIC 实验方法 10 一 12 在培养基中加入不同浓度的天然抑菌剂，接入实验菌种， 37条件下培养
13、，在指定时间内不长菌的最小天然抑制剂浓度为最低抑菌浓度。 4 实验方案 4.1 乌梅提取液和鱼腥草提取物复 合抑制大肠杆菌效果研究 4.1.1 乌梅提取液和鱼腥草提取物对大肠杆菌的最低抑菌浓度实验 在参考前人资料和初步实验的基础上选取合适的浓度对获得的大肠杆菌进行最低抑菌浓度实验。乌梅提取液浓度选取为 :10mg/mL， 20mg/mL， 30mg/mL， 40mg/mL;鱼腥草提取物的浓度选取为 :1mg/mL， 2mg/mL， 3mg/mL， 5mg/mL， 9mg/mL。 4.1.2 乌梅提取液和鱼腥草提取物单独作用对大肠杆菌抑制效果的单因素实验 在 3 个实验菌种中选取生长力最强的的大
14、肠杆菌做为实验菌种 13，进行抑菌效果的单因 素实验和多因素实验。单因素实验水平由最低抑菌浓度实验获得，所确定的乌梅提取液的浓度为 :12.2mg/mL， 18.3mg/mL， 22.5mg/mL， 36.8mg/mL;鱼腥草提取物的浓度为 :1mg/mL， 1.25mg/mL， 1.5mg/mL， 1.75mg/mL， 2mg/mL。 4.1.3 不同浓度乌梅提取液和鱼腥草提取物复合作用对大肠杆菌抑制效果的全面实验 在单因素实验结果基础上选择合适的浓度水平进行多因素实验，因素水平如表 1 所示： 表 1 乌梅提取液和鱼腥草提取物复合作用试验因素水平表 因素 水平 6 4.1.4 乌梅提取液和
15、鱼腥草提取物的复合作用最佳抑菌浓度对大肠杆菌抑制试验 取多因素实验确定的乌梅提取液和鱼腥草提取物的最佳复合抑菌浓度进行大肠杆菌抑菌效果实验，同时绘制天然抑菌剂对大肠杆菌的生长曲线已确定抑菌剂对大肠杆菌的抑菌效果。 14 一 15 4.2 乌梅提取物和鱼腥草提取物复合抑制大肠杆菌的效果研究 天然防腐剂共存的条件下可能会出现拮抗作用，影响实验人员对该 防腐剂抑菌效果的观测。故在实验过程中实验人员将乌梅和鱼腥草提取液共同作用于同一种微生物，以观测其抑菌效果。 5 结果分析 5.1 乌梅提取液和鱼腥草提取物复合抑制大肠杆菌的效果及分析 5.1.1 乌梅提取液和鱼腥草提取物对大肠杆菌的最低抑菌浓度 通过
16、乌梅提取液和鱼腥草提取物单独作用对大肠杆菌的最低抑菌浓度实验，在不同实验条件下，两种天然抑菌剂抑菌效果如表 2、表 3 所示： 表 2 乌梅提取液不同抑菌浓度作用效果 菌种编号 浓度 /mg mL 1 空白 10 20 30 40 1 2 3 注：“ +”表示菌落数量大于 100，“ +”表示菌落综述低于 100，“ +”表示菌落少于 10 个，“”表示无菌 由表 2 可见乌梅提取液的最低抑菌浓度为 20mg/mL。在 10mg/mL 时对 1 号菌和 3号菌抑制效果比较好，而乌梅提取液浓度为 20mg/mL 对 2 号菌才有较强的抑制作用。这表明：在相同条件下，在市售青占鱼 、 南美白对虾及
