1、 本科毕业论文 （ 20 届） 壳聚糖的过氧化氢降解工艺研究 所在学院 专业班级 食品科学与工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 目录 摘要 1 ABSTRACT2 1 引 言 3 1.1 概述 3 1.2 壳低聚糖制备 3 2 实验材料、主要 试剂与仪器 3 2.1 实验材料 4 2.2 主要试剂 4 2.3 主要仪器 4 3 实验方法 与步骤 4 3.1 壳聚糖脱乙酰度的测定 4 3.2 壳聚糖过氧化氢降解的工艺流程 5 3.3 壳聚糖过氧化氢 /醋酸体系降解机理 6 4 实 验结果及讨论 6 4.1 壳聚糖理化特性的测定 6 4.2 壳聚糖过氧化氢降解工艺的确定 7 4
2、.3 壳聚糖过氧化氢降解 后期处理最佳工艺条件的确定 10 4.4 验证实验 11 4.5 壳低聚糖 的质量检测指标分析 11 5 小结 12 参考文献 12 致谢 14 - 1 - 摘要 ： 壳低聚糖在医药、食品、保健品、日用化工、环保和农业方面有广泛的应用价值。本文采用过氧化氢 -醋酸氧化降解法，主要探讨醋酸浓度、反应温度、过氧化氢浓度和反应时间对 壳低聚糖 得率的影响。得出了过氧化氢降解法制取 壳低聚糖 的最佳工艺：醋酸浓度为 2%，反应温度为 70 ，过氧化氢浓度为 4%，反应时间为 3h。降解后期处理的最佳条件为：浓缩温度 60 ，浓缩时间 10min。在上述条件下壳低聚糖的得率为
3、52.71%，平均分子量为 300010000。 本文对壳聚糖降解工艺的优化设计，使 壳聚糖的附加值得到大幅度地提升，为更加有效利用壳聚糖资源以及更好地开发应用壳聚糖产品提供参考依据。 关键词 ：壳聚糖；氧化降解；过氧化氢；醋酸 - 2 - Abstract Chitooligosaccharides has a wide range of applications in medicine, food, health products, household chemicals, environmental protection and agriculture.The hydrogen pero
4、xide-acetic acid oxidative system was used to degrade chitosan.Influences of the acetic acid concentration,reaction temperature,hydrogen peroxide concentration and reaction time to the yield of degraded chitosan were discussed.The gegradation of chitosan by hydrogen peroxid for the best technologica
5、l conditions are as followings: the acetic acid concentration was 2%,reaction temperature was 70 , hydrogen peroxide concentration was 4%,reaction time was 3h.The optimum processing condition for the post-processing of the gegradation of chitosan was: concentrate at 60 for 10min.Under these conditio
