1、 本科毕业论文 （ 20 届） 脉红螺多糖提取工艺研究 所在学院 专业班级 食品科学与工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 目录 中文摘要 1 英文摘要 2 1.前言 3 1.1多糖的功能 3 1.1.1抗凝血作用 3 1.1.2抗辐射作用 3 1.1.3降血糖、降血脂 3 1.1.4抗炎、抗疲劳作用 3 1.2多糖的提取 4 1.2.1动物多糖的提 取 4 1.2.2物多糖的提取 4 1.4发展方向和工作重点 4 2 实验材料、主要仪器与试剂 4 2.1实验材料 4 2.2主要仪器 4 2.3主要试剂 5 3 实验内容 5 3.1苯酚硫酸法 5 3.2葡萄糖标准曲线制备 5
2、 3.3苯酚硫酸法测定脉红螺多糖波长 6 3.3.1脉螺液去色和未去色的波普对比 6 3.4脉红螺多糖提取的单因素试验 6 3.4.1料液比 6 3.4.2提取温度 6 3.4.3提取时间 6 3.5脉红螺多糖提取工艺的优化 6 3.6回收率实验 6 3.7重现性试验 6 4 结果与讨论 6 4.1葡萄糖标准线的绘制 6 4.2脉红螺光谱扫描最大吸收峰选择 7 4.3脉红螺去色素与为去色素的对比 7 4.4.1料 液比对多糖提取量的影响 8 4.4.2提取温度对多糖提取量的影响 8 4.4.3提取时间对多糖提取量的影响 9 脉红螺多糖提取工艺研究 2 4.5正交试验结果 9 4.6 稳性试验
3、10 4.7加样回收率试验 11 5.结论 11 参考文献 12 致谢 26 脉红螺多糖提取工艺研究 1 摘要 本文主要研究从脉红螺中提取多糖的方法优化。通过苯酚 -硫酸显色法，比照葡萄糖标准曲线计算多糖量。在 采用 单因素分析 (提取时间、料液比、提取温度 )的基础上结合正交试验，优化脉红螺多糖提取的条件。最后得到脉红螺的最佳提取条件为：提取温度 50、料液比 1： 80、提取时间 1h。样品回收率在 82.11 109.97之间。 关键词 脉红螺；多糖；苯酚 -硫酸法；正交试验 脉红螺多糖提取工艺研究 2 Extraction Process of Polysaeeharides from
4、 Rapana venosa Valenciennes AbstactThis paper mainly studies the Methods optimize of polysaccharide extraction from Rapana venosa Valenciennes. Calculation the content of polysaccharide through Phenol-sulfuric acid colorimetry and glucose Standard curve. using single factor analysis(extraction time、
5、 solid to solvent ratio、 extraction temperature) , then,using orthogonal analysis, optimized extraction conditions. Finally got the Best extraction conditions of Rapana venosa Valenciennes: extraction temperature is 50 ; solid to solvent ratio is 1:80;extraction time is 1h, the standard recovery rat
6、e is between 82.11 109.97 . Key wordsRapana venosa Valenciennes; Polysaeeharides; Phenol-sulfuric acid colorimetry ;orthogonal experiment 脉红螺多糖提取工艺研究 3 1 前言 脉红螺（ Rapana venosa Valenciennes） 又名角泊螺， 软体动物门腹足纲 。螺壳表面为黄褐色，有棕色斑点和色带密生低而均匀的螺肋，向外突出形成肩骨，螺旋部小，体螺层膨大成体壳高 11-12cm。脉红螺主要在我国福建以北沿岸广为分布，舟山海域均有发现。脉红螺幼螺多