17、自然水体中分离 3 个菌株中， 2 号菌生命力最旺盛。 表 3 鱼腥草提取物不同抑菌浓度作用效果 菌种编号 浓度 /mg mL 1 1 2 3 4 乌梅提取液 /mg mL 1 12.2 18.3 22.5 36.8 鱼腥草提取物 /mg mL 1 1 1.25 1.5 1.75 7 空白 1 2 3 5 9 1 2 3 注：“ +”表示菌落数量大于 100，“ +”表示菌落综述低于 100，“ +”表示菌落少于 10 个，“”表示无菌 由表 3 可见，鱼腥草提取物的最低抑菌浓度均为 2mg/mL，对三种实验菌株的 MIC值相同。从表 2 和表 3 中可以看出，在所选用的 3 株大肠杆菌中，
18、2 号菌的菌落数量最多。故今后实验中选定 2 号菌株作为实验菌种。从表中还可以看出，乌梅提取液的最低抑菌浓度为 20mg/mL，鱼腥草提取物最低抑菌浓度为 2mg/mL，故可以确定单因素水平乌梅提取液为 520mg/mL，鱼腥草提取物为 12mg/mL。 5.1.2 乌梅提取液单独作用抑制大肠杆菌的效果及分析 图 1 乌梅提取液抑菌效果 由各种浓度的 乌梅提取液 抑菌曲线可知， 乌梅提取液 浓度越高， 相同培养时间下菌液吸光值越小，液体培养基澄清 度越高，即菌数越低，对大肠杆菌抑制效果越强。在图1 中 可以观察到 5mg/mL 的 乌梅提取液在短时间内 内 对大肠杆菌抑制效果极为明显；10mg
19、/mL 的 乌梅提取液仅能在短时间（ 7 h） 内 对大肠杆菌具有较好的抑制效果；而浓度为 15mg/mL 与 20mg/mL 的乌梅提取液对大肠杆菌的抑制效果明显强于低浓度乌梅提取液。从图 1 中还可以看出，在所选用的乌梅提取液浓度中， 20h 后大肠杆菌浓度都显著升高。这表明四种实验浓度对大肠杆菌的抑菌浓度都没有达到满意的试验效果，仅靠乌梅提取液一种天然防腐剂抑菌效果较差。 5.1.3 鱼腥草提取物 单独作用抑制大肠杆菌的效果及分析 不同浓度鱼腥草提取物单独作用对 2 号菌的抑菌曲线如图 2 所示： 8 图 2 鱼腥草提取物抑菌效果 由各种浓度 鱼腥草提取物 的抑菌曲线 在 图 2 可知，
20、 鱼腥草提取物 浓度越高， 相同培养时间下菌液 OD 值越小，液体培养基澄清度越高，即菌数越低，对大肠杆菌的抑菌效果越强， 这与不同浓度的 乌梅提取液 抑菌效果 存在 类似情况 。其中 1mg/mL 与 1.25mg/mL的 鱼腥草提取物 只能在前 8 个小时内抑制住 大肠杆菌 生长，而后 培养基吸光值明显增大 ，生长曲线的斜率明显上升，这表明鱼腥草提取液在较低浓度下对大肠杆菌抑菌效果较差；而高浓度下尽管鱼腥草抑菌浓度显著提高（其中 1.75mg/mL 实验组中大肠杆菌在 24h 后才出现显著增长），但所有实验组中大肠杆菌仍然在 24h 数量有显著上升。这表明四种实验浓度对大肠杆菌的抑菌浓度都
21、没有达到满意的试验效果，仅靠鱼腥草提取液一种天然防腐剂抑菌效果也较差。此外，从图 2 中还可以看出，较低浓度的鱼腥草提取 液（ 1mg/mL与 2mg/mL） 抑菌效果 差距明显 ， 这表明 在最低抑菌浓度实验中所有菌在 鱼腥草提取物1mg/mL 时生长量较大，而在 鱼腥草提取物 2mg/mL 时 大肠杆菌不生长 。 这也从侧面证明了鱼腥草 MIC 测定的正确。 5.1.4 不同浓度的乌梅与鱼腥草复合作用全面实验结果及分析 考察乌梅与鱼腥草复合作用对 2 号菌的抑制效果。不同复合抑菌浓度下，其抑菌效果如图 3、图 4、图 5、图 6 所示 : （ 1） 5mg/mL 乌梅与不同浓度鱼腥草复合作用效果 :
