1、 本科毕业论文 （ 20 届） 酶解碎金枪鱼肉的工艺研究 所在学院 专业班级 食品科学与工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 目录 摘 要 . 1 ABSTRACT . 2 1 前言 . 3 1.1 金枪鱼的研究概论 . 3 1.2 金枪鱼营养价值 . 4 1.3 金枪鱼资源的开发现状 . 5 1.4 金枪鱼下脚料综合利用的研究进展 . . 5 1.5 蛋白质水解度的测定方法 . 6 2 实验材料、主要仪器与试剂 . 6 2.1 实验材料 . 6 2.2 主要仪器 . 6 2.3 主要试剂 . 6 3 实验方法 . 7 3.1 分析方法 . 7 3.2 金枪鱼下脚料酶解工艺流
2、程 . 7 4 结果与分析 . 7 4.1 原料预处理 . 7 4.2 酶解最佳工艺的确定 . 8 5 小结 . 12 参考文献 .13 致谢 . 15 附录英文翻译 . 16 附录英文原文 . 22 1 摘要 本文以金枪鱼下脚料为原料， 采用多种 酶 复合的方 法 ，对碎金枪鱼肉 的酶解工艺进行研究，同时确定酶解碎金枪鱼肉的最佳工艺。研究酶种的选择、加酶量、温度、 pH和 酶解时间对酶解的影响。得到结论： 以水解度为指标，筛选出水解金枪鱼碎肉蛋白效果较好的两种酶为胰蛋白酶和木瓜蛋白酶。以这两种酶组成双酶反应体系，经正交试验得到金枪鱼碎肉蛋白最佳水解条件为：反应温度 45 、反应时间 6h、胰
3、蛋白酶添加量15000U/g、木瓜蛋白酶添加量为 45000U/g、体系 pH 为 7.0。在此条件下，金枪鱼肉水解度可以达到 15.83%。 关键词 金枪鱼 ； 蛋白酶 ； 酶解 2 Study on Hydrolyzing of Tuna Meat Protein with Compound Proteases Abstract In this paper, tuna scraps was prepared by the multiple enzymes composite methods of enzymatic hydrolysis of tuna meat research. Mea
4、nwhile determine enzyme solution the best technology of broken tuna meat. Study on the selection of enzymes, add enzyme content, temperature, pH, enzymatic hydrolysis time influence. Draw enzymolysing optimal processing parameters: Two enzymes as trypsin and papain were chosed because of their high
5、degree of hydrolysis to tuna meat protein.In the two enzymes reaction system, the optimum hydrolysis conditions of tuna meat protein confirmed by orthogonal test were as follows: reaction temperature was 45 , reaction time was 6h, the amount of trypsin added was 15000U / g while adding amount of pap
6、ain was 45000U/g, pH of reaction was 7.0.Under these conditions, the degree of hydrolysis of tuna meat can reach 15.83%. Key words Tuna; Proteinase; Enzyme hydrolysis 3 1 前言 近年来，随着世界人口的不 断增长，陆地资源的日益短缺和人类对海洋科学研究的深入，人类认识到了海洋资源对人类生存和发展的重要性，逐步开始增大了对海洋资源开发的规模和力度。但由于人类对海洋资源的过度利用，以及近年来全球气候变暖的各项不利条件，造成了海洋资源
