1、 本科毕业论文 （ 20 届） 发酵型鱼蛋白的抗氧化性影响因素研究 所在学院 专业班级 食品科学与工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 - 2 - 目录 摘要 1 ABSTRACT2 1 前 言 3 1.1 食品 抗氧化剂的应用状况 3 1.2 国内外食品天然抗氧化剂的研究现状 3 1.3 食品抗氧化剂开发方向 4 1.4 本课题研究的意义 5 2 实验材料、主 要试剂与 仪器 5 2.1 实验材料 6 2.2 主要 试剂 6 2.3 主要 仪器 6 3 实验方法 7 3.1 DPPH 法测定自由基清除率 7 3.2 发酵型鱼蛋白的抗氧化稳定性研究 7 4 结果 与讨论 8
2、4.1 加热 温度和时间对样品 DPPH自由基清除率的影响 8 4.2 酸碱性对样品 DPPH自由基 清除率的影响 8 4.3 人工胃液和人工肠液对样品 DPPH 自由基清除率的影响 9 4.4 食品中常见添加剂对样品 DPPH 自由基清除率的影响 10 5 结论 11 参考文献 11 致谢 13 1 摘要 本文以海水低值鱼蛋白发酵液为原料，以 DPPH 自由基清除率为指标，研究不同加热温度和时间、不同 pH 值和人工胃液和人工肠液对该 鱼蛋白生物发酵液的抗氧化性能影响，同时考察了与常见食品添加剂（盐、糖）混合后的抗氧化性变化。实验结果表明热处理后的样品在 90 ，加热 30min 后的清除率
3、最大为 97.1%。且清除率随着时间的增加而增加。与pH 值缓冲液混合后，在偏酸性下，最大清除率出现在与 pH5 缓冲液混合后，为 81.4%；在偏碱性下，清除率随着碱性的 增加而增加 。与人工胃液混合 90min 后清除率为 96.4%，达到最大。而与人工肠液混合后清除率的最大值为 85.3%，出现混合 2h 后。与常见食品添加剂混合后，清除率变化不同。与 10%食盐水混合后的清除率 达到 94%，而与 15%食盐水混合后清除率只有 53.3%。与 25%糖水混合后清除率达到最大，为 71.7%。 关键词 鱼蛋白；发酵液 ； 抗氧化性 ； 影响因素 2 Study of Influencin
4、g factors on the Antioxidative activity of Fermented fish protein Abstract In this text, further to the fish protein fermented as raw material, with DPPH free radical scavenging for index. Study different heating temperature and time, different pH value and artificial gastric juice and artificial in
5、testinal fluid to the fish protein biological fermented antioxidant properties influence . Meanwhile investigate the antioxidative activity change of mixing with common food additive (salt, sugar). Results show that under heat treatment when the sample in 90 ,the scavenging capacity is maximum, when
6、 the hearting time is 30 minute ,the scavenging rate reaches 97.1% ,and along with heating time increases. After mixing with pH buffer，under the partial acidic， Maximum scavenging capacity appears in mixing with pH 5 buffer,the scavenging rate is 81.4%. Under the partial alkaline,the scavenging capa
