1、 本科毕业论文 （ 20 届） 花蟹残肉酶解工艺研究 所在学院 专业班级 食品科学与工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 - 1 - 目录 1 引言 . - 3 - 1.1 概述 . - 3 - 2 实验材料、主要试剂与仪器 . - 4 - 2.1 实验材料 . - 4 - 2.2 主要试剂 . - 4 - 2.3 主要仪器 . - 5 - 3 实验方法与步骤 . - 5 - 3.1 花蟹基本组成成分测定 . - 5 - 3.2 酶解法水解花蟹肉的工艺流程 . - 6 - 3.2.1 酶解处理 . - 6 - 3.2.2 灭酶处理 . - 6 - 3.2.3 氨基态氮的计算
2、. - 6 - 3.2.4 总氮含量的测定 . - 6 - 3.2.5 水 解度的计算公式 . - 7 - 4 实验结果 . - 7 - 4.1 花蟹基本组成成分测定 . - 7 - 4.2 酶的筛选 . - 7 - 4.3 酶解最佳工艺研究 . - 8 - 4.3.1 中性蛋白酶的水解过程 . - 8 - 4.3.2 酶浓度对水解效果的影响 . - 8 - 4.3.3 pH 值对水解效果的影响 . - 9 - 4.3.4 反应体系温度对水解效果的影响 . - 10 - 4.3.5 固液比对水解效果的影响 . - 10 - 4.3.6 原料破碎情况对水解效果的影响 . - 11 - 4.3.7
3、 中性蛋白酶酶解工艺的正交试验 . - 11 - 4.3.8 正交试验分析 . - 12 - 4.3.9 验证实验 . - 13 - 5 结论 . - 13 - 5.1 确定酶种 . - 13 - 5.2 确定中性蛋白酶水解的最佳工艺参数 . - 13 - 参考文献 . - 13 - 致谢 .错误 !未定义书签。 - 2 - 摘要 花蟹是一种重要的海洋水 产资源 ， 其广泛分布于 舟山群岛附近海域 。 花蟹 味道鲜美 、营养 价值高 ，含有丰富的蛋白质、微量元素等营养成分，还有 10 多种游离氨基酸，其中 精氨酸、 组 氨酸、 谷 氨酸含量较 高 ，对身体有很好的滋补作用。 本文以水解液中的氨
4、基氮含量和水解度为指标 ， 比较了木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶各在其最适条件下对花蟹肉的水解效果。结果表明：中性蛋白酶较适合用于水解花蟹肉。通过正交试验探讨了中性蛋白酶的水解温度、水解时间、加酶量、 pH 值及固液比等条件对花蟹肉水解效果的影响规律 ，并以氨基氮含量和水解度为指标 ， 确定其酶解最佳工艺参数为： pH 值 7， 加酶量 1%， 水解温度 50 ， 固液比（ W/V） 1： 2.5， 水解时间 4h， 所得水解液的总氨基氮含量为 264.18mg/ml，水解度为 59.01%。本文对花蟹酶解工艺的优化设计 ， 大幅度地提升了花蟹的附加值 ， 为更加有效地利用花蟹资源以及更好
5、地开发利用花蟹水解液制备副产品提供参考依据。 关键词 花蟹；中性蛋白酶；水解；工艺 - 3 - Abstract Crab is an important marine aquatic resources, which are widely distributed in the waters around Zhoushan Islands. Crab color flavor the United States, nutritious, rich in protein, trace elements and other nutrients, there are 10 kinds of free
