1、 本科毕业论文 （ 20 届） 海带多糖的酶法制备工艺研究 所在学院 专业班级 食品科学与工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 目录 摘要 . 1 ABSTRACT. 2 1 前言 . 3 1.1 海带的概述 . 3 1.2 海带多糖的作用 . 3 1.3 海带多糖的传统提取方法 . 3 1.3.1 水提法 . 4 1.3.2 碱处理法 . 4 1.3.3 酸提取法 . 4 1.3.4 分类提取法 . 4 1.3.5 超声波法 . 4 1.3.6 酶解法 . 4 2 材料与仪器 . 5 2.1 实验材料 . 5 2.1.1 原料 . 5 2.1.2 试剂 . 5 2.2 主要
2、仪器 . 5 3 实验方法 . 6 3.1 工艺流程： . 6 3.2 操作要点 . 6 3.3 分析方法 . 7 3.3.1 硫酸 -苯酚法 . 7 3.3.2 凯氏定蛋法 . 7 4 实验结果与讨论 . 8 4 .1 影响海带多糖提取的单因素实验 . 8 4.1.1 pH 值对提取率的影响 . 8 4.1.2 温度对提取率的影响 . 9 4.1.3 时间对提取率的影响 . 9 4.1.4 加酶量对提取率的影响 . 10 4.2 四因素对多糖提取率影响的正交实验 . 10 4.3 复合酶加酶方式对多糖提取的影响 . 11 5 小结 . 12 参考文献 . 12 致谢 .错误 !未定义书签。
3、1 摘要 海带是我国重要的经济海藻，产量居世界首位。海带中的多糖成分有多种药理作用，在医药领域有 广阔 的应用前景。直接食用海带提取的营养物质和海带多糖含量很少。应用酶解技术将纤维质和果胶质水解提取出细胞质和细胞间液，再经过分离纯化可以提取海带多糖。本文研究从海带中提取多糖的工艺条件，讨论不同因素对提取率的影响规律并在这个 基础上进行正交实验以得到最佳提取因素组合。实验结果表明：在提取中加入酶可以显著提高海带多糖的提取率 。最佳提取条件为 pH 值 4.0、温度 40 、加酶量 2%、提取时间 2h，在该条件下的总多糖提取率为 5.583%。 又采用复合酶法从海带中提取三种多糖，并分析了不同加
4、酶方式对海带多糖提取率的影响。结果表明：分步加酶法比同加酶法褐藻糖胶、褐藻淀粉、褐藻胶的提取率分别提高了 41.40%、 33.80%、 11.61%。 关键词 海带多糖；酶法；制备 ；提取率 2 EXTRACTION PROCESS OF POLYSACCHARIDES FROM LAMINRIA JAPONICA ARESCH BY ENZYME TEST Abstract Laminaria is an important economic algae in our country,and its production in China ranks first in the world.
5、Polysaccharides from Laminaria have many pharmacological effects, and have a good application prospect in the future. The absorbing amount of nutriment and laminarin from kelp by eating directly by humankind is very little. The cytoplasm and intercellular fluid can be extracted from enzyme hydrolyze
6、d cellulosic material and pectin, then the laminarin can be obtained via separation and purification. The process of polysaccharide extraction from laminarin and the effects of different factors were studied. The optimal conditions were obtained by studying orthogonal experiment on this basis. The r
7、esult of experiment indicated that: the method of enzyme was effective to increase leaching rate of polysaccharide. The best extraction conditions is pH 4.0, temperature 40 , plus enzyme quantity 2%, extracting time 2h, in the conditions for the total polysaccharide 5.583% extraction. Adopted comple
