1、 本科毕业论文 （ 20 届） 酶解带鱼蛋白亚铁螯合多肽抗氧化性研究 所在学院 专业班级 食品科学与工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 1 目录 摘 要 . 1 Abstract . 2 1 前言 . 3 2 实验材料、主要仪器与试剂 . 3 2.1 实验材料 . 3 2.2 主要仪 器 . 3 2.3 主要试剂 . 3 3 实验方法 . 4 3.1 酶解及亚铁螯合工艺流程 . 4 3.2 羟自由基清除活性的测定 . 4 3.3 超氧阴离子自由基清除活性的测定 . 5 3.4 DPPH 自由基清除活性的测定 . 5 4 结果与分析 . 5 4.1 对羟自由基的清除作用 .
2、5 4.2 对超氧阴离子自由基的清除作用 . 6 4.3 对 DPPH 自由基的清 除作用 . 7 5 小结 . 8 5.1 带鱼酶解蛋白亚铁螯合多肽具有清除自由基的能力 . 8 5.2 未螯合酶解蛋白样液清除自由基能力很弱 . 8 参考文献 . 9 致谢 . 11 附录 英 文 翻译 12 附录 英 文 原文 25 2 1 摘要 用舟山带鱼下脚料为原料，利用碱性蛋白酶，木瓜蛋白酶和胰蛋白酶水解制备多肽亚铁螯合物，并对亚铁鳌合 物抗氧化活性及自由基活性进行了初步研究。本文从清除羟基自由基 ( OH)、 超氧阴离子 (O2- )和 1, 1-二苯基 -2-苦苯肼自由基 (DPPH)三个方面，探讨
3、纯化方法对亚铁鳌合物清除自由基活性的影响。以抗坏血酸为对照，利用分光光度法分别测定其清除自由基活性能力。结果显示：三种带鱼酶解蛋白螯合水解物的浓度越高，其清除自由基活性也越强，但在相同浓度范围内， Vc 的清除率远远大于三种带鱼酶解蛋白螯合水解物，未螯合的酶解蛋白样液没有明显的自由基清除作用。 关键词 带鱼下脚料；螯合物；抗氧化；清除；自由基 2 Study the antioxidation on compound enzymic peptides iron from the enzymolysis hairtail Abstract With the hairtail off-cuts a
4、s material, as original material,and use the hydrolyze of trypsin, papain, alcalase to make compound enzymic peptides iron,and give a original research of the activity of the antioxidation of compound enzymic peptides iron and radical reactivity.From the dumping of three aspects of OH, O2-,DPPHto st
5、udy the influence of the way of purofication did. According to the ascrobic acid,and measure the radical activity through the method of spectrophotometry. The result shows: the high density of the three kinds of the enzymolysis of compound enzymic peptides,the high ability of dumping the materials r