7、分布在低潮线附近岩石间，成螺一般多栖息在潮下带数米至数十米深的细泥、碎壳的海底。脉红螺足部特别肥大、味美、营养丰富 1。 多糖 (polysaccharide)是指 10 个以上单糖分子通过糖苷键连接的高分子聚合物，可以包括几百甚至几千个单糖分子 。 多糖广泛存在于自然界中的动物、植物、微生物和海洋生物等机体内，既是生物体的贮能物质，也是生物体的结构物质，还参与多种重要的生命活动。多糖不是一种纯粹的化学物质，而是聚合程度不同的物质的混合物。多糖类一般不溶于水，没有甜味 ，不能结晶，无还原性和变旋现象。多糖也是糖苷，所以可以水解，在水解过程中，往往产生一系列的中间产物，最终完全水解得到单糖。 来
8、源于海洋动、植物及微生物中的多糖称为海洋多糖 ,大多数的 海洋多糖具有生物活性 ,如增强免疫调节、降血糖、调血脂、抗病毒、抗肿瘤、抗凝血、抗衰老、抗炎等 2，因此，具有开发成为保健食品、药物、载体材料3等应用在医药卫生领域的潜力。 1.1 多糖的功能 1.1.1 抗凝血作用 Volk 等 4据报道产自 Cyanobacteria 的非硫酸化的多糖（ RPSs）具有抗凝血活性，原产于 S.aquatilis 的硫酸化多糖 RPS 则具有抗凝血作用 ,其强度和墨角藻聚糖相当 ,弱于肝素。据研究牡蛎多糖在临床上对于促进伤口愈合和缺血部位的血管生成具有重要的应用价值。5Matou 等 6报道 ,海中的
9、可变单胞菌 A.infernussp.产生的胞外多糖化学修饰产物高硫酸化胞外多糖 (OS- EPS)具有促进血管生的生成，并有降低抗凝血活性的作 用。 1.1.2 抗辐射作用 黑木耳多糖具有抗放射作用，对 Co7照射的动物可提高存活率。杨明亮，黄晓兰等 8的研究表明长期注射海带多糖的 Wistar 大鼠，在一次性全身照射射线后，体内体液免疫、细胞免疫、非特异性免疫相关指标及脾淋巴细胞凋亡率均比未注射的 Wistar 大鼠更好。 研究结果表明 :螺旋藻水溶性多糖能显著增强辐射引起的 DNA 的 切除修复活性和程序外DNA 合成。同时能显著减轻小鼠骨髓细胞和蚕豆根尖细胞的辐射遗传损伤，大大降低辐射
10、引起的突变频率。 1.1.3 降血糖、降血脂 植物多糖能够促进胰岛分泌胰岛素，影响糖代谢酶的活性，促使组织对葡萄糖的作用，从而抑制糖异生。其降血糖作用主要表现在降低肝糖原、促进外周组织器官对糖的利用；促进降糖激素和抑制升糖激素作用；保护胰岛细胞；以及调节糖代谢酶活性等方面 9Girola等 10研究发现壳多糖可降低血中总胆固醇，低密度脂蛋白胆固醇和甘油三酯的含量，提高高密度脂蛋白胆固醇的含量。 药理实验证明， 茶多糖具有明显的降血糖的作用，其中有降血糖作用的多糖为牛乳葡聚糖 11。 1.1.4 抗炎、抗疲劳作用 研究结果表明，一些多糖具有抗炎作用。泥鳅多糖的抗炎效果与地塞米松并没有显著差别，甚
11、至有的作用还略强于地塞米松磷酸钠注射液，并且呈一定的量效关系。河蚌多糖 (Mpa) 12对甲醛引起的大鼠的足拓反应以及二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀，具有明显不同程度的抗炎作用，且对慢性炎症效果更好，因此可证明 MPa 的抗炎机理不是直接作用的，很可能通过脉红螺多糖提取工艺研究 4 机体调整炎症病灶生理变化或抑制致炎因子的产生而缓慢发挥作用的。余宗阳、王文武 等 13人对香茹多糖抗炎作用的研究表明：香菇多糖能明显抑制二甲苯性小鼠耳肿胀、显著拮抗鸡蛋清致小鼠足趾肿胀和滤纸片所诱导的肉芽组织增生。近年来已证实具有抗疲劳作用的动物多糖有：鲍鱼多糖、鳖多糖、壳聚糖。研究表明，壳聚糖具有极显著的抗疲劳活性，壳
12、聚糖能显著延长小白鼠负重游泳时间，能有效减少运动机体里乳酸的堆积，并且能够迅速消除堆积的乳酸，增强有氧代谢耐的能力，提高小白鼠机体运动能力，从而延缓小鼠机体疲劳的发生并加速疲劳的恢复。鲍鱼多糖在调节免疫、抗炎亦有十分明显的功效。从鲍鱼皱纹盘鲍中提取物，能明显增加小鼠 吞噬细胞的吞噬能力，增强迟发超敏反应，延长小鼠的生命力。 1.2 多糖的提取 1.2.1 动物多糖的提取 动物多糖几乎存在于动物所有的组织器官中，主要存在于细胞间质中，在机体中的分布不均一，随组织类型而定。 对于动物多糖的提取经常采用乙醚、甲醇、丙酮等先进行预处理，其主要目的是脱脂 14。脱脂后的物质或是不需要脱脂的原料常用水作溶