7、的极度短缺，从而制约了海洋资源的发展。 资源的短缺，使得人类开始投入一部分精力到海洋资源的综合利用。使得海洋资源发挥出其最大的作用。我国金枪鱼资源也是如此。 中国大陆自 20 世纪 80 年代中期开始开发了远洋金枪鱼渔业。随着捕捞渔船数量、捕捞技术设备和船队管理水平等方面的了长足的进步， 我国金枪鱼产业呈现出欣欣向荣的景象。但从近几年的数据来看，我国在太平洋，大西洋，印度洋等流域的捕捞量和捕捞种类呈逐年下降的趋势。 我国的金枪鱼主要用于罐头和生鱼片产业，金枪鱼属于红肉鱼，从而造成了利用率不高的问题。而我国下脚料的利用方面处于落后状态，基本用于鱼粉加工，利用价值不高。而利用蛋白酶对鱼肉进行水解，
8、提取出水解蛋白，可以提高金枪鱼的利用率和经济价值。 本文研究的目的是通过以金枪鱼下脚料为原料，经过不断地研究分析，获得高附加值、高纯度的鱼制品，不但满足消费者的新时代生活消费，而且 为 远洋渔业和 加工 业的发展提供基本依据， 以此扩大金枪鱼的使用价值，进一步开阔金枪鱼的市场空间。 1.1 金枪鱼的研究概论 金枪鱼类，又叫鲔鱼、吞拿鱼，英文名为 Tuna，是硬骨鱼纲 (Osteichthyes)鲈形目(Pereiformes)鲭科 (Scombridae)鱼类中具有胸甲 (指胸区和侧线前部明显扩大的鳞片 )几个属鱼类的总称 1，从生物学的分类上讲，广义的金枪鱼是指鱼类中的鲭科、箭鱼科和旗鱼科共
9、计约 30 种鱼类，常见的金枪鱼类有 4 个属， 13 个种，主要的经济种类包括蓝鳍金枪鱼 (Thunnus thynnus)、马苏金枪鱼 (Thunnus maccoyii)、大眼金枪鱼 (Thunnus obesus)、黄鳍金枪鱼 (Thunnus albacares)、长鳍金枪鱼 (Thunnus alalunga)、鲣鱼 (Eleotridae)等 6 种 。 金枪鱼 体呈纺锤形， 具有鱼雷体形， 向后渐细尖而尾基细长， 尾鳍 叉状或新月形 ，尾柄两侧有明显的稜脊，背、臀鳍后方各有一行小鳍，肩部有由扩大之鳞片组成的胸甲，体长最大可以达到 4 米，重 800 公斤。 由于 金枪鱼的鳃肌已
10、退化，因此必须不停地游动，使新鲜水流流过鳃部以获取氧气。金枪鱼若停止游动，则会因缺氧窒息而死 亡。为了 适于快速游泳， 金枪鱼的 鳞退化为小圆鳞，皮下密布血管网，肌肉中富含以血红素为主的红色蛋白质，为金枪鱼的持续游动供氧， 一般时速为每小时 30-50 公里，最高时速可达每小时 160 公里 。 肌肉的收缩力量使它们体温升高，比周围水温高出 9 。 沿金枪鱼脊柱两侧强有力的肌肉和皮肤上大量的血管网丛 表明它们有特别旺盛的新陈代谢能力， 金枪鱼的这种活动特点使其肉质柔嫩鲜美， 鱼肉似紫红色的牛肉，有很高的血红素含量，低脂而高强蛋白， 脂肪含量只有 0.5%，而蛋白含量高达 24.8%，背部肌肉呈
11、红色，称为“ 赤身 ” ，是制作生鱼片和金枪鱼罐 头的主要采集部位，腹部含有少量的脂肪。 金枪鱼主要分布于低中纬度海区，如太平洋、大西洋和印度洋的热带、亚热带和温带广阔水域，为高度跨洋性的洄游鱼类 23。科学研究表明 ， 大多数金枪鱼生活在水深100400 米的海域，大眼金枪鱼、黄鳍金枪鱼和鲣鱼的幼鱼生活在海洋表层水域，一般不超过 50 米水深，而成鱼栖息水层比较深。大西洋金枪鱼超过总渔获量 10%的主要种4 类是黄鳍金枪鱼 (28%)、鲣鱼 (22%)、长鳍金枪鱼 (15%)、大眼金枪鱼 (11%)4。 根据 FAO（联合国粮农组织）统计，中西太平洋金枪鱼渔获量占世界金 枪鱼总产量的 48%