6、ns,the yield of degraded chitosan was 52.71%,the average molecular weight was 300010000.This article optimization design the gegradation of chitosan, make the added value of chitosan greatly ascend and provide a reference for more effective use of resources and better application and development of
7、chitosan. Key words Chitosan; Gegradation; Hydrogen peroxide;Acetic acid - 3 - 1 引言 1.1 概述 壳聚糖是由大部分 D-氨基葡萄糖和少量的 N-乙酞 -D-氨基葡萄糖组成的，以 -(1， 4)糖昔键连接起来的直链多糖，化学名为 聚 (1， 4) -2-氨基 -2-脱氧 - -D-葡萄搪，纤维素的结构与其类似，是甲壳素 (chitin)部分或全部脱除乙酞基后得到的脱乙酞产物 1。甲壳素广泛存在于虾、蟹等甲壳动物及昆虫、藻类和细菌 中，是世界上仅次于纤维素的第二大类天然高分子化合物。 壳聚糖具有紧密的晶体结构，分子
8、量在几十万至几百万，并且粘度较大，在水中不能溶解，只可以溶于某些稀酸，这使得壳聚糖的应用收到了很大的限制 2。而壳低聚糖具有较高溶解度，所以很容易被吸收利用。同壳聚糖大分子相比，壳低聚糖具有： 水溶性：当壳聚糖经过氧化降解，酶降解等方式降解后，分子量降低，壳聚糖分子中的氢键作用随之减弱，使壳聚糖分子在溶液中具有更大的扩展趋势，从而引起壳聚糖分子构象发生一定的变化。而链长度和分子构象的变化使得壳聚糖在水溶液中的无序程度增加， 从而使其水溶性大为改善。 吸湿保湿性：壳 低 聚糖分子中大量的 NH2 和 OH 强极性基团的存在，不仅使壳低聚糖 的水溶性大为改善，也使其具有良好的吸湿保湿功能。 抗菌抑
9、菌功能 :有试验证明壳聚糖的抑菌作用是随着壳聚糖均分子量的降低而逐渐增强的，尤以均分子量为 1500左右的壳低聚糖的抗菌效果最好 3。壳低聚糖具有广泛的应用价值，在食品，化妆品，农业，医药方面也都具有其独特的作用。食品方面，可作为防腐剂，增稠剂，稳定剂；在农业方面，可以作为肥料的添加剂添加到农田中，防止昆虫，病毒等因素对作物的损害；化妆品方面，可 以作为保湿成分添加到化妆品中，天然无危害。其中，由于壳低聚糖可以通过抑制细菌生成，增加人体内纤维素的量来提高机体抵抗病毒的能力，它逐渐成为保健食品的原料之一 4。在壳低聚糖的众多应用中，在医药方面应用相对具有较高的科学技术含量和附加值，随之对其在这方
10、面的研究也越来越多。我国海洋资源十分丰富，虾蟹产量颇丰，甲壳素和壳聚糖蕴藏量十分丰富，我们应充分利用天然资源，加强壳低聚糖及其衍生物的开发与应用研究。 制备合适的壳低聚糖是拓宽壳聚糖广泛应用的前提，开发环境污染少、成本低廉、工艺简单、产品均一的工艺是生产壳低聚 糖的发展方向 5。 1.2 壳低聚糖 的制备 近年来壳聚糖降解制备壳低聚糖的方法，包括化学降解法（酸降解法，氧化降解法）、酶降解法（专一性酶降解法，非专一性酶降解法）、物理作用帮助下的降解法（超声波讲解法，辐射降解法，微波降解法）以及复合降解法等 69。其中酶降解制备壳低聚糖同样受到了极大关注，但由于专一性酶价格昂贵、难以商业化，首先要