13、剂来提取多糖，近年来大都采用碱提取法 15 16或蛋白酶水解法和水解酶消化法 17 18，也有用超声波等方法来提取，在最大限度减少多糖损失的前提下，提高多糖提取率。用水及中性盐溶 液提取较温和，适用于透明质酸等不含硫酸基多糖的提取 (因为硫酸基经碱处理后易发生 Walden 转化或形成 36 一内醚衍生物而发生脱硫现象 )。稀碱液提取法适用于多糖与蛋白质间结合型的转化，碱提取法是基于蛋白多糖中的糖肤键对碱的不稳定性，提取过程应在温和条件下，以避免氨基多糖的碱降解。蛋白酶水解法是提取动物多糖的理想方法，蛋白酶作用的肤键范围广泛，使蛋白质充分水解。除蛋白的技术主要应用于动物多糖的提取，因用水或盐溶
14、液提取可得到大部分与蛋白质结合的粘多糖，可用酶降解蛋白质部分或用碱使多糖蛋白质间的键裂开以促使粘多糖在提 取时的溶解。 1.2.2 植物多糖的提取 水提淳沉法是植物多糖提取中最常用的方法。多糖常与其他分子共存于植物中，可利用多糖不溶于有机溶剂的性质在提取液中加入乙醇等使多糖从提取液中沉淀出来，到达初步分离纯化的目的。在此基础上，为改进水提醇沉法，而采用一些辅助方法。如：微波辅助提取，杨性民等采用比较试验证明微波辅助法提取率明显高于单纯水提法 19；有研究者采用超声波辅助提取多糖，超声技术应用于植物细胞壁破裂，大大加快了反应速度，有效提高了收率。赵文彬等 20利用超声技术提取天山大黄多糖，在 3
15、5KHz 超声他提取 40min 后，经过滤，浓缩，醇沉等工艺，多糖提取率达 8.756% ；细胞壁的主要成分是纤维素，利用酶恰当处理，可是细胞壁软化、膨胀和崩溃，改变其通透性，提高细胞内含物的溶出。 2 实验材料、主要仪器与试剂 2.1 实验材料 脉红螺干粉的制备：本实验研究脉红螺全脏器的提取率，活体脉红螺（购置于舟山南珍菜场），洗净去壳，控干水分后放入高速组织捣碎机捣碎，分别用等体积的丙酮和 95%的乙醇浸泡 10 小时和 2 小时，出去滤液后放置于 40的烘箱中干燥，粉碎后过 60 目筛，装于密封袋中，放置冰箱备用。 2.2 主要仪器 仪器 名称 型号 厂家 高速组织捣碎机 山海标本磨具
16、厂 脉红螺多糖提取工艺研究 5 紫外分光光度计 UV-1100 上海美谱达仪器有限公司 干燥箱 DGG-9240A 电热恒温干燥箱 手提式高速万能粉碎机 DTF-250 温岭市林大机械厂 飞鸽牌离心机 TDL-40B 上海安亭科学仪器厂 电子天平 赛多利斯科学仪器有限公司 数显恒温水浴锅 HH-4 常州澳华仪器有限公司 2.3 主要试剂 试剂 （规格） 厂家 浓硫酸 (分析纯 AR) 国药集团化学试剂有限公司 苯酚 (分析纯 AR) 国药集团化学试剂有限公司 丙酮 (分析纯 AR) 国药集团化学试剂有限公司 乙醇 (分析纯 AR) 国药集团化学试剂有限公司） 碳酸钠 (分析纯 AR) 苯酚为重
17、馏酚，称取 100g 苯酚， 0.05g 碳酸氢钠和 0.1g 铝片，置圆底烧瓶中加热蒸馏，收集 180 182的馏分 21 5%苯酚溶液制备：准确称取 5g 苯酚于干燥烧杯中，加一定量的蒸馏水溶解后移入 100ml的棕色容量瓶中，加蒸馏水定容后得到 5%苯酚。 活性炭的活化：去一定量得活性炭加入 2g/mlHCl 溶液，置于 35水浴锅 30 分钟后抽滤，加蒸馏水洗涤，直至 PH5 6。放置于 150的马弗炉中烘干 5 小时。 1%NaOH 料液的配置，精确称取干燥 NaOH10g 至于大烧杯中，加入 1000g 蒸馏水，搅拌溶解后备用。 3 实验内容 3 1 苯酚硫酸法 苯酚 -硫酸法是利
18、用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速 脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。 在波长 490nm 以比色法测定 其吸光度，再同葡萄糖标准曲线比较，确定其浓度值。 3.2 葡萄糖 标 准曲线的制备 精密称取 105干燥至恒重的葡萄糖标准品 20mg，置 500l 容量瓶中加水溶解并稀释至刻度，摇匀，配得 40 g /ml 的葡萄糖标准溶液。精密吸取葡萄糖标准溶液 0.2、 0.4、 0.8、 .2、1.6ml，分别置于 10mL 具塞刻度试管中，各以水补至 2.0ml，然后分别加入 5%苯酚溶液 1ml，摇匀，迅速加入 5ml 浓硫酸，放入沸水中 15min，取出置冷水中 冷却 3