6、adical activity. But at the same density ,the dumping rate of vc is far better than the three kinds of the enzymolysis of compound enzymic peptides,and the uncompound enzymic peptides protain sample liquid has less obvious ability to clean up the radical reactivity. Key words Hairtail off-cuts;Chele
7、te substance;Antioxidation;Dumping; Radical reactivity 3 1 前言 带鱼又叫刀鱼、牙带鱼，是 鱼纲 鲈形目带鱼科动物是著名的一大海洋鱼类， 它拥有近百万吨 的 年产量。 带鱼运输及处理 的过程中会产生大量的废物， 大约有整体的 49%1。这些“ 废物 ” 含有丰富的蛋 白质，但由于使用的困难， 经常把它 放弃处理， 这往往使 蛋白质资源浪费 严重 。目前， 鱼类下脚料很多用来制成 鱼肝油，鱼酱 和 水解蛋白 等等 ， 这些不仅生产成本高，而且制作过程很繁杂 。 现如今对 氨基酸螯合铁和 多 肽 螯合铁的 研究，重点 放在动物 饲料 这边
8、2。有 报告显示 ： 多 肽 与 金属元素 络合后 ，体内的利用和吸收 率成倍的增加 3。然而，由于水解蛋白质与金属螯合理论研究程度 的 滞后，目前 一些 铁螯合 的 研究主要集中在氨基酸 类 螯合物 方面 。 在本文中以舟山带鱼的下脚料作为原料 ， 制取 带鱼酶解蛋白亚铁螯合多肽 ，并 对 它的 性质 进行了 初步 研究。 活性 氧 (ReactiveOxygen Species, ROS)是 具有活泼化学性质的产物 。 我们生物体系主要遇到的是氧自由基，例如超氧阴离子自由基 (O2- )、羟自由基 ( OH)、脂氧自由基、二氧化氮和 一氧化氮 自由基 ， 加上过氧化氢 (H2O2)、单线态
9、氧和臭氧，通称活性氧。在正常生理代谢 过程中 ，人体自身的抗氧化防御系统 足 以维持体内氧自由基的平衡 4，但过多的活性氧自由基就会有破坏行为，不足以维持自由基的平衡 5， 产生多余 的 自由基 导致人体正常细胞和组织的损坏，从而引起多种疾病。 如 心脏病、老年痴呆症、帕金森病 、 肿瘤 、 动脉粥样硬化等严重疾病 ， 严重加速老化过程 6。 由于化学合成的抗氧化剂存在毒副作用、致癌等安全 隐患 问题 7， 因此， 使用 天然抗氧化剂是减少细胞氧化损伤 、延缓 衰老 和 预防相关疾病最有效的 方法 8。有研究显示 人之所以会 老化、体力衰退、皮肤失去光泽及弹性，除了年龄是无法抗拒的因素外，主要
10、的即是体内自由基过多，年轻时体内有较好的中和系统来排除自由基，降低它所造成的伤害；然而随着年龄增长，人体修复自由基的能力也 随 之下降；若未能及时补充抗氧化物，细胞就开始损伤，疾病于是产生，越来越多的证据显示，体内自由基含量越高，寿命越短。现代医学研究表明，鱼类 中 包含了大量的抗氧化 活性 成分 9-14。因此，从鱼 类中 筛 从安全、高效的天然抗氧化剂成为国内外研究的热点。 2 实验材料、主要仪器与试剂 2.1 实验材料 带鱼：舟山兴业有限公司提供，经粉碎机粉碎后，直接分装成 200g/袋，置于 -20冰箱冷冻室保藏，使用时于前一夜取出置于冰箱冷藏室中过夜解冻。 2.2 主要仪器 仪器名称
11、 型号 厂家 电热恒温鼓风干燥箱 DGC-9140A 上海森信实验仪器有限公司 电热恒温水浴锅 HHS型 上海棱光技术有限公司 台式电子天平 TD3102 余姚金诺天平仪器有限公司 磁力搅拌器 Feb-90 上海爱朗仪器有限公司 紫外分光光度计 U/2800 日本日立有限公司 PH计 DECTA320A/C 梅特勒托利多公司 冷冻离心机 CR21G 日本日立有限公司 4 2.3 主要试剂 试剂（规格） 厂家 胰蛋白酶 (TyE) 国药集团化学试剂有限公司 木瓜蛋白酶 (PaE) 国药集团化学试剂有限公司 碱性蛋白酶 (AlE) 国药集团化学试剂有限公司 浓硫酸 国药集团化学试剂有限公司 苯酚
