1、 本科毕业论文 （ 20 届） 固定化酶生产壳寡糖的研究 所在学院 专业班级 食品科学与工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 目录 摘要 . 1 Abstract . 2 1.前言 . 3 1.1 壳寡糖的概述 . 3 1.2 制备壳寡糖的方法 . 4 1.2.1 化学法 . 4 1.2.2 酶解法 . 4 1.2.3 物理法 . 5 1.2.4 糖转移法 . 5 1.3 固定化细胞技术 . 5 1.4 壳聚糖酶的固定化 . 6 2 实验材料、主要仪器与试剂 . 6 2.1 实验材料 . 6 2.2 主要仪器 . 6 2.3 主要试剂 . 7 2.4 培养基 . 7 3 实验
2、方法 . 7 3.1 B. thuringiensis ZJOU-010 的培养条件 . 7 3.2 壳聚糖酶液的制备 . 7 3.3 DEAE-22 纤维素的交联 . 7 3.4 壳聚糖酶的固定化 . 8 3.5 酶活力的测定 . 8 3.5.1 固定化壳聚糖酶酶活的测定 . 8 3.5.2 游离壳聚糖酶酶活的测定 . 8 4 实验结果与讨论 . 8 4.1 固定化壳聚糖酶的制备条件优化 . 8 4.1.1 戊二醛浓度对固定化 B. thuringiensis ZJOU-010 壳聚糖酶活力的影响 . 8 4.1.2 加酶量对固定化 B. thuringiensis ZJOU-010 壳聚糖
3、酶酶活的影响 . 9 4.1.3 固定化时间对 固定化 B. thuringiensis ZJOU-010 壳聚糖酶酶活的影响 . 9 4.2 固定化酶反应条件的优化 . 10 4.2.1 不同的 pH值对固定化 B. thuringiensis ZJOU-010 壳聚糖酶活力的影响 . 10 4.2.2 不同的温度对固定化 B. thuringiensis ZJOU-010 壳聚糖酶酶活的影 响 .11 4.2.3 固定化 B. thuringiensis ZJOU-010 壳聚糖酶 的热稳定性 . 12 4.2.4 对 固定化 B. thuringiensis ZJOU-010 壳聚糖酶动
4、力学参数的测定 . 13 4.2.5 对固定化 B. thuringiensis ZJOU-010 壳聚糖酶反应批次的试验 . 14 5 小结 . 15 1 摘要 ： 壳寡糖是一种 具有很 多功能 的 产品，广泛 的 应用 在 食品、医药、化妆品等 诸多 领域。而 利用壳聚糖酶 来 降解壳聚糖 已经 成为 了现今 生产功能性壳寡糖的首 选途径。本文采用 的是吸附交联技术，以 DEAE-22纤维素 作 为载体 、 戊二醛 作 为交联剂，固定 Bacillus thuringiensis ZJOU-010壳聚糖酶，考察了固定化酶制备 的 条件，并 且 研究 了 固定化酶的性质 等 。 实验 结果表
5、明 B.thuringiensis ZJOU-010壳聚糖酶的最佳固定化条件为：加酶量 20 mg，戊二醛浓度 3.0%，固定化时间 10h； 并且 在此条件下制备 得出 的固定化壳聚糖酶的最适温度和 pH值 分别为 50 和 5.0； 与游离酶相比，该固定化酶的热稳定性 比 较好，在 40 和 50C下的半衰期 (t1/2)分别为 36.3h和 6.2h，动力学参数 Km值为 9.19g/L； 该 固定化酶重复使用 了 10批后，活力 仍然可 以 保持初始的 87.96%。 关键词： 壳聚糖；壳寡糖 ； 固定化；壳聚糖酶 ； Bacillus thuringiensis ZJOU-010；2
6、 Abstract: Chitooligosaccharides has been proved to exhibit a broad range of potential applications in biomedicines, pharmaceuticals, food, cosmetic and agriculture. Recently, bioconversion of chitinous materials to oligosaccharides mediated by chitosanase has been proposed as an attractive alternat
7、ive. In this study, chitosanase in B.thuringiensis ZJOU-010 was immobilized by cross-linking technology where DEAE-22 cellulose was adopted as carrier and glutaraldehyde was used crosslinking agent. The immobilization conditions and the characteristics of the immobilized enzyme were investigated. It