11、解决寻找其它降解效果好、价格低廉的非专一性酶及复合酶 的难题 。而过氧化氢氧化降解法由于无毒无害，产品相对分子质量低且分布窄，成本低廉，工艺简单易行，易于实现工业化，是人们近年来比较重视的一种无污染的环保型生产工艺。相对的，国内对过氧化氢氧化降解法研究也比较多，但应注意过度降解会伴随副反应以及影响产品活性的问题。 过氧化氢在酸性、碱性和中性条件下都可以进行降解。在碱性和中性介质中，降解 是非均相反应，反应慢且不均匀；而在酸性介质中，反应是均相的。所以在实际应用中可以考虑在弱酸体系中采用过氧化氢制备平均相对分子质量在 3500以上的 壳低聚糖 。 由于壳聚糖降解工艺技术目前还处在初级阶段，对于醋
12、酸 /过氧化氢均相降解体系也仅在较少文献中出现。由所以本文通过正交试验优化壳聚糖过氧化氢在醋酸体系 中的降解工艺条件，以确定壳聚糖过氧化氢- 4 - 降解的最佳工艺，得到得率较高的分子量在 300010000的 壳低聚糖 ，从而使壳聚糖的附加值得到大幅度地提升，为更加有效利用壳聚糖资源以及更好开发应用壳聚糖产品提供参考依据。 2 实验材料、主要试剂与仪器 2.1 实验材料 壳聚糖，常温存放于实验室。 2.2 主要试剂 试剂（规格） 厂家 盐酸（分析纯 A.R） 中国医药集团上海化学试剂有限公司 氢氧化钠（分析纯 A.R） 中国医药集团上海化学试剂有限公司 醋酸（分析纯 A.R） 中国医药集团上
13、海化学试剂有限公司 过氧化氢（分析纯 A.R） 中国医药集团上海化学试剂有限公司 甲基橙 温州市东升化工试剂厂 pH 试纸 上海三爱思试剂有限公司 2.3 主要仪器 仪器名称 型号 厂家 恒温水浴振荡器 CS501 型 上海棱光技术有限公司 恒温水浴锅 HH-系列 常州市国华仪器厂 精密 pH 计 ZD-2 型 上海精密科学仪器有限公司 旋转蒸发器 A-1000S 冷冻干燥机 LGJ-10 北京四环科学仪器厂 超滤系统 Millipore Mini P 恒温磁力搅拌器 国华电器有限公司 超纯水器 杭州永洁达净化科技有限公司 数显鼓风干燥箱 上海博迅实业有限公司医疗 设 备厂 电子天平（ 0.0
14、1g） 余姚市金诺天平仪器有限公司 电子天平（ 0.001g） 梅特勒 托利多仪器（上海）有限公司 3 实验方法与步骤 3.1 壳聚糖脱乙酰度的测定 本实验采用酸碱滴定法测定壳聚糖的脱乙酰度。 准确称取 0.30.5g 样品，置于 250ml 锥形瓶中，加入标准 0.1mol/L 盐酸溶液 30mL， 在 2025 下溶解完全，加入 56mL 混合指示剂 (1%)甲基橙 +(1%)苯胺蓝 (1:2)， 在搅拌下用 0.05mol/ L 氢氧化钠溶液滴定至锥形瓶中的胶体 溶液刚好呈浅蓝绿色，既为滴定终点。 脱乙酰度的计算按下列公式计算： 自由氨基含量 - NH 2% =( C1V1-C2V2 )
15、0.016/G100% 脱乙酰度 % =(-NH 2%/9.94%)100% - 5 - 式中： C1 盐酸标准溶液的浓度， mol/ L C2 氢氧化钠标准溶液的浓度， mol/ L V1 加入的盐酸标准溶液的体积， ml V2 滴定耗用的氢氧化钠标准溶液的体积， ml G 样品重， g 0.016 与 1ml 1 mol/ L 盐酸溶液相当的氨基量， g 9.94% 理论氨基含量 10 3.2 壳聚糖过氧化氢降解的工艺流程 醋酸 滴加 H2O2 壳聚糖 溶解 H2O2 降解 终止反应 过滤 真空浓 缩 超滤 冷冻干燥 壳低聚糖干品 3.2.1 操作要点 (1) 溶解：取 3g 壳聚糖溶于