12、国药集团化学试剂有限公司 正丁醇 国药集团化学试剂有限公司 三氯甲烷 国药集团化学试剂有限公司 抗坏血酸 国药集团化学试剂有限公司 水杨酸 国药集团化学试剂有限公司 邻苯三酚 国药集团化学试剂有限公司 硫酸亚铁 国药集团化学试剂有限公司 盐酸 国药集团化学试剂有限公司 硫代巴比妥 国药集团化学试剂有限公司 EDTA 国药集团化学试剂有限公司 -脱氧核糖 国药集团化学试剂有限公司 Tris-HCL 国药集团化学试剂有限公司 DPPH 国药集团化学试剂有限公司 3 实验方法 3.1 酶解及亚铁螯合工艺流程 取过夜解冻的带鱼蛋白 10g 溶于 100mL 去离子水，然后用 6mol /L HCl 溶
13、液和 6mol /LNaOH 溶液调混合浆液 pH 值至 pH6.5， 40 下保温 10min，根据鱼糜质量按 20000U/g 比例加入木瓜蛋白酶，搅拌均匀，酶解 8h，在反应过程中，通过补充 0.5 mol /L 的 HCl来维持反应体系 pH 值为 6.50.1，反应结束后，测水解度 15，酶解 液经 90 加热 10min 钝化灭酶，于 4 下以 10000r /min 高速离心浓缩 20min，弃去上层油膜和残渣，留中间清液即 得带鱼蛋白酶解液， 旋转蒸发器 40 真空浓缩 ,冷冻干燥后即得带鱼蛋白酶解多肽 16，备用。 将上述酶解去沉淀后的水解液 用 0.5 mol /L 的 N
14、aOH 调节浆液 pH 值至 7.0， 按体积的 2%加入 1mol/L的 FeCl2,30 震荡合成 30min， 于 4 下以 10000 r /min 高速离心浓缩 20 min，弃去沉淀，上清液于旋转蒸发器 40 真空浓缩，冷冻干燥后即得多肽 -Fe2+17成品，备用。 带鱼下脚料酶解测水解度加入抗氧化剂 18按比例加入 FeCl2搅拌调节pH振荡合成真空浓缩冷冻干燥多肽 -Fe2+成品 注：螯合木瓜蛋白酶解液样品为 A；螯合碱性蛋白酶解液样品为 B；螯合胰蛋白酶解液样品为 C；未螯合木瓜蛋白酶液样品为 A1；未螯合碱性蛋白酶解液样品为 B1；未螯合胰蛋白酶解液样品为 C1。 3.2
15、羟自由基清除活性的测定 取三种亚铁螯合多肽分别配成 10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 80%、 100%5 浓度及 VC配成 1%、 2%、 3%、 4%、 6%、 8%、 10%浓度 备用。 取 0.2 mL 的 FeSO4-EDTA混合液 (10mmol/L)于具塞试管中 ,加入 0.2 mL 的 -脱氧核糖溶液 (20 mmol/L),然后再加入分别加入不同浓度 0.2 mL 测试样品 ,并用磷酸缓冲液(pH7.4)定容至 1.8mL,最后加入 0.2 mL 的 H2O2(10mmol/L), 37 水浴保温 1h 后加入2.8%的三氯乙酸 1mL 终止反应 ,
16、再加入 1%的硫代巴比妥 1mL,混匀后沸水浴中加热 10 min,冷却后稀释 5 倍， 532nm 处测光吸收值 As。不加样品 ,同上操作处理 ,测定对 比吸光值 Ac。样品的自由基清除能力 (ScavengingActivit SA)可表示为 : SA(% ) = (As-Ac) /As100。 3.3 超氧阴离子自由基清除活性的测定 取三种亚铁螯合多肽分别配成 10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 80%、 100%浓度 及 VC配成 1%、 2%、 3%、 4%、 6%、 8%、 10%浓度备用。 取邻苯三酚 0.1 mL 并加入 Tris-HCl（ pH 8.