8、 was indicated that the optimum preparation conditions were set as follows: 3.0 % of glutaraldehyde, 20 mg of added enzyme, 4 h of immobilization time. Under these conditions, the obtained immobilized enzyme exhibited an optimal pH and temperature of 5.0 and 50 ,respectively, and the kinetic paramet
9、er Km was 14.29 g L. Half-life (t1/2) of the immobilized enzyme at 40 and 50 was 36.3 hand 6.2 h, respectively, suggesting that the thermostability of chitosanase was enhanced compared with the free enzyme. After the 10th cycle, the immobilized cells retained 88.32 % of its original activity. Key wo
10、rds: chitosan; chitosanase; immobilization; chitooligosaccharides； Bacillus thuringiensis ZJOU-010;3 1.前言 1.1 壳寡 糖的概述 壳聚糖（ Chitosan）又 被 称 为 甲壳胺， 是在自然界中广泛存在的一种天然的高分子化合物 ,且每一年的生物合成量在百亿吨以上。 氨基葡萄糖通过 -1, 4 糖苷键连接 组 成 了 壳聚糖，许多 的 氨 基、羟基 ， 还有一些 具有 N-乙酰氨基的 线性大分子分布在 其分子链上， 从结构上来说， 与纤维素 非常 相似 1，是 在 自然界 中 存在的唯一碱
11、性氨基多糖， 同时 也是自然界 中存在的 最丰富的多糖之一，在 多个领域，包括 医药、食品、化妆品等 发挥着着非常 广泛的用途2-4。但 是由于 壳聚糖 的一些特点，诸如 水溶性 比较 差，分子 间 氢键力较强，相对分子质量比 较大， 而且 不易被人体 所 吸收 利用等 ，使其 实际 应用受到 很大的 限制 ，在进一步拓展上呈现了较大困难 。 壳寡糖 ， 壳聚糖 的水解产物，是将壳聚糖作为原料 , 通过生物技术降解产生的 , 它的功效有是壳聚糖的 数十倍。主要是由于 壳寡糖 不仅拥 有易吸收、水溶性好等 许多 优点，且还有许多 功能 ，如 抗细菌、真菌、保水保湿 、 抗癌及调节机体免疫 能力
12、等，在 许多的领域都具有广阔的 应用前景 和巨大的发展潜力，如 食品、医药、化妆品等， 所以现今学者 研究的热点 之一就是 制备壳寡糖 的方法 5。壳寡糖 在 目前的制备方法主要 是分为 酶解法和酸解法 两种 ， 而通过酸解法获得的产品，其 得率 比较 低，降解产物 的 聚合度 比较 小， 通常是以二聚物或者三聚物为主，而 且 生产过程中使用的强酸对环境会造成了较大污染，反应条件也较苛刻 ； 而 酶解法 则 以产率 较 高、易 与 控制且反应条件 比较 温 和、所得低聚物 的 聚合度适中及产物 的 安全性 比较 好等优点而 受到人们的广泛关注 。 所以当前 生产功能性壳寡糖的首选途径 是通过
13、用壳聚糖酶 来对 壳聚糖 进行 降解 6-7。同时， 通过用壳聚糖酶 降解壳聚糖 也成为 了 研究甲壳素工业 的最 前沿。 对壳寡糖的研究和开发是属于国际上新兴的化学和生命科学的交叉前沿学科 糖工程研究与糖生物学的新领域。现在生物制药技术的热点之一便是壳寡糖 , 其科研和开发主要是集中在日本、韩国等国家 , 我国对该产品研究的起步较晚 , 在近年来的研究逐渐趋于活跃。张文清采用了 NaCl/H2O2 协同氧化制备壳寡糖 的方法取得了非常好的效果 8。在 2002 年 8月 , 山东省南海的得贝公司利用复合酶法制备壳寡糖的生产线正式投产 , 壳寡糖在我国首次实现了产业化生产。壳寡糖是一类全新的具
14、有较强生理活性的物质，有很多的作用，如抑制病毒，细菌，真菌和肿瘤细胞等，所以壳寡糖在许多的应用上都显示出非常大的潜力，如对植物进行生长调节，以及抗病和畜牧养殖等许多领域。在现今的国际上，功能性寡糖的开发以及研究，已经慢慢地发展成为了一种应用于农业、饲料、食品、医药、化妆品等多个领域，并且涉及到了工程、化学、医学等多学科的重要产业。 如果想让酶 法生产功能性壳寡糖切实可行，就必须找到一种兼具水解效果良好、价格低廉的非专一性酶，从而替代专一性酶，并且不断的对其水解条件进行优化。预想而知，随着人们研究的不断深入，对壳聚糖的降解机理的诠释，对降解条件的进一步优化，在不久的将来必然会实现壳寡糖商业化生产
15、。 4 1.2 制备壳寡糖的方法 目前，主要是通过对壳聚糖的降解来获得壳寡糖。主要可分为化学法、酶解法和物理法等制备方法。 1.2.1 化学法 过氧化氢、过硼酸钠氧化降解法，酸解法等是降解壳聚糖的主要化学方法。 1.2.1.1 氧化降解法制备壳寡糖 氧化降解法 是一种目前使用较多的降解壳聚糖的方法。氧化降解法中的过氧化氢氧化法已被用作壳寡糖的生产方法，这种方法在许多的文献中都有出现。通过在中性条件下，采用过氧化氢溶液对壳聚糖进行氧化降解的方法中，邵健等学者制备出了一种药用壳寡糖，其分子量在 1000 左右，并对过氧化氢的浓度和配比、温度以及反应时间的变化对降解反应的影响作了探讨 9。 1.2.