6、 amino acids, including glutamic acid, arginine, histidine and other content are more good on the body tonic effect. In this paper, hydrolysis of the amino nitrogen content and degree of hydrolysis as the index, compared papain, neutral protease and protease flavor in its optimum conditions, the flo
7、wer crab on the hydrolysis effect. The results showed that: neutral protease spend more suitable for hydrolysis of crab meat. By orthogonal test of neutral protease hydrolysis temperature, hydrolysis time, enzyme dosage, pH value and solid-liquid ratio on the flower crab Hydrolysis of law, and amino
8、 nitrogen content and degree of hydrolysis as an index to determine the enzyme Solutions of optimal parameters: pH value of 7, plus 1% of enzyme, hydrolysis temperature 50 , solid to liquid ratio (W/V) 1:2.5, hydrolysis time 4h, from the total hydrolyzate amino nitrogen content of 264.18mg / ml, deg
9、ree of hydrolysis was 59.01%. This hydrolysis process of optimum design spotted, greatly enhance the added value of the Crab, Crab for a more efficient use of resources and better preparation of development and utilization of by-products spotted hydrolyzate provide a reference. Key words Crab; Neutr
10、al proteinase; Hydrolysis;Optimal parameters 1 引言 1.1 概述 花蟹（远海 梭子蟹 ） ， 广泛分布于 舟山群岛附近海域 。 花蟹 味道鲜美 、 营养 价值高 ， 含- 4 - 有丰富的蛋白质 、 微量元素等营养成分 ， 还有 10 多种游离氨基酸 ， 其中 晶 氨 酸 、 组 氨酸 、谷 氨酸等含量较 高 ， 对身体有很好的滋补作用 。 中医认为 ， 花蟹有养筋活血、补骨添髓、清热解毒、通经络、滋肝阴的功效 。 对于黄疸、损伤、瘀血、腰腿酸痛和风湿性关节炎等疾病有一定的食疗效果。根据古籍记载 ， 花蟹适用于跌打损伤 、 伤筋断骨 、 淤血肿痛
11、的治疗 。 此外 ， 油漆过敏或因漆中毒而生疮 ， 可将活蟹捣汁敷用 。 花蟹 可食用部分每 100 克含蛋白质 14.6 克 ， 脂肪 1.6 克 ， 磷 262 毫克 ， 钙 228 毫克 ， 铁0.9 毫克 ， 维生素 a2 微克 ， 以及镁 、 锰 、 铜 、 硒 、 钾 、 钠 、 维生素 b1、 维生素 b2、 维生素e、尼克酸等多种维生素和微量元素 。 可供药用，性寒、味咸 ， 有小毒 ， 入肝经 ， 具有续筋接骨、利尿消肿 、 通经络 、 解漆毒 、 散瘀血 、 滋补等功能。其肉 、 卵巢 、 肝脏均可食用。蟹黄为高级的调味品和滋补品 。 水解动物蛋白（ HAP）是以水产动物或