16、100ml 醋酸溶液中，震摇，使其溶解呈均相状态。 (2) 过氧化氢降解：水浴加热下，连续滴加一定浓度的过氧化氢溶液到溶解的壳聚糖中 1h ， 边滴边搅拌 ，滴加完毕继续反应到指定时间。 (3) 水溶性检验：用氢氧化钠溶液滴 定，若无白色絮状沉淀则为水溶性。 (4) 终止反应：过氧化氢在碱性介质中快速分解，调 ph至碱性。用淀粉碘化钾试纸验证是否还残留过氧化氢。 (5) 过滤：过滤除去不容杂质。 (6) 浓缩：由于壳聚糖在高温易产生褐变，所以采用旋转蒸发器，在低温下浓缩壳聚糖溶液。目的是减少超滤所用时间，提高冷冻干燥的效率。 (7) 超滤：超滤出分子量在 3000到 10000的壳低聚糖，即得
17、截留液 2。 将中性的降解产物溶液移至超滤系统中，截留分子量为 10000 的超滤膜 M-1 进行超滤分离，得到截留液 1 和透过液 1，然后将透过液用截留分子 量为 3000 的超滤膜 M-2 再次超滤，得到截留液 2 和透过液 2，取截流液 2 进行冷冻干燥 11。 HAc/H2O2 降解 壳聚糖原料 膜分离 截流液 1（ 分子量大于 10000） M-1 透过液 1 膜分离 截流液 2 (分子量 300010000) M-2 透过液 2 (分子量小于 3000) 图 2 超滤示意图 - 6 - (8) 冷冻干燥：冷冻干燥得到分子量为 300010000 的 壳低聚糖 干品。 3.2.2
18、壳低聚糖得率的计算 壳聚糖经降解变成小分子量的水溶性的壳低聚糖，由于降解后的壳低聚糖分子量分布较广，故经超滤可得出确定的分子量范围的壳低聚糖的得率，本文降解的目标分子量为 300010000。得率的计算式如下： %10 0(% ) BC得率 其中： B 代表壳聚糖的质量 (g)； C 代表超滤干燥后所得 壳低聚糖 的质量 (g)。 3.3 壳聚糖过氧化氢 /醋酸体系降解机理 壳聚糖的结构式见图 1。通 常分析认为过氧化氢在水溶液中发生电离形成的各种游离基团。其中高活性基团不能长期稳定存在，但在短时间内具有极强的氧化性能 ， 它们攻击壳聚糖上那些带有活泼氨基的 -(1， 4)糖苷键，致使其解聚。
19、 在中性介质中，大分子壳聚糖不溶于水 ， 降解反应是非均相反应，加上壳聚糖分子内和分子间氢键的作用，过氧化氢渗入速度慢 ， 反应发生在表面及无定形区，反应的可及度较小，反应速度相对较慢 ， 且反应不均匀。 当溶解在一定浓度的稀酸中时，氢离子与壳聚糖分子链上的游离氨基不断地结合，全部形成阳离子 -NH3+，当溶液中剩余的氢离子不多，亦即溶 液中的离子强度很低时，壳聚糖分子链上的 -NH3+基团因正电荷的同性排斥而使其分子链舒展，成为扩张型线形分子，溶 解度增大 ， 从而使活性氧化基团的进攻位点较多，有利于降解反应的发生 12。 图 1 壳聚糖的结构式 4 结果与讨论 4.1 壳聚糖理化特 性的测
20、定 壳聚糖理化特性：纯净壳聚糖为白色或灰白色， 呈粉末状 。不溶于水和碱溶液中，可溶于低浓度无机酸或某些有机酸。溶于稀酸呈粘稠状，在稀酸中壳聚糖的 -(1， 4)糖苷键会慢慢水解，生成低分子壳聚糖。壳聚糖的溶解性与脱乙酰度、分子量、粘度有关，脱乙酰度越高，分子量越小，越易溶于水；分子量越大，粘度越大。 表 1 壳聚糖的 理化特性 脱乙酰度（ %） 水溶性 性状 80.24 不溶 灰白色粉末 4.2 壳聚糖过氧化氢降解工艺的确定 - 7 - 2530354045500 1 2 3 4 5 6醋酸浓度/ %得率/%2530354045505550 55 60 65 70 75 80降解温度/ 得率
21、/%4.2.1 醋酸浓度对壳低聚糖得率的影响 取 5份等量的 壳聚糖 ，分别按 醋酸 浓度比为 1%、 2%、 3%、 4%、 5%的标准加入蒸馏水配制 壳聚糖醋酸均相体系 ， 固定反应温度为 65 ，反应时间为 3h， 过氧化氢浓度为 3%，然后在恒温水浴振荡器 中进行降解反应 。 分子量在 300010000的 壳低聚糖 得率 情况见图 3。从图中可知，随着 醋酸 浓度的增大， 得率 逐渐增加， 醋酸 浓度为 2%时出 得率 最大，而后 醋酸 浓度再增加 得率 反而下降。这可能是因为 2 %醋酸作介质 ， 壳聚糖恰好能溶解 ， 不易形成铵盐 ， 故氧化作用最多。当醋酸浓度过高时，壳聚糖分子