16、1.2 酸水解法 壳寡糖是通过将壳聚糖在 HF、 H2SO4、 HCl和 HNO2等酸性试剂的作用下进行剧烈的降解反应得到的，其中，壳寡糖的工业化生产主要依赖 HCl 降解法。酸水解法中的 反应条件比较苛刻，经常和高温、高压有关，所以整个过程较难控制，并且酸水解法产物的分子量分布比较宽，也很难控制其水解程度，较难对产物进行分离和纯化，产量较低，选择性偏差，而且使用大量的化学试剂会腐蚀设备以及污染环境。 1.2.2 酶解法 使用反应条件较为温和的方法 酶法来降解壳聚糖，在其整个降解过程中不加入其它的反应试剂，不会发生其它的一些副反应，容易控制其降解的过程和控制降解产物的相对分子质量分布，通过酶法
17、降解壳寡糖的得率比较高、对环境的影响和污染比较小，所以使用酶法降解是一种比较好的降解方法。酶降解法分 为两种：专一性酶降解法和非专一性酶降解法。至今，已经有 37 种不同的水解酶（例如糖苷酶、蛋白酶、脂肪酶等）被人们所发现，它们对壳聚糖均表现出较好的降解效果。 1.2.2.1 专一性酶降解法 专一性底物是壳聚糖的壳聚糖酶被称为专一性水解酶，包括有溶菌酶、壳聚糖酶和甲壳素酶等，通过高选择性地切断壳聚糖中的 -1,4-糖苷键从而使壳聚糖水解。较温和的反应条件以及不需使用大量的试剂，使壳寡糖进行大规模的生产成为了可能，此种壳寡糖制备方法是比较理想的。 1.2.2.2 非专一性酶降解法 目前专一性酶的
18、来源有限，很大部 分都是从真菌细胞中获得的，大批量的获取受到限制。而且由于专一性酶的价格比较昂贵，实现商品化有很大的难度，所以寻找非专一性酶来降解壳聚糖就变得非常重要。在目前，已经被人们发现能够用来降解壳聚糖的非专一性酶有脂肪酶、蛋白酶、多糖酶等 30 多种，而其中效果最好的是一些多糖酶，如半纤维素酶、纤维素酶、果胶酶等。 我国的江南大学，通过对壳聚糖的水解进行多年的研究发现了复合酶对壳聚糖水解会产5 生的影响，复合酶是通过将多种非专一性酶，如脂肪酶、蛋白酶、糖酶等组合得到的。复合酶可以产生平均分子量在 10000 以下的产物。此种方 法和其相对应的工艺条件经中试试验证明可以用于壳寡糖的工业化
19、生产，开辟出了一种新的制备壳寡糖的方法。一种通过蛋白酶来降解壳聚糖的制备工艺由江苏扬州大学的酶工程研究室建立，通过这种制备方法可以获得平均分子量约为 1500， 2000， 3000， 4000， 10000， 20000 的壳寡糖。 然而用非专一性酶降解法制备壳寡糖也有有一定的缺陷。在用非专一性的水解酶降解壳聚糖到了一定的程度之后，不论酶量再怎样增加也很难提高其水解程度，造成了水解程度有限，而且水解产物较为复杂，分离比较不容易，如果要进行工业化生产对酶的需求量会 非常大，成本也会随之增高。 1.2.3 物理法 物理法是通过将壳聚糖分子内的化学键在辐射过程中发生断裂而降解，有微波辐射，电磁波辐
20、射，超声波辐射等降解方法，其中研究比较多的是超声波降解法。但降解机理限制了物理法降解制备壳寡糖，壳聚糖的聚合链在降解过程中会随意发生断裂，从而使得产物的平均分子量分布得太宽，很难得到分子量 40000 以下的产品，而且被需要的聚合度在 6 8 的壳寡糖含量不高，从而大量浪费了原料，物理法的应用受到很大的限制。 丁盈红等学者通过使用微波辐射，以及过氧化氢非均相来降解壳聚糖。并且通过正交试验 法将其反应条件进行优化 10。对比下发现物理降解法的操作比酶法和化学法简单，且具有较好地可控性。所以如果将其他的降解方法与这些物理方法结合起来一起使用，取得的效果一定会更好。 1.2.4 糖转移法 目前对糖转