12、畜禽为原料经强酸 、 强碱或酶水解工艺制得的产品 ， 能够较好地保持动物原料的固有风味特点 ， 因此 ， 问世 20 余年来得到迅速的发展和广泛的应用。日本每年使用水解动物蛋白约 1 万吨 1， 主要应用于菜肴的烹制 。 随着经济的发展 ， 我国对方便食品和高档调味品需求量大幅度上升 ， 对 HAP 的需求量随之增加 。 强酸、强碱水解法由于条件过于剧烈而渐渐被淘 汰 。 现在较多采用酶解法 ， 因为其具有反应条件温和、水解效率高等优点 ， 在 HAP 的生产中得到广泛应用 。 我国的蟹类资源丰富 ， 对蟹的主要加工是取集其胸壳下及大螯中的大块蟹肉加工蟹肉罐头 ， 也有的加工成蟹油、蟹酱、蟹黄
13、酱、和蟹香调味料等产品 2。 在蟹加工的同时 ， 难免会产生大量下脚料 (包括大量蟹壳及蟹的小脚 ) ， 其中蟹壳和蟹脚上残留的蟹肉 (以小腿的肉为主 ) ， 其蛋白质、脂肪、水分的质量分数分别为 18.66 %、 2.33 %、 78.34 %3， 若不对 这些残留的蟹肉进行再利用 ， 是对蛋白质资源的一种的极大浪费 ， 同时也会 污染环境 。 蟹壳中的残肉去除 ， 有物理法和微生物法 2,4。 本文利用酶解法对残留在蟹腿中的残肉进行水解 ， 研究酶解条件对水解效果的影响作用 ， 确定酶解的最佳工艺参数 ， 为以后的工艺研究及生产实践提供基础 。 2 实验材料、 主要 试剂与仪器 2.1 实
14、验材料 原料 花蟹购于舟山北门菜场 ； 2.2 主要试剂 试剂（规格） 厂家 木瓜蛋白酶 上海源聚科技生物有限公司 中性蛋白酶 上海源聚科技生物有限公司 风味蛋白酶 上海源聚科技生物有限公司 浓硫酸（分析纯 A.R） 国药集团化学试剂有限公司 氢氧化钠（分析纯 A.R） 国药集团化学试剂有限公司 硼酸（分析纯 A.R） 国药集团化学试剂有限公司 - 5 - 盐酸（分析纯 A.R） 国药集团化学试剂有限公司 石油醚（分析纯 A.R） 中国医药（集团）上海化学试剂公 甲醛（分析纯 A.R） 国药集团化学试剂有限公司 无水乙醇（分析纯 A.R） 国药集团化学试剂有限公司 酚酞（分析纯 A.R） 国药
15、集团化学试剂有限公司 2.3 主要仪器 仪器名称 型号 厂家 凯氏烧瓶 - - 凯氏蒸馏器 - - 电子天平 EL303 梅特勒 -托利多仪器 (上海 )有限公司 超纯水器 UPWS- -20T 杭州永洁达净化科技有限公司 电热鼓风干燥箱 GZX-9420MBE 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 数控消化 炉 KDN-04C 上海新嘉电子有限公司 数显恒温水浴锅 HH-4 国华电器有限公司 高温箱形电炉 SX-4-10 上海博迅实业有限公司 电阻炉温度控制器 KSW-40-11 上海迅实业有限公司医疗设备厂 3 实验方法与步骤 3.1 花蟹 基本组成成分测定 水分测定采用常压 105 直接干燥法
16、 5： 精确称取蟹肉 2 10g， 置于已干燥 、 冷却和称重的有盖称量瓶中 ， 移入 100 105烘箱内 ， 开盖干燥 2 3h后取出 ， 加盖 ， 置干燥器中冷却 0.5h， 称重 ， 再烘干 1h， 冷却 、 称重 ， 重复此操作直至恒重 ， 即前后两次质量差不超过2mg。 灰分测定采用高温炉 550灼烧法 5： 将花蟹肉制备成均匀的试样 ， 准确称取适量试样于已知重量的坩埚中 ， 置烘箱中干燥 ， 进行炭化 ， 再将坩埚移入高温炉灼烧至灰中无碳粒存在 。 打开炉门 ， 将坩埚移至炉口处冷却至 200左右 ， 移入干燥器中冷却至室温 ， 准确称重，再灼烧、冷却、称重 ， 直至达到恒重
17、。 粗脂肪测定采用索氏抽提法 5： 精密称取 2 5g样品 ， 必要时伴以海砂 ， 全部移 入滤纸筒内 。 将滤纸筒放入脂肪抽提器的抽提筒内 ， 连接已干燥至恒重的接收瓶 ， 由抽提器冷凝管上端加入无水乙醚至瓶内容积的 2/3处 ， 于水浴上加热 ， 使乙醚不断回流提取 ， 一般抽提 612h。取下接受瓶 ， 回收乙醚 ， 待接受瓶内乙醚剩 1 2ml时在水浴上蒸干 ， 再于 95 105干燥 2min， 放干燥器内冷却 0.5h至室温后称量 。 粗蛋白测定采用微量凯氏定氮法 5：称取均匀样品 1g左右 ， 放于开始烧瓶内 。 在凯氏烧瓶内加入表玻璃珠二粒 ， 硫酸钾 2g， 10%硫酸铜 2