7、city increases along with alkaline increases. And the time mixing with artificial gastric juice is 90min, the scavenging capacity is maximum,the scavenging rate reaches 96.4%. While mixing with artificial intestinal fluid ,the maximum scavenging capacity appears after mixing 2h, the scavenging rate
8、is 85.3%.And mixing with food additives, the scavenging capacity changes differently. The scavenging rate is 94% after mixing with the salt water density 10%,while mixture with sugar water density 15% , the scavenging capacity is only 53.3% .When mixing with the sugar water density 25%, the scavengi
9、ng rate is71.7%,is maximum. Key words Fish protein； Fermented； Antioxidative activity； Influencing factor 3 1 前言 1.1 食品 抗氧化剂的应用状况 1.1.1 食品 抗氧剂的定义 抗氧化剂是指能防止或延缓食品氧化性和延长贮藏期的 食品添加剂 1。作为食品添加剂的抗氧化剂应具备以下条件：具有优良的抗氧化效果；本身及分解产物都无毒无害；稳定性好，与食品可以共存，对食品的感官性质（包括色、香、味等 )没有影响；使用方便，价格便宜 2。 1.1.2 食品抗氧化剂的分类 按来源可分为人工合成抗
10、氧化剂（如 BHA、 BHT、 TB-HQ等）和天然抗氧化剂（如茶多酚、植酸等）。 按溶解性可分为油溶性、水活性和兼溶性 3类。油溶性抗氧化剂有 BHA、 BHT等；水溶性抗氧化剂有维生素 C、茶多酚等；兼溶性抗氧化剂有抗坏血酸棕榈酸酯等。 按作用方式可分为 自由基吸收剂、金属离子螯合剂、氧清除剂、过氧化物分解剂、酶抗氧化剂、紫外线吸收剂或单线态氧淬灭剂等。 1.1.3 食品抗氧化剂的作用原理 食品抗氧化剂的作用原理可以概况为以下 4种： （ 1）通过抗氧化剂的还原作用，降低食品体系中的氧含量； （ 2）中断氧化过程中的链式反应，阻止氧化过程进一步进行； （ 3）破坏、减弱氧化酶的活性，使其不
11、能催化氧化反应的进行； （ 4）将能催化及引起氧化反应的物质封闭，如络合能催化氧化反应的金属离子等 3。 1.1.4 食品抗氧化剂的应用现状 目前，国内肉类食品主要使用的抗氧化剂为 TBHQ、 BHA、 BHT、异抗坏血酸及其钠盐等。动物实验表明人工合成抗氧化剂具有一定的毒性和致癌作用 4、使其安全性受到疑虑。各国对于人工合成抗氧化剂的使用十分谨慎， BHT及 BHA在日本使用受限，其中 BHT仅被允许在冷冻食品、干燥性食品、脂肪和油类中使用； BHA主要被用于干的沙丁鱼； TBHQ在日本是禁止使用的。美国、欧共体等国已禁止使用合成抗氧化剂，许多国家对其添加量已加以限制 5。 1977年美国
12、FDA已将 BHT从 GRAs(公认安全名单 )中除名 6 随着人们对食品安全性要求的提高和对人工合成品的安全 事件疑虑增加，人们期待着开发出安全、高效、无毒的纯天然抗氧化剂。 1.1.5 几种市售的新型抗氧化剂 目前巳开发投放市场的新型抗氧化剂有如下几种：芝麻油浓缩物、棉花素、芸香苷、类黑精、咖啡酸、愈创树脂、鱼精蛋白，甘草索等 7。 1.2 国内外食品抗氧化剂的研究现状 4 植物源食品抗氧化剂主要是指来源于植物并能够在浓度极低的条件下起到抑制或延迟食品氧化作用的天然抗氧化剂 8。植物在进行光合作用时，会产生未配对电子的原子或功能基团的活性氧自由基（ ROS），自我保护机制使其产生各种具有抗