21、移法，即化学合成法的研究已经取得了较大的进展。但步骤较为复杂，因为在其合成的过程中遇到了基团保护和基团脱去等过程，通过在酶反应的基础之上利用酶来作用低聚合度的寡糖，使其的糖链得以延长，从而成为具有较高聚合度的寡糖。 1.3 固定化 细胞 技术 由于壳聚糖酶的稳定性不高，寿命短，而且无法进行循环使用，在 生产过程中的应用受到了极大的限制。壳聚糖酶在通过了固定化之后其稳定性得得到了提高，并且可以进行循环使用，因此在壳聚糖酶的应用与研究当中，固定化是一个非常重要的研究方向。 固定化细胞技术分为吸附法、共价结合法、交联法和包埋法。包埋法是近年来迅速发展的一种新兴细胞固定化技术，是指通过物理方法 把 细
22、胞固定在高分子凝胶网格中的方法，具有操作简单，对细胞活性影响较小，效率高等特点，是目前细胞固定化研究和应用最广泛的方法 11-12。由于固定化细胞技术已经超过固定化酶的应用；且酶处于细胞天然环境中，更加稳定；细胞被固定 化后具有细胞密度高、反应速度快、耐毒害能力强、产物容易分离、能实现连续操作，可以大大提高生产能力等优势 13。 在树脂上吸附大肠杆菌 E.coli以 实现细胞 的 固定化 是由 Hattori和 Fuurskaa在 1959年首6 次 实现的 14。在这之后，许多学者 相继 展开 了 对 固定化活细胞 既 固定化增殖细胞的研究工作。 由于 固定化细胞可以替代 使用 发酵 法 与
23、固定化酶来生产所需产品， 所以 越来越多的 人 关注 到了它 。 而且进过 纯化 之 后的酶 没有 固定在细胞环境中的酶稳定。主要 通过 考虑酶的来源是 胞 外 酶 还是 胞 内 酶 ，以及 底物 的 分子量 ， 底物产物结构 以 及 细胞膜 的 通透性 来决定 采用哪种方法 来 固定 化 细胞。 可以看出 固定化细胞技术的应用前景 非常大，且 具有 许多优点，如 反应速度快、耐毒害能力强 、 细胞密度高等 。 通过 对 固定化细胞技术 进行 不断的研究， 其 将 会发展变得更为 高效并且 实用，在 许多 学科领域 ，如 化学、医学、生命科学、生物工程及环境工程等 方面 发挥 出非常 巨大的作
24、用。 1.4 壳聚糖酶 的固定化 目前有关于壳聚糖酶的研究以及进一步的开发利用已成为了壳寡糖生产与应用的关键与瓶颈。虽然现在壳聚糖酶已经实现了商品化，但是由于原始菌株生产壳聚糖酶的能力仍然较低，使壳聚糖酶的来源有限， 生产成本高，这些问题都成为了限制壳寡糖应用的瓶颈。同时，现有的商品壳聚糖酶在热稳定性等方面还不足以满足大规模降解壳聚糖的工业化生产需求。所以，一方面需要继续地寻找在不同微的生物来源中的壳聚糖酶，另一方面则须要对现有的壳聚糖酶菌株进行基因工程的改造，以望获得高产壳聚糖酶菌株。 虽然 目前 在许多微生物中都发现了这类酶，如在 真菌、细菌、放线菌中，甚至 于 在病毒、植物中也 有被 发
25、现 15-16， 且其纯酶也日益被许多的研究人员通过分离纯化等步骤获得， 但是 由于 目前所获得的壳聚糖酶活力均较低下，加之 游离酶 存在的一些不足，所 以期望通过固定化技术的采用来弥补游离壳聚糖酶的这些缺陷，从而来提高其生产优势，同时增加酶的稳定性、简化产物的分离纯化步骤，实现连续化生产，大大节省成本 17。 本文以实验室自主筛选获得的菌种 Bacillus thuringiensis ZJOU-010作为研究对象， 采用了 DEAE纤维素交联法 来 固定此壳聚糖酶， 针 对酶固定化的条件及 所得 固定化酶的性质 分别进行了考察 ，希望能为壳寡糖的工业化生产奠定一定的基础。 2 实验材料、主