18、ml， 浓硫酸 20ml， 瓶口加一小漏斗在煤气灯上隔石棉网直接加热 ， 经常转 动凯氏烧瓶 ， 防止溶液起泡外溅 。 待样品中泡沫消失后可加大火力 ， 烧至溶液蓝色透明 ， 待冷却后取下 。 之后用蒸馏水稀释至 250ml容量瓶中 ， 取 5ml置于凯氏蒸馏器内蒸馏 ， 直至硼酸液冲红色变成黄绿色 ， 再加热蒸馏 5min， 之后用标准盐酸- 6 - 溶液滴定硼酸吸收液至粉红色为止 ， 记录用量 。 3.2 酶解法水解花蟹肉的工艺流程 原料解冻组织捣碎加水调水温调 pH加酶保温酶解灭酶冷却过滤分离花蟹水解液 3.2.1 酶解处理 原料花蟹经前期处理后 ， 组织捣碎，加入一定量水混匀 。 在前
19、期确定最佳酶种步骤中 ，利用风味蛋白酶 、 中性 蛋白酶和木瓜蛋白酶分别对花蟹进行水解 ， 并控制各种酶的最适温度 、pH 等反应条件进行酶解 ， 期间不断用玻璃棒搅拌 。 表 1 蛋白 酶的相关参数表 蛋白酶名称 推荐 pH 值 风味 蛋白酶 5.0 中性 蛋白酶 7.0 木瓜 蛋白酶 7.0 3.2.2 灭酶处理 酶解结束后 ， 立即将水解液放入沸水浴中 10min 加热灭酶活 ， 冷却后过滤分离得到水解液 ， 冷藏保存 。 3.2.3 氨基态氮 的计算 1. 取 5.0ml 花蟹肉水解液 ， 定容至 100ml。取 3 个 25 ml 的锥形瓶 ， 编号 。 向 1、 2 号瓶内各加入定
20、容后的水解液 10ml 和水 25ml， 混匀 。 向 3 号瓶内加入 35 ml 水。然后向三个瓶中各加入 5 滴酚酞指示剂 ， 混匀后各加 10 ml 甲醛溶液再混匀 ， 分别用0.02mol/L 标准氢氧化钠溶液滴定至溶液显微红色 。 重复以上实验两次 ， 记录每次每瓶消耗的标准氢氧化钠溶液的毫升数 。 取平均值 ，计算水解液中含有氨基氮的毫克数 。 2. 氨基 氮计算： 氨基氮（毫克 /毫升） = （ V 未 V 对 ） NNaOH 14.008 2 公式中 V 未 为滴定待测液耗用标准氢氧化钠溶液的平均毫升数 。 V 对 为滴定对照液（ 3号瓶）耗用标准氢氧化钠溶液的平均毫升数 。
21、NNaOH 为标准氢氧化钠溶液的摩尔浓度 。 3.2.4 总氮含量的测定 采用微量凯氏定氮法 5。 - 7 - 01020304050600 1 2 3 4 5 6时间 /h水解度/% 木瓜蛋白酶中性蛋白酶风味蛋白酶3.2.5 水解度的计算公式 6 水解度 =水解液中的总氨基氮含量 /水解液中的总氮量 100% 4 实验结果 4.1 花蟹 基本组成成分测定 表 1 花蟹基本组成成分 水分（ %） 灰分 （ %） 粗蛋白 （ %） 粗脂肪 （ %） 74.53 2.28 16.5 2.43 从表 1 的数据可以看出 ， 花蟹肉中水分含量较高 ， 占 74.53%左右 ， 粗蛋白含量次之 ，占 1
22、6.5%， 灰分与粗脂肪的含量相差无几 ， 分别为 2.28%和 2.43%。 4.2 酶的筛选 蛋白酶是催化肽链断裂 的一群酶类 ， 种类很多 。 蛋白酶在酶的作用下 ， 被水解为肽类 、胨及氨基酸 ， 不同的酶具有不同的选择性和酶位切点 7。 对于蟹肉的酶解 ， 不同类型的蛋白酶水解效果差别很大 ， 各类蛋白酶 对蛋白质底物有不同的作用位点和水解方式 8-10。 本研究分别选用风味酶 、 中性蛋白酶 、 木瓜蛋白酶对蟹肉进行水解 ， 以水解液的水解度为指标 ， 探讨不同蛋白酶对花蟹肉的水解效果 。 为便于比较，控制加酶量 、 固液比 、 水解时间均相同 ，pH值和温度根据酶性质而不同 。