8、x enzymatic extracted from kelp three polysaccharide, and analyzes different ways with enzyme extraction and content of laminarin the influence. Results show that: distribution than synchronization with enzymatic add enzymatic phaeophyta sugar glue, brown algae starch, brown algae glue improved extr
9、action41.40%, respectively 38.80%, 11.61%. Key words Laminarin Japonica Aresch polysaccharide; Enzyme Test; Preparation; extraction efficiency 3 1 前言 1.1 海带的概述 海带是海藻类植物之一，是一种在低温海水中生长的大型海生褐藻植物，为大叶藻科植物，因其生长在海水中，柔韧似带而得名。它是一种大型的褐藻，在我国沿海均有分布，但主要产于我国的辽宁省和山东省等沿海地区，富含丰富的海藻胶、纤维素、半纤维素和矿物质等，是生产膳食纤维很好的原料。近年来，海带
10、资源非常丰富，养殖面积逐年上升，产量也逐年上升，我国海带的年产量已经约占世界年产量的一半。 它是一种大型的、资源丰富的经济海藻，生长快、产量高、富含维生素、氨基酸、微量元素和矿物质等营养物质 及多糖类的生物活性物质。但是海带藻体组织结构的成份主要是海藻酸、纤维质、海带杂多糖和果胶质，至使藻体呈现出较强的韧性，然而人体的消化系统里又缺少消化纤维质和果胶质的酶，所以直接食用海带摄取的营养物质和海带多糖的量极少。应用酶解技术将纤维质和果胶质水解，提取出细胞质和细胞间液，再经分离纯化可提取海带多糖，以提高海带多糖的提取率和提取含量，从而提高人类对海带多糖的利用率。 1.2 海带多糖的作用 海带是一种具
11、有食用和药用的大型褐藻，其含有的多糖成分具有多种生理功能 1,2。海带具有一定的药用价值，因为海带中含有 大量的碘，碘是合成甲状腺的主要物质，如果人体中缺少了碘，就会得 “粗脖子病 ”，也就是甲状腺机能减退症，所以海带是甲状腺机能低下人群的最佳食品。 海带中同时还含有大量的甘露醇，因为甘露醇具有利尿消肿的作用，它使得海带具有防治老年性水肿、肾功能衰竭、药物中毒等功能。甘露醇与碘、烟酸、钾等协同作用，对防治动脉硬化、高血压、慢性气管炎、慢性肝炎、贫血、水肿等疾病，都有较好的效果。海带中的优质蛋白质和不饱和脂肪酸，对心脏病、糖尿病、高血压有一定的防治作用。 从海带中提取的海带多糖也是一种免疫调节剂
12、 3，其作用强度与香 菇多糖和枸杞多糖相近，可对巨噬细胞、 T 细胞直接进行免疫调节。海带多糖可以降低四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠的高血糖。有研究表明海带多糖对正常大鼠的血糖没有影响，但能明显降低四氧嘧啶所致糖尿病大鼠血糖及血脂，提高糖耐量。海带多糖能明显降低四氧嘧啶所致糖尿病小鼠血糖和尿素氮，增加糖尿病小鼠的血清胰岛素和血清钙的含量，对四氧嘧啶所导致的胰岛损伤具有明显的恢复作用。 随着我国科学技术的进步、经济的发展和生活质量的普遍提高，人们对崇尚绿色、回归自然的意识越来越强，海带多糖将越来越受到人们的重视。为了能更好地综合利用我国丰富的海资源，本研究立题对海带多糖的提取方法进行优化，以提高海带多
13、糖的提取率和提取量，以便为进一步研究海带中各类多糖的结构与生物活性的关系及开发第三代保健食品奠定良好的基础。 1.3 海带多糖的传统提取方法 传统的提取方法有水提法、酸处理法、碱处理法、分类提取法、超声法等几种方法。 4 1.3.1 水提法 水提法以多糖提取率为指标得最佳提取工艺，这种方法提取多糖相对简单，但是纯其度不高 4,5，提取出的多糖中含有较多的蛋白质。 1.3.2 碱处理法 碱处理法采用二次浸泡和碱处理工艺，以褐藻酸的提取率作为多糖提取率的评价 指标，但它只反映了褐藻酸的提取情况，忽略了海带中其他多糖如褐藻糖胶、褐藻淀粉等的提取情况。 1.3.3 酸提取法 海带多糖的主要提取方法为酸
14、提取法，酸法较热水浸提法提取率高，该法由于避免了褐藻酸的溶出而使得提取物中褐藻糖胶的含量较高，但是酸提法中由于存在酸可能会发生褐藻糖胶的部分酸水解 5,6。因此，在提取过的程中时间不能过长，此外该方法还存在这提取周期长，能耗多等缺点，不适合工业化生产。 1.3.4 分类提取法 分类提取法则是根据海带多糖中的褐藻胶不溶于稀酸溶液但其钠盐能溶于水的特性，用0.1 mol/L HCl 水溶液从海带粉末中提取褐藻淀粉和褐藻糖胶 (根据溶解度的不同，用不同浓度的乙醇沉淀分离 )，从而使含量较高的褐藻胶留存于滤渣中 ,然后用 1%的 Na2CO3 溶液使其生成褐藻酸钠来提取。 1.3.5 超声波法 超声波