13、氧化活性的化合物来清 除这些自由基，而具有抗氧化活性的化合物即为植物抗氧化剂的来源，按目的的有效物质不同，主要分为多酚类、黄酮类、多糖类、植酸和氨基酸类等 1。 1.2.1 从中草药开发天然食品抗氧化剂 目前对于天然食品抗氧化剂的研究，国外都集中在中草药，从中草药的提取、筛选、抗氧化性能和机理进行了大量试验研究，同时也补充和完善了有关食品抗氧化剂的法规 。韩国的 S.Y.KIM等人对 180种中药的甲醇提取物进行试验，发现其中的 44种对于油酸有强抗氧化能力，进一步以油酸甲酯为底物试验，发现其中的 11种中药如乌附子、细辛、白屈菜、甘草 、黄苓和丁香等有显著的抗氧化能力。又发现不同极性提取物的
14、抗氧化作用不同，黄苓、甘草的甲醇提取物的抗氧化性强，而石油醚、乙酸乙酯提取物的抗氧化性较弱，以 HPLC分析表明其中含有大量的生育酚 9。 卫生部公布的药食共用的名单中选取原料，例如，姜、黑芝麻、甘草、丁香、紫苏等。日本一家公司从甘草中提取一种抗氧剂，对植物油、动物油都能起到良好的抗氧效果，同时还能防止风味劣化和色素褪色，添加量只有 0.05 ，且耐热 10。我国许多学者不仅对中草药提取物的抗氧化性能进行了试验，而且还对提取物中抗氧化成分进行了研究。余世 望等人研究了 60种食药两用植物的抗氧化活性，其中丁香、白果等比茶多酚强。我国台湾学者 Su等人用乙醇提取 195种中草药，研究表明其中 2
15、2中强于等重量的生育酚的抗氧化能力。其中金锦香、石榴皮、马马鞭草的甲醇提取物和金锦香的抗氧化能力均强于 BHA。 1.2.2 从香辛料研究天然食品抗氧化剂 香辛料目前也是国内外研究的一个重点，目前研究表明香辛料的酚类及其衍生物具有很强的抗氧化性能。香辛料是指一类具有芳香和辛香等典型风味的天然植物性制品，或从植物（花、叶、茎、根、果实或全草等）所提取的某些香精油。日本中谷延二从迷迭 香中分离出四种抗氧化组分，这些酚系萜类化合物的抗氧化活性为合成抗氧化剂 BHT和 BHA的四倍，又从百里香中分离出与 BHT抗氧化能力相当的二苯化合物 11。 Kikuzaki和 Nakatani从生姜中分离出 14
16、种酚类化合物，包括姜酮和姜醇的 12种化合物具有比生育酚强的抗氧化能力 12。Yanishlieva等报道了用夏日薄荷的乙醇提取物作为天然抗氧化剂使用，可以抑制葵花油的氧化 13。 1.2.3 其他天然食品抗氧化物质 除上述植物外，还有许多植物原料中都含有抗氧化物质，从 60年代就进行开发利用，国际上处于 领先地位是德国、法国、日本、韩国、美国，主要是将银杏叶的黄酮类物质用于食品、医药、保健食品和化妆品。据报道，加拿大学者研究发现 Canola粕乙醇提取物的抗氧化能力与 BHA、 BHT相当； Katsuzak等从实验中发现芝麻中含有木脂素及其糖甙类化合物，芝麻油中主要抗氧化成分是芝麻明醇，它
17、是芝麻酚在脱色过程中受到酸性白土的催化作用，经分子内官能团转移 5。 5 1.3 食品抗氧化剂开发方向 1.3.1 海洋生物中 水解蛋白方面的开发 一些海洋生物蛋白的水解液具有抗氧化活性。而且海洋生物抗氧化物质可以通过各种途径清除内 源性和外源性自由基，具有抗氧化作用强、种类多、结构复杂、副作用低等特点 14例如，毛鳞鱼是一种银色的小鱼。在日本，雌毛鳞鱼是种很普遍的食物而雄毛鳞鱼正在开发利用中，最近， Shahidi等报道了毛鳞鱼蛋白水解液作为抗氧化剂广泛地应用于酒类、蛋白填充乳化产品，谷类食品等中。他们应用 Sephad-ex G一 100凝胶过滤色谱柱从毛鳞鱼水解液中分离出四种肽类物质，发
18、现其中一种肽在亚油酸中具有显著的抗氧化效果 15。 1.3.2 非食品工业用的抗氧化剂的开发 天然抗氧化剂是国内外的发展趋势。但人工合成的抗氧化剂也 有高效、低毒的。例如我国批准使用的硫代二丙酸二月桂酯 (DLTP)能有效地控制油脂氧化过程的过氧化 (POV)其抗氧化活性优于 BHA、 BHT、 PG、 -VE、 VC等。与合成维生素 c衍生物、合成生育酚、天然愈创树脂相比具有更高的安全性，与茶多酚安全性相同，但便宜得多。 LD5010g kg.w，安全评价为 A(1)(联合国食品添加剂专家委员会评价分类 )即高安全性。具有良好的脂溶性和高温稳定性，不着色。 DLTP广泛用作塑料、树脂、橡胶、
19、航空汽油等的抗氧化剂 16。由此我们得到启示：非食品工业用的抗氧化剂有可能经新 工艺的开发而成食品级抗氧剂，且安全性与天然抗氧化剂相比毫不逊色。 1.3.3高效性 、 安全性、营养性方面的开发 随着人们生活水平的提高，对食品添加剂的毒理学评价和食用安全性提出了更高的要求。出了关注其安全性之外，对于食品抗氧化剂来说，如若同时富含营养，对人们健康有利，无疑会令其身价倍增。因此新型的食品抗氧化剂应是高效、安全、营养的物质。例如，主要含有橙皮素、圣草素等的黄酮类化合物不仅安全性高，还具有多种功能：抗氧化，防肿瘤，防癌、冠心病。维生素 C也作为抗氧化剂被添加到食物当中，尽管维生素 C也是通过化学合 成的