23、根据上述水解条件进行水解实验 ， 各蛋白酶的水解过程 (以连续时间内水解液的氨基氮含量及水解度为指 标 ) 见图 1。 图 1 蛋白酶对花蟹肉的水解效果 从图 1可以看出 ， 在酶量相同、各种蛋白酶分别在各自最佳温度 、 pH， 作用时间相同的情况下 ， 水解效果各不相同 。 木瓜蛋白酶水解能力较低 ， 中性蛋白酶与风味蛋白酶水解效果相差不大 。 其中中性蛋白酶水解时 ， 水解液的氨基氮含量及水解度均为最高 ， 可见中性蛋 白酶的水解效果最好 ， 酶解彻底 。 从水解液的外观比较 ， 木瓜蛋白酶的水解液中肉糜较多 、 较大 ， 中心蛋白酶和风味蛋白酶的水解液中肉末较细碎 ， 水解液的颜色均略显
24、黄色 ， 每种酶在作用四小时后蟹肉与壳基本- 8 - 01020304050600 1 2 3 4 5 6 7时间 /h水解度/%上都已经分离 。 就 水解液的口感而言 ， 三种酶的水解液都略有腥味 。 其中中性蛋白酶水解液的风味较其它蛋白酶水解液的好 ， 蟹香味浓郁 ， 但稍带苦味 。 综合以上结果认为 ， 对于酶水解蟹肉来说 ， 中性蛋白酶较适宜 ， 本文将其做为实验用酶进行下一步水解条件的研究 。 4.3 酶解最佳工艺研究 4.3.1 中性蛋白酶的水解过程 将木瓜蛋白酶在 pH7 、 50 下 ,以固液比 1 3、酶用量 1% 对蟹腿肉水解 6h， 记录每小时内水解率的变化 ， 进而表示
25、中性蛋白酶的水解过程 。结果如图 2所示 。 图 2 中性蛋白酶的水解过程 由图 2可知 ， 中性蛋白酶在初期的 1 h内 ， 水解反应迅速 ， 水解率达到 48.50左右 。 而后 ，水解率略有增加 ， 但在 2 h后 ， 水解度无明显变化 ， 图中曲线趋于水平，可知水解反应达到平衡状态 。 这可能是水解度较高时 ， 存在产物抑制因子 ， 即在较高水解度时形成的水解产物能够抑制反应的进行 11。 因为本实验在花蟹肉水解过程中 ， 底物浓度较高 ， 在任何时刻底物达到饱和 ； 既 然水解反应是底物始终饱和 ， 那么水解度曲线形状就不可能解释为底物耗尽 ，我们就能排除 酶失活的可能性 ， 因为若
26、在水解液中加入新鲜底物 ， 水解反应的速率就会迅速增加 12。 因此选择以后的酶 解时间为 4 h。 4.3.2 酶浓度对水解效果的影响 试验固定酶解温度 50 ， 固液比 1 3， 水解时间 4h， pH为 7考察不同加酶量对花蟹水解效果的影响 。 其结果如图 3所示 。 - 9 - 01020304050600 1 2 3 4 5 6 7时间 /h水解度/%pH 4pH 5pH 6pH 7pH 80204060800 1 2 3 4 5 6时间 /h水解度/%0. 60 %1%1. 50 %2%2. 50 %图 3 加酶量对水解效果的影响 在底物浓度过量的情况下 ， 随着蛋白酶用量的增加
27、， 蛋白质的水解度也随着增加 13。 在通常条件下 ， 酶的用量多 ， 酶解反应快 ， 水解程度也越彻底 。 在试验过程中发现 ， 随着酶用量的增加 ， 虽然蛋白质的水解率和产品的得率都增加 ， 但同时也会产生苦味 。 卢东海研究牡蛎酶解试验中发现 14， 酶用量为 600U/g 以下 ， 水解率为 55.1%时 ， 人的味觉不能辨别出苦味 ；酶用量为 800U/g， 水解率为 62%时 ， 人的味觉难以辨别出苦味；酶用量为 1000U/g，水解率为 64%时 ， 人的味觉可以比较明显辨别出苦味 。 Umetsu15指出，随着酶用量的增加 ， 会使产品中分子量八百左右的肽比例上升 ， 这种肽多具苦味 。 苦味与水解产物中的疏水性氨基酸在肽链中的位置及含量有关 。 当疏水性氨基酸位于肽链末端位置 ， 表现出苦味最大 。 酶水解蛋白质破坏了原有蛋白结构 ， 使原来隐藏于分子内部的疏水性氨基酸如亮氨酸 、 异亮氨酸 、 苯丙氨酸等露于分子表面 ， 因而 几种酶的水解产物都有不同程度的苦味产生 。 故实际酶用量控制在 1%即可 ， 本实验就取加酶量为 1%。 4.3.3 pH 值对水解效果的影响 试验固定酶解温度 50 ， 固液比 1 3， 水解时间 4h， 加酶量 1%， 比较不同 pH值时中性蛋白酶水解的效果 ， 其结果如图 4所示 。 图 4 pH 值对水解效果的影响