26、要仪器与试剂 2.1 实验 材料 虾壳 是 由浙江兴业集团有限公司馈赠 ； 苏云金芽孢杆菌（ B. thuringiensis ZJOU-010） ：该菌是由本实验室在浙江舟山 水产加工企业周围 的 土壤中 以虾壳粉为唯一碳源 得到 的（ Gene Bank 登录号 GU384894）。 2.2 主要仪器 仪器名称 型号 厂家 电热恒温培养箱 HH B11 420-S- 上海跃进医疗器材厂 紫外可见分光光度计 UV-754 上海分析仪器厂 电子分析天平 FA 2004 上海精密仪器仪表有限公司 7 高速离心机 X-22 Centrifuge 美国 Beckman Coulter 回转式恒温调速
27、摇瓶柜 HYG-11 上海新星自动化控制设备成套厂 快速液相蛋白层析仪 (FPLC) AKTA GE公司 2.3 主要试剂 试剂 （规格） 厂家 壳聚糖（脱乙酰度 83%） 浙江天宝壳聚糖有限公司 HAc -NaAc 缓冲液 国药集团化学试剂有限公司 DEAE-22 纤维素 国药集团化学试剂有限公司 戊二醛 国药集团化学试剂有限公司 醋酸盐缓冲液 国药集团化学试剂有限公司 3, 5-二硝基水杨酸（ DNS） 国药集团化学试剂有限公司 Sephadex G-150 Acros Organics CM-Sephadex Sigma 2.4 培养基 斜面培养基 （ g/L）： 蛋白胨 10，牛肉膏
28、3，琼脂 15, NaCl 5。 种子培养基 （ g/L）： MgSO4 0.3， K2HPO4 0.2， (NH4)2SO4 3， SSP 20， pH 7.0。 产酶培养基 （ g/L）： MgSO4 0.3， K2HPO4 0.2， (NH4)2SO4 1， SSP 30， pH 7.0。 3 实验方法 3.1 B. thuringiensis ZJOU-010 的 培养条件 3.1.1 种子培养 ：从已活化好的斜面中，用接种环挑取 1-2 环接种至含 50 mL种子培养基 的 250 mL三角瓶 中，然后置于 32、 150r/min 摇床上培养 24h，备用。 3.1.2 产酶培养：
29、 将经过种子培养获得的种子液，以 2.5 % (V/V)的接种量 转接到 产酶培养基中 ，置于 32、 150r/min 摇床上培养 48h， 48h 获得的即为发酵液。 3.2 壳聚糖酶液的制备 将经过产酶培养获得的发酵液置于 4 下， 转速为 9000r/min 的冷冻离心机内离心15min，得到粗酶液，缓速往其加入 (NH4)2SO4 至饱和度 80%，边加入边搅拌，加完后继续搅拌 1h 左右，放置过夜，之后于 4 ， 转速为 12000r/min 的条件下， 离心 20min，弃上清，沉淀用 50mM 醋酸盐缓冲液（ pH6.0）溶解， 采 用 Sephadex G-25 脱盐柱进行脱盐， 之后 上 CM-sephadex 柱 进行后续的 分离纯化，收集酶活管即为壳聚糖酶 液。 3.3 DEAE-22 纤维素的交联 取 一定量的戊二醛 加至 0.5g DEAE-22 纤维素 中 ， 于 室温下搅拌 4-5h， 放 置过夜， 然后