15、法 7以海带多糖的得率为指标，得出最优提取条件为：海带干粉加入 62.5 倍体积水， pH 2.0 的条件下超声波提取 45 min，其产率相对于水提法高了许多，但是超声波提取法提取多糖对提取的条件要求较高，在实际生产中成本也较高 8,9。并且超声波提取海带多糖时，超声时间不能过长，因为随着处理时间的延长 会使大分子的多糖断裂，从而造成多糖的损失影响多糖的提取率。 1.3.6 酶解法 刘轲 10 等人采用酶解的方法从海带中提取、制备海带硫酸多糖 （ LPS） ，即海带浆加入果胶酶、纤维素酶和蛋白酶， 50 条件下水解 4 h，然后升温至 90 使酶失活，冷却至室温进行过滤。取滤液加入氯化钙，离
16、心去除海藻酸钙；上清液中加入十六烷基三甲基溴化铵（ CTAB） 与 LPS 结合生成沉淀，离心收集 CTAB-LPS 沉淀物。加入氯化钙溶液进行盐解，游离出 LPS 后再加入乙醇溶液使其析出，经离心烘干得 LPS。此提取工艺与水煮提取法相比，得到的 LPS 产率提高了 2 倍。王海仁等人把海带放入到酶容器中均匀加热使温度达到3555 ，而后加入水解酶中的至少一种酶 （ 果胶酶或纤维素酶和果胶酶 ） ，其中酶的使用量控制在干品海带用量的 0.1%5%，使其酶解到液渣混合物状态，滤去渣质得到海带多糖的提取液。用酶法提取海带多糖技术在提取海带多糖的同时，还可以直接或间接得到十多种副产品；从而能将海带
17、从假根到藻体全部得到合理的开发与应用；同时能保持海带多糖活性物5 质的纯天然性，其毒副作用极小，可被广范应用于保健食品和药品的开发利用中。据不完全统计，中国的海带产量居世界之首，全 国各沿海城市均有相当大的产量，已成为渔业经济的支柱产业。研究海带多糖的高效提取工艺，最大程度地提取海带多糖， 提高海带多糖含量，从而提高海带的精深加工的附加值，是国内外学者非常关注的问题。推广应用本项技术，对于促进海带化工行业技术改造，调整水产养殖业的产业结构、促进高效渔业的快速发展，提高经济效益和社会效益都具有重要的现实意义。 因此，本研究采用酶解法从海带中提取海带多糖，对复合酶法提取海带多糖进行了研究，通过比较
18、加酶方式的不同对多糖的提取率的影响。以期得出酶法提取海带多糖的最佳工艺条件，既能提高多糖的提取 率，又能有效地除去其中的蛋白质以提高多糖的含量，为开发和利用海带多糖提供理论依据。 2 材料与仪器 2.1 实验材料 2.1.1 原料 海带 购于舟山市定海区北门菜场 纤维素酶 国药集团化学试剂有限公司 果胶酶 国药集团化学试剂有限公司 木瓜蛋白酶 国药集团化学试剂有限公司 2.1.2 试剂 试剂 纯度 产地 CTAB 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 苯酚 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 葡萄糖 分析纯 汕头市光华化学厂 浓硫酸 分析纯 中国医药上海化学试剂公司 硫酸铜 分析纯 国药集团化学试剂
19、有限公司 硫酸铜 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 硼酸 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 氯化钙 分析纯 国药集团化学 试剂有限公司 氯化钠 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 氯化钾 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 95%乙醇 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 氢氧化钠 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 浓盐酸溶液 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 2.2 主要仪器 仪器名称及型号 产地 TD 型电子天平 余姚金诺天平仪器有限公司 6 海带原料 预处理 提取工艺优化（ pH值、温度、加酶量、提取时间等的优化） 初步纯化 滤渣分离 酶解法去除蛋白质 分离得多糖 纤维 素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶
20、 DS-1 型高速组织捣碎机 上海标本模型厂制造 DL-5 低速大容量离心机 上海安亭科学仪器厂制造 HHS 型电热恒温水浴锅 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 LGJ-10 冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂制造 721 型可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司制造 UV-240 紫外可见分光光度计 日本 Shimadzu 公司 3 实验方法 3.1 工艺流程： 3.2 操作要点 （ 1） 原料预处理；将海带经过晾晒、除去泥沙等杂质后粉碎，粉碎后的海带加入到浸泡池中浸泡 0.5-1h，浸泡完成后分离海带和浸泡液，取浸泡过的海带作为酶解的原材料。 （ 2） 海带多糖的提 取工艺优化：首先采用单因素