19、0min，以 2ml 的蒸馏水按同样显色操作作为空白，用紫外分光光度计在 490nm 处测定吸光度。以吸光度 A 值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。 22 3.3 苯酚硫酸法测定脉红螺多糖波长 精密吸取 0.2、 0.4、 0.8、 1.2、 1.6ml 由 10ml 脉红螺蒸煮液定容到 100ml 的溶液经过脉红螺多糖提取工艺研究 6 苯酚硫酸法处理后，在 400 600nm 范围内进行光谱扫描，选择其最大吸收峰波长。 3.3.1 脉红螺蒸煮液去色和未去色的波普对比 分别称取 1g 脉红螺干粉按相同的方法条件蒸煮后离心取上清液，一份加入一定量的活性炭去色 ，另外一份保持原样不作处理
20、。分别取去色和未去色的脉红螺蒸煮液各 1.2ml 1.6ml用蒸馏水定容到 8ml 后测吸光度，观察色素对脉红螺吸收峰有无影响。 3.4 脉红螺多糖提取的单因素试验 本次试验分别考察了提取时间、提取温度、料液比对脉红螺总糖得率的影响。 3.4.1 料液比 称取脉红螺干粉五分各 1g，分别按料液比 1:20、 1:40、 1:60、 1:80、 1:100，在 70下水浴 2h，置于高速离心机 3000r/min，离心十分钟，取上清液。按苯酚硫酸法测定脉红螺多糖的浓度，分析料液比对脉红螺多糖得率的影响。 3.4.2 提取温度 称取脉红螺干粉五分各 1g，按料液比 (W/V)1:80，分别在 40
21、、 50、 60、 70、 80下水浴2h，置于高速离心机 3000r/min，离心十分钟，取上清液。按苯酚硫酸法测定脉红螺多糖的浓度，分析提取温度对脉红螺多糖得率的影响。 3.4.3 提取时间 称取脉红螺干粉五分各 1g，按料液比 (W/V)1:80，在 70下分别水浴 15min、 30min、60min、 90min、 120min，然后置于高速离心机 3000r/min，离心 10min，取上清液。按苯酚硫酸法测定脉红螺多糖的浓度，分析提 取时间对脉红螺多糖得率的影响。 3.5 脉红螺多糖提取工艺的优化 通过单因素试验分析脉红螺多糖的最佳提取条件，在各个因素最佳值附近选取 3 个水平，
22、依据 L9(33)正交试验表进行设计，做三因素三水平正交实验，以确定福寿螺多糖提取的最优工艺。采用直观分析方法，根据极差大小和方差分析确定影响提取因素的主次顺序。 3.6 回收率实验 精确称取 5 份 1g 脉红螺干粉，按料液比 (W/V)1:100，在 50下水浴 1 小时，离心取上清液，分别取 1ml 蒸煮液定容到 100ml。从中各取 lml 定容后的蒸煮液于试管中，再分别 1ml加入浓度为 10g/ml、 20g/ml、 30g/ml、 40g/ml、 50g/ml 的葡萄糖 溶液，按照苯酚 -硫酸法，比照标准曲线求的其浓度，再计算回收率。 回收率（ %） =(测定的多糖含量值 样品多
23、糖含量 )/葡萄糖加入量 x100%22 3.7 重现性试验 取一组式样按多糖的测定方法操作，每隔 15 分钟测定一次吸光度，测定 2h。 4 结果与讨论 4.1 葡萄糖标准曲线的绘制 用苯酚一硫酸法显色，测定葡萄糖各浓度的吸光度，以吸光度为纵坐标，葡 萄糖浓度为纵坐标，绘制标准曲线，如图 1，曲线回 归方程： y=0.0594x +0.0227 R2=0.997。 脉红螺多糖提取工艺研究 7 葡萄糖标准曲线y = 0.0594x - 0.0227R2= 0.99700.050.10.150.20.250.30.350.40.450.50 1 2 3 4 5 6 7 8 9葡萄糖浓度（ g/m
24、L）吸光度(490nm)图 1 标准曲线及回归方程 Fig.1 Standard curve and regression equation 4.2 脉红螺光谱扫描最大吸收峰选择 经过苯酚 -硫酸法处理后的脉红螺 在 400-600 进行光谱扫描，由下图 2 可知脉红螺吸收峰在 490nm 处有最大值，故选择 490nm 处定量测定。 00.511.522.5400 450 500 550 600波长(nm )吸光度0.2ml0.4ml0.8ml1.2ml1.6ml图 2 脉红螺 400-600 波谱图 Wavespectrogram of Rapana venosa Valenciennes 4.3 脉红螺去色素与为去色素的对比 由下图 3 可知脉红螺经过活性炭处理和未处理，对脉红螺波谱图形状并没有太大改变。证明色素对脉红螺的含量测定没有明显影响。