22、链中的绝大部分 - NH2就会与 H+ 结合形成 R- NH3+ 缺电子体系，造成壳聚糖分子 中自由氨基锐减，即主要存在的是乙酰氨基，而氧化降解多发生在那些氨基未结合 H+ 的糖单元的 -(1， 4)糖苷键上，这阻碍了氧化降解 13,14。 故选取醋酸浓度为 1% 3%为正交试验的参数。 图 3 醋酸浓度对得率的影响 4.2.2 降解温度对 壳低聚糖 得率的影响 取 5份等量的壳聚糖溶于 2%的醋酸溶液中，固定过氧化氢浓度为 3%，反应时间为 3h，分别按温度为55 ， 60， 65， 70， 75进行反应， 研究不同 反应温度对 壳低聚糖 得率的影响 。分子量在 300010000的 壳低聚
23、糖 的得率情况见 图 4。从图中可知，随着温度的逐渐升高，起初得率增加较快，在 65时趋于平缓 ，原因可能是壳聚糖在此温度下反应速率适中，壳聚糖基本降解，但是也不会完全降解成分子量很小的 壳低聚糖 。 当温度达到 75时得率反而降低， 这时 壳聚糖应该部分降解成分子量更小的 壳低聚糖 ， 透过截留分子量为 3000的超滤膜 ， 使得分子量在 300010000的低壳聚糖的得率下降。且 75以上时所得的壳低聚糖溶液颜色为棕色，明显变深，可能是温度过高，产生褐变，影响产品色泽与质量 15。为了进一步确定较佳反应温度，故选取反应温度为 60 70 为正 交试验的参数。 - 8 - 253035404
24、5501.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5降解时间 /h得率/%2530354045500 1 2 3 4 5 6过氧化氢浓度 /%得率/%图 4 降解温度对得率率的影响 4.2.3 降解时间对 壳低聚糖 得率的影响 取 5 份等量的壳聚糖溶于 2%的醋酸溶液中，固定过氧化氢浓度为 3%， 反应温度为 65， 分别选取反应时间为 2h、 2.5 h、 3 h、 3.5 h、 4 h，研究不同反应时间对 得率 的影响。结果见 图 5。从图中可知，随着反应时间增加，起初 得率 增加较快，当达到 2.5h 时 ， 得率趋于平缓。 原理与降解温度对分子量为 300010000的壳低聚糖的得率影响
25、相似。 如果 降解 时间太短则使 降解 不彻底，从而使 得率 降低；而 降解 时间过 长会 使壳聚糖降解成分子量非常低的 壳低聚糖 ，透过 3000 的超滤膜，从而影响得率。而且过长的降解时间会 延长生产周期， 影响产品外观的色泽及质量。 综合考虑生产周期和实验效果，选取 2.53.5h 范围内的 降解 反应时间为正交试验的参数，以确定较佳反应时间。 图 5 降解时间对得率的影响 4.2.4 过氧化氢浓度对 壳低聚糖 得率的影响 取 5份等量的壳聚糖溶于 2%的醋酸溶液中，固定反应温度为 65，降解时间为 3h，分别加入 1%、 2%、3%、 4%、 5%的过氧化氢溶液，研究不同过氧化氢浓度对 壳低聚糖 得率的影响。其得 率情况见图 6。从图中可知，随着过氧化氢浓度的增加，起初得率 增加较快，当添加量大于 4%时得率反而下降。原因可能是当壳聚糖降解成可溶性的小分子后 ， 分子上 NH2+ 数量变少 ， 氧化也受到乙酰基的体积位阻作用 ， 降解速度受到限制 16。也有可能是过氧化氢浓度过高，降解反应趋于激烈，壳聚糖大量降解成分子量很小的壳低聚糖。故选取过氧化氢浓度为 2%4%为正交试验的参数。