17、2） 缓冲溶液 5mL 于试管中，加入不同不同浓度的水解液 0.25 mL,迅速混匀 ,25 水浴保温 15min 后 ,使用 1cm 比色皿 ,以蒸馏水做空白对照 ,在 320nm 处时测吸光度 Ai,并测定本底扣除水解自身的干扰 ,水解液对超氧阴离子自由基清除率按式 (1)计算。 清除率 :S=A0-(Ai-Aj)/A0100% 式中 : Ai 样液的吸光度值； A0 试剂空白的吸光度值； Aj 样液本底的吸光度值。 3.4 DPPH 自由基清除活性的测定 取三种亚铁螯合多肽分别配成 10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 80%、 100%浓度 及 VC配成 1%、
18、2%、 3%、 4%、 6%、 8%、 10%浓度备用。 将 1.5 mL DPPH 溶液 (0.1 mmol/L,溶于 95%乙醇 )置于试管中 ,加入 1.5mL 待测液(1.3 mL 蒸馏水 +0.2 mL 酶解液 ),振荡摇匀 ,室温放置 30 min 后 ,在 517 nm 处测定其吸光值 (Ai),空白为 1.5mL, 95%的乙醇加入 1.5mL 蒸馏水调零 ,对照为 1.5mL DPPH 自由基溶液加上 1.5 mL 蒸馏水在测定波长的吸光值 (Ac),酶解液在测定波长的吸光值为 Aj。酶解液对 DPPH 的自由基的清除能力用 R 表示 : R = 1-(Ai-Aj) /Ac1
19、00%。 4 结果与分析 4.1 对羟自由基的清除作用 羟自由基 19(OH)是一种氧化性很强的自由基，它可以使生物细胞大分子损伤，影响细胞的正常功能，可与生物体内的多种生物大分子产生作用，从而破坏它的原有功能，从而造成伤害。因此，清除羟自由基对维持机体正常的生理活动和抗衰老均具有重要的意义 20。 由表 1、图 3、图 4 可以看出 , 三种带鱼酶解蛋白未螯合水解物没有明显的羟自由基清除作用，而亚铁修饰后的螯合多肽对羟自由基的清除作用有明显的量效关系，随着6 螯合物浓度的升高呈上升趋势， 在样品浓度 10%30%的浓度范围内 ,其对羟自由基的清除率随着亚铁螯合多肽浓度的增加而近似线形地增加；
20、当酶解产物浓度为 60%时 , 木瓜酶解蛋白亚铁螯合多肽对羟自由基的清除率达 81.2%；当酶解产物浓度超过 60%时 ,清除率随浓度的增加变化不大。因此 , 木瓜解蛋白亚铁螯合多肽的清除羟自由基活性最强 ,胰蛋白亚铁螯合多肽的清除羟自由基活性最弱，但同样活性要和同浓度的 Vc 低的多，与 Vc 相比三种带鱼酶解蛋白亚铁螯合多肽对羟自由基的作用均较弱。呈现此现象一是 ,底物原料蛋白的不同造成生成的酶解产物各异；二是，亚铁螯合位点不 同使产物多肽的N-末端、 C-末端氨基酸组成及排列各异 ,这是影响产物肽功能活性的主要因素。 表 1 未螯合蛋白酶液样品对 OH 的清除率 样品浓度mg/mL 10
21、0 200 300 400 500 600 800 1000 A1清除率 % 12.3 21.0 20.4 18.5 15.7 28.2 26.5 23.1 B1清除率 % 12.4 27.4 23.5 28.5 29.4 20.6 22.5 28.9 C1清除率 % 17.4 9.5 18.5 22.5 27.8 21.6 19.8 22.8 图 1 Vc 对 OH 的清除作用 图 2 酶解蛋白亚铁螯合多肽对 OH 的清除作用 4.2 对超氧阴离子自由基的清除作用 氧在体内生成氧自由基时，产生的第一个自由基便是超氧阴离子自由基 21。高等动物吸收的氧气大部分倍线粒体电子 22传递还原成水。有
22、些酶如羟基乙酸酶可以把氧气直接还原成过氧化氢，也有少数酶如黄嘌呤脱氢酶可以把氧气还原成超氧阴离子自由基。此外体内其它一些生化反应过程如自氧化反应也会产生超氧阴离子自由基。它本身不仅具有毒性，还可通过 一系列的生化反应生成其它氧自由基。 超氧阴离子自由基 ( O2-) 是一种重要的活性氧粒子 , 它是有氧代谢等生命活动过程不断产生的中间产物 , 适当量的活性氧自由基粒子的存在有利于维持机体免疫应答 , 而过量的活性氧自由基存在则会对生物机体产生毒害作用 23, 生物体的衰老及许多疾病的发生都与活性氧粒子有直接的关系。超氧阴离子自由基 O2-能促进脂肪氧化，促进生物体衰老，诱发炎症和肿瘤。邻苯三酚
23、自氧化法是测定清除 O2-活性的常用方法。邻苯三酚在碱性条件下发生自氧化释放 O2-，并生成有色中间产物，当有抑制剂 存在时，可清除O2-，从而阻止中间产物的积累，所以可通过比色法来检测有色中间产物的含量 24，以检验物质清除 O2-的能力。 7 表 2 未螯合蛋白酶液样品对 O2- 的清除率 样品浓度mg/mL 100 200 300 400 500 600 800 1000 A1清除率 % 8.4 9.3 11.4 20.4 18.6 19.6 16.4 22.5 B1清除率 % 15.4 17.5 27.5 30.1 32.6 28.7 23.3 29.9 C1清除率 % 8.3 16.