21、实验确定影响海带多糖提取的重要因素，再通过进一步的实验确定最佳提取条件。 （ 3）酶解：将浸泡好的海带放入酶解罐，加入酶后在确定的最佳提取条件下进行酶解，酶解后升温至 90 使酶失去活力。 （ 4） 液渣分离：酶解后的海带渣和酶解液混交在一起呈粘质状态，直接用分离机分离出海带渣，得到的上清液就是海带的酶解液，作为提取海带多糖的原材料。 （ 5） 纯化得多糖：取上清液加入上清液加入十六烷基三甲基溴化铵 （ CTAB） 与 LPS7 y = 0.6058x - 0.0257R2= 0.9969-0.200.20.40.60.811.20 0.5 1 1.5 2浓度( m g / m l )吸光度（
22、490nm）结合沉淀，离心收集 CTAB-LPS 沉淀物；加入氯化钙溶液进行盐解 ， 游离出 海带多糖后加入乙醇使其析出 ， 经离心烘干得海带多糖 11,12,13。 3.3 分析方法 本实验采用硫酸 -苯酚法测定海带多糖的含量 14，用 3， 5 一二硝基水杨酸法测定还原糖含量 15；用凯氏定蛋法测定出多糖中蛋白质的含量。 海带多糖的提取率（ %） =粗多糖的量 /海带样品的质量 100（为校正系数 取 0.9） 蛋白除去率（ %） =（处理前蛋白含量 -处理后蛋白含量） /处理前蛋白含量 100 3.3.1 硫酸 -苯酚法 .制作标准曲线：准确称取标准葡萄糖 20mg 置于 500ml 容
23、量瓶中，加去离子水稀释至刻度，分别 吸取 0.4 ml、 0.6 ml、 0.8 ml、 1.0 ml、 1.2 ml、 1.4 ml、 1.6 ml 和 1.8ml，然后各以蒸馏水补至 2.0ml，然后加入 6%苯酚 1.0ml 以及浓硫酸 5.0ml，摇匀冷却，在室温中放置20 分钟以后在 490nm 处测定光密度，以 2.0ml 水按同样显色操作为空白，其中以横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，作图得标准曲线。 图 1 葡萄糖标准曲线 .样品含量测定：吸取 0.2 ml 的样品液，以蒸馏补足至 2.0ml，然后加入 6%苯酚 1.0ml及浓硫酸 5.0ml，摇 匀冷却后在室温下放置 2
24、0 分钟以后于 490nm 测定光密度。每次测定取双样对照，以标准曲线为准计算多糖含量。 3.3.2 凯氏定 蛋 法 1.样品处理：精密称取 2-5g 半固体样品或 0.2-2.0g 固体样品或吸取 10-20ml液体样品（大约相当 30-40mg 氮），移入干燥的 100ml 或 500ml 定氮瓶中，加入 0.2g 硫酸铜， 2g 硫酸钾和 20 毫升硫酸，稍摇匀后在瓶口放一小漏斗，将瓶以 45 度角斜放置于有小孔的石棉网上，小火加热，在内容物完全炭化，泡沫全部停止后，加强火力，并保持瓶内的液体微沸，待液体呈蓝绿色而澄清透明后，再 接着加热 0.5 小时。取下后放冷，小心加入 20ml 水
25、，放冷后，将其移入到 100mL 的容量瓶中，并且用少量的水清洗定氮瓶，将洗液一起并入容量瓶中，再加去离子水至刻度，混匀后备用。取出和处理样品相同量的硫酸钾、硫酸铜、硫酸，按照8 33.544.555.566.53 4 5 6 7 8pH值提取率(%)同一方法做试剂的空白试验。 2.完成定氮仪的组装，之后往接收瓶中加入 10mL2%硼酸溶液以及混合指示剂 1 滴，并将冷凝管的下端插入到液面之下，吸取 10.0mL 的样品消化液并由漏斗将其流入到反应室，用少量蒸馏水洗下，再加入 10mL 40%的氢氧化钠溶液，提起玻璃塞使其缓慢进入反应室。立即将玻璃 盖塞紧，并加水于小漏斗以防止漏气，夹紧螺旋夹
26、，开始蒸馏，直至硼酸液从红色变成黄绿色，再加热蒸馏 5min。移动接收瓶，使冷凝管的下端离开液皿，再蒸馏 1min，然后用少量的水冲洗冷凝管的下端外部，取下接收瓶，以 0.01mol/L 盐酸标准溶液定至粉红为终点。同时吸取 10.0mL 试剂空白消化液按 3 操作。按下式计算粗蛋白含量： C (V1-V2) M / 1000 粗蛋白质量分数 (%)= F 100% W 式中： C盐酸标准溶液的浓度 (mol/L)； V1滴定样品吸收液是消耗的盐酸标准溶液的体积 (mL)； V2滴定空白样吸收液时消耗的盐酸标准溶液的体积 (mL)； M氮的摩尔质量， 14.01g/mol； W样品的质量 (g)； F氮换算成蛋白质的系数； 4 实验结果与讨论 本实验采用的是复合酶法 提取海带中的多糖，影响的因素主要有 pH 值、温度、提取时间。而酶解法中酶的活性也受 pH 值、温度和加酶量等条件的影响。因此本实验首先对影响海带多糖的单因素 pH 值、温度、提取时间、加酶量进行研究，再通过正交实验确定多糖提取的最佳工艺。 4 .1 影响海带多糖提取的单因素实验 4.1.1 pH 值对提取率的影响 将海带以加酶量 2%条件下分别加入到 pH 值为 4.0、 5.0、 6.0、 7.0 的提取液中，在 40下提取 4h，得到的实验结果如下所示：