20、，但是在商品标签上并没有出现“添加维生素 C”这样的字样，因为维生素 C是公认的对人体健康有利的产品，拥有一个良好的形象。需要指出的是，维生素 C单独使用做抗氧化剂的效果不佳，常常与生育酚（维生素 E）联合使用 17。另外一种商品名为 Anoxomer的二乙烯氢醌苯酸的缩聚物，分子量为 3800。摄入后不分解、不吸收、不富集，极为安全 18。 1.3.4工艺、复方方面的开发 随着分离技术的进步，人们已把膜分离技术、超临界流体萃取技术和色层分离技术应用于天然抗氧化剂的提取工艺之中，这样无论对产品的纯度、活性保护和 品质都大为改善，成为高档次，高附加值的产品 19。许多研究表明：不但许多化学成分对
21、某些天然植物抗氧化剂具有协同增效作用，而且，不同的抗氧化剂之间同样具有协同增效作用，所以复方天然植物抗氧化剂时高副加值抗氧化剂的一个研究方向。 几种抗氧化剂配合使用具有抗氧化增效作用。例如， VC棕榈酸酯与 VE的协同效果大于与 BHT、 BHA的作用。 VC棕榈酸酯浓度增加时，其抗氧化活性有更大提高；当温度提6 高时，其抗氧化作用更强。 1.4 本课题研究的意义 食品抗氧化剂是食品添加剂的重要组成部分，在食品工业中占有重要位置，不仅 在含油脂食品，而且在果蔬食品中也需要添加，从而延长保质期。但是我国的抗氧化剂在食品添加剂中是一个薄弱环节，特别是天然抗氧剂的开发与国外相比，差距甚大，所以抗氧化
22、剂的研究开发具有重大意义。 我国的渔业较发达，一些沿海城市，如浙江，上海，广东，福建等渔业资源丰富，在近些年的大量捕捞，低值鱼类的捕捞比例也逐年增加，而一般低值鱼类捕捞上来是简单加工成鱼粉饲料，不但造成资源浪费，也造成了环境污染。低值鱼类本身含有丰富的人类必需氨基酸，其含有的蛋白质含量更是比鸡蛋，瘦猪肉等都要高出许多，而且 能够提供高度不饱和脂肪酸。鱼 脂肪中高度不饱和脂肪酸 EPA 和 DHA 是人体必需的脂肪酸 ,具有重要的生理作用。 本课题研究的是 海水低值鱼为原料，通过发酵得鱼蛋白，研究其抗氧化性影响因素。 合理利用海水低值鱼开发出具有抗氧化性的天然抗氧化剂，那将是一项重点开发的课题，
23、本实验主要为以后的产品开发做基础研究。 2 实验材料、主要仪器与试剂 2.1 实验材料 发酵型鱼蛋白：北门市场上购买的 海水 低值鱼，经过培养发酵所得到的鱼蛋白，置于冰柜中冷藏。 2.2 实验试剂 试剂 规格 厂家 氢氧化纳 分析纯 AR 国药集团化学试剂有限公司 95%乙醇 分析 纯 AR 国药集团化学试剂有限公司 葡萄糖 分析纯 AR 国药集团化学试剂有限公司 氯化钠 分析纯 AR 国药集团化学试剂有限公司 胃蛋白酶 生化试剂 国药集团化学试剂有限公司 胰蛋白酶 生物酶制剂 广西南宁庞博生物工程有限公司 浓盐酸 分析纯 AR 国药集团化学试剂有限公司 磷酸二氢钠 分析纯 AR 国药集团化学
24、试剂有限公司 磷酸氢二钠 分析纯 AR 国药集团化学试剂有限公司 甘氨酸 分析纯 AR 国药集团化学试剂有限公司 DPPH 分析纯 AR 美国 sigma 公司 2.3 实验仪器 7 仪器名称 型号 厂家 pH 计 PP-20 北京赛多利斯仪器系统有限公司 电子分析天平 BS110S 北京赛多利斯天平有限公司 超声波清洗器 KQ500E 昆山市超声仪器有限公司 可见分光光度计 S22PC 上海棱光技术有限公司 电热恒温 水 浴锅 HHS 型 上海 博迅实业有限公司医疗设备厂 3 实验方法 3.1 DPPH 法测定自由基清除率 1.5 ml 样品 +1.5ml 95%乙醇混合加上 375 l 浓
25、度为 0.02% DPPH 95%乙醇剧烈混合，混合物在暗室室温下放 60min，然后测定吸光度为 517nm 时的吸光值。 样品： 1.5ml 样品 +1.5ml95% 乙醇 +375 l 浓度为 0.02% DPPH 95%乙醇液 对照： 1.5ml 蒸馏水 +1.5ml95% 乙醇 +375 l 浓度为 0.02% DPPH 95%乙醇液 空白： 1.5ml 样品 +1.5ml95% 乙醇 +375 l95%乙醇液 DPPH 自由基清除率（ %） =对照 -（样品 -空白） / 对照 100 3.2 发酵型鱼蛋白的抗氧化稳定性研究 3.2.1 对热的稳定性 取 1ml 鱼蛋白发酵液，加