24、1 8.5 7.8 6.7 8.3 9.8 16.8 图 3 Vc对 O2-的清除作用 图 4 酶解蛋白亚铁螯合多肽对 O2-的清除作用 由表 2可知 , 同样三种带鱼酶解蛋白未螯合水解物没有明显的超氧阴离子自由基清除作用。由表 图 3、图 4可知亚铁修饰后的螯合多肽对超氧阴离子自由基呈现不同能力的清除作用，但作用相对较弱，相同浓度范围内的 Vc对超氧阴离子自由基清除率在浓度 1%（ 10mg/mL） 时达 79. 09%,浓度高于 10 mg/mL时清除率均在 80%以上，而木瓜酶解蛋白亚铁螯合多肽浓度达 100mg/mL时 ,对超氧 阴离子自由基清除率只达到 32.7%，木瓜酶解蛋白亚铁螯
25、合多肽对超氧阴离子自由基清除率是三种酶中最高的，这表明三种带鱼酶解蛋白亚铁螯合多肽对超氧阴离子自由基的作用均较弱。 4.3 对 DPPH 自由基的清除作用 二苯基苦味酰基自由基 (DPPH自由基 )25是一种人工合成的稳定自由基 ,其甲醇溶液呈紫色 ,在 517nm处有最大吸收。当有自由基清除剂存在时， DPPH的单电子由于被配对 DPPH浓度减小而使其颜色变浅，在 517 nm波长处的吸光度值变小。该方法 26测定简便、快速、重现性好 ,被广泛用于评价天然产物的 自由基清除活性。在乙醇溶液中呈深紫色 ,在 517nm处有最大吸收峰 , 尽管 DPPH自由基并非人体内产生的自由基，但此法仍能有
26、效评价物质的抗氧化性，因此自 Blois将其运用于抗氧化剂的研究，该法也广泛用于清除自由基的研究，本实验用的是正是该方法。图 5、图 6为三种带鱼酶解蛋白未螯合水解物与 VC对 DPPH自由基的清除作用。由表 3可知，未螯合的酶解物没有明显的 DPPH自由基的清除作用 , 而酶解蛋白亚铁螯合多肽 DPPH自由基清除作用较明显，其中碱性酶解蛋白亚铁螯合多肽 DPPH自由基清除作用最强，胰酶解蛋白亚铁螯合多肽 DPPH自由基清除作用最弱。在酶解液浓度在 10%40%时其对 DPPH自由基的清除作用大幅增强 ,在40%浓度时碱性酶解蛋白亚铁螯合多肽清除率为 71.3%,与其它几组亚铁螯合多肽 DPPH自由基清除作用相比要强，但还是远远低于相同浓度 Vc对 DPPH自由基的清除作用，说明 Vc对 DPPH自由基的清除作用很强，是现今所用抗氧化剂能力较强的一种。 表 3 未螯合蛋白酶液样品对 DPPH的清除率