26、5ml 水充分混合稀释 6 倍，然后均分为 4 份，两组为样品组，两组为空白组，把样品分别置于 温度为 80、 90、 100、 121，分别加热时间 15 和 30min 两种，然后测定经过不同温度和不同时间的热处理下的样品的 DPPH 自由基清除率，其中未加热样品也是稀释 6 倍，再 DPPH 法测定自由基清除率，作为对照。 3.2.2 对 pH 值的稳定性 pH 值 缓冲液的配置方法： pH 为 3、 4、 5、 6 的缓冲液要用甘氨酸 -HCl 缓冲液，先取一定量的甘氨酸，然后用 pH 计测其 pH 值，然后再是滴加 HCl 溶液，逐一配置。 pH 为 7、 8、9、 10 的缓冲液用
27、 磷酸二氢钠 -磷酸氢二钠缓冲液，先取一定量的磷酸二氢钠，再用 pH 计测其 pH 值，然后再是滴加磷酸氢二钠溶液，逐一配置。 取 0.5ml 的样品分别与 pH 为 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 缓冲液 0.5ml 混合后加 5ml 水充分混合 稀释 6 倍，然后均分为 4 份， 两组为样品组，两组为空白组，在室温下混合 1h 后，然后 DPPH 法测定自由基清除率，同 时测定不同 pH 缓冲液自身的清除率。 3.2.3 与人工胃液和人工肠液混合后的稳定性 人工胃液和人工肠液的配置方法： 取浓盐酸 234ml 加水定容 1000ml 得稀盐酸，取稀盐酸 16.4ml，加水
28、800ml 与胃蛋白酶 10g，摇匀后加水稀释至 1000ml 即得人工胃液。取磷酸二氢钠 6.8g 加水 500ml 使溶解，用 0.1mol L 氢氧化钠溶液调节 pH 值至 6.8，取胰酶 10g，8 加水适量使溶解，将 2 液混合后，加水稀释至 1000ml 即得人工肠液。 取 0.5ml的样品在 37 水浴锅分别与人工胃液和人工肠液 0.5ml混合后加 5ml水 稀释 6倍，然后均分为 4 份， 两组为样品组，两组为空白组， 反应时间（人工胃液试验测定反应时间分别为 30、 60、 90、 120min 后样品的 DPPH 自由基清除率；人工肠液试验里反应时间分别为 1、 2、 3、
29、 4、 5h），同时测定人工胃液和人工肠液自身的清除率。 3.2.4 与常见食品添加剂食盐水，糖水混合后的稳定性 取 0.5ml 的样品分别与食盐水浓度为 5%、 10%、 15%、 20%、 25%和糖水浓度为 10%、25%、 35%的糖水 0.5ml 混合后加水稀释 6 倍， 然后均分为 4 份， 两组为样品组，两组为空白组，然后然后 DPPH 法测定自 由基清除率。 同时测定糖水和食盐水自身的清除率。 4 结果与讨论 4.1 加热 温度和时间对样品 DPPH 自由基清除率的影响 表 1 加热 温度和时间对样品 DPPH 自由基清除率的影响 加热温度（ ） 80 90 100 121 对
30、照组 加热时间 15min 74.30% 93.70% 82.70% 90.00% 61.20% 30min 90.30% 97.10% 86.00% 84.30% 由表 1 可知，热处理后样品的 DPPH 的自由基清除率都明显高于未处理过的样品（对照组）。说明加热可以使样品的抗氧化能力 提高。同时间不同温度下（ 15min），加热温度 90时清除率达到最大，为 93.7%；在加热 30min 情况下，加热温度 90时清除率达到最大，为 97.1%。说明加热温度 90下，样品抗氧化能力最大，最适温度为 90。同温不同时间下，在 80、 90、 100下，随着加热时间的增加，清除率也增加。在 1
31、21下，则相反，随着加热时间的增加而减小。 121情况下反常的原因可能是加热温度太高导致，而且由于实验室没有特殊的温度计， 121的处理情况是高压灭菌锅里进行的。且由于高压灭菌锅需要减压后才能打开，所以可能是加热时间 过长导致 DPPH 自由基清除率降低。 4.2 酸碱性对样品 DPPH 自由基清除率的影响 表 2 酸碱性 对样品 DPPH 自由基清除率的影响 pH 样品清除率 自身清除率 真正清除率 3 83.50% 19.70% 63.80% 4 76.90% 14.70% 62.20% 5 93.20% 11.80% 81.40% 6 90.60% 9.70% 80.90% 7 56.40% - 56.40% 8 37.50% - 37.50% 9 45.40% - 45.40%