12、，主要包括鲣鱼、黄鳍金枪鱼、大目金枪鱼、长鳍金枪鱼四种 5。 东太平洋的主要金枪鱼种类包括大眼金枪鱼、黄鳍金枪鱼、鲣鱼、长鳍金枪鱼和蓝鳍金枪鱼五种，其中以黄鳍金枪鱼最多，其次为鲣鱼，再次为大眼金枪鱼 6。 印度洋是全球金枪鱼渔业的重要捕捞区域之一，近年来印度洋主要金枪鱼种（包括大眼金枪鱼，黄鳍金枪鱼，长鳍金枪鱼和鲣鱼）年平均渔获量超百万吨，占全球金枪鱼总产量的四分之一以上 7。 1.2 金枪鱼营养价值 金枪鱼作为一种深海鱼类，素来以营养价值高、纯天然、无污染而享誉国际市场并有 “ 海 洋黄金 ” 、 “ 海底鸡 ” 的美称 89。下表为金枪鱼与其他鱼肉类营养成分的比较 10，从表 1 可以看出
13、，金枪鱼的 DHA、 EPA 含量远高于其他六种鱼类，每 100g 鱼肉的脂肪酸含量高达 20.12%；表 2 显示，金枪鱼肉与人们通常食用的牛肉、鸡肉、猪肉相比，除了自身特有的成分之外，其热量和脂肪含量均低于其他肉类，而蛋白质含量高居首位 ，铁含量仅次于牛肉，维生素 E 的含量是仅次于它的肌肉的 12 倍多，营养价值显著。 表 1 主要食用鱼类脂肪酸含量（以 100g 计） 名称 金枪鱼 秋刀鱼 鳝鱼 沙丁鱼 鲑鱼 竹荚鱼 鲤鱼 DHA(mg) 2877 1398 1332 1136 820 748 288 EPA(mg) 1972 844 742 1381 492 408 159 脂肪酸
14、(g) 20.12 13.19 19.03 10.62 6.31 5.18 4.97 表 2 金枪鱼与日常食用肉类营养成分比较（以 100g 计） 营养成分 品类 单位 金枪鱼 去油牛肉 去皮鸡胸肉 猪腰肉精肉 一般成分 热量 ECAI 108 172 185 134 蛋白质 g 24.8 21.6 21.3 21.5 脂肪 g 0.5 8.4 10.1 4.5 矿物质 钙 mg 2 4 5 6 铁 mg 10 26 0.4 0.4 维生素 A IU 20 17 170 17 B2 mg 0.15 0.17 0.09 0.21 E mg 3180 70 250 0 特殊成分 EPA mg 15
15、9 0 0 0 DHA mg 640 0 0 0 牛磺酸 mg 127 49 14 51 现代研究已经证实，金枪鱼对人体具有多种营养功效：（ 1）金枪鱼低脂、低热量、高蛋白，生物价高达 9011，是现代女性轻松减 肥的理想选择。（ 2）金枪鱼中 的 DHA、EPA 含量居各种食物之首。其中， DHA 是大脑神经和视神经不可缺少的组成物质，能促进青少年的大脑发育、改善记忆力、提高学习能力和预防老年痴呆症，有益妇女的瘦身美容，还能补充妇女妊娠期的营养 。 而 EPA 则可以降低血脂，减少血液中的恶性胆固醇，增加良性胆固醇 , 疏通血管，有效防止动脉硬化和胆固醇含量高所引起的疾病。此外， DHA 和
16、 EPA 还有助于肝细胞的再生，帮助保护肝细胞，降低肝脏疾病的发病率。（ 3）经常食用金枪鱼可以清除体内多余的盐分，平衡体内水分含量，保持标准的水分5 指标。（ 4）金枪鱼血液中含有丰富的铁和维生素 B12等，易被人体吸收，经常食用，可预防贫血 ，还可以 作为贫血的辅助治疗食品 。 （ 5）金枪鱼富含蛋氨酸、胱氨酸等人体必需的 8 种蛋白质氨基酸和牛磺酸，使人们在享用美食的同时，还可以通过非药物手段补充氨基酸成分。牛磺酸则可以抑制交感神经兴奋，降低血压和胆固醇，防止动脉硬化，促进胰岛素的分泌，提高肝脏的排毒作用。 1.3 金枪鱼资源的开发现状 金枪鱼类总产量比较稳定，其中太平洋和印度洋的产量稳
17、中有升。据联合国粮农组织统计， 2004 年，世界大洋性渔业总产量为 850 万吨，而金枪鱼产量超过 600 万吨，占公海渔业总产量 70%以上，是世界远洋渔业重要的捕捞鱼类之一 12。金枪鱼渔获量占世界总渔获量 4%左右，但贸易额却占世界水产品贸易额 10%以上，其中鲜、冷冻金枪鱼占 7%、罐头金枪鱼占 3%。金枪鱼渔业，是当前世界远洋渔业的典型代表，在远洋渔业中占据举足轻重的地位。 蓝鳍金枪鱼、马苏金枪鱼、大眼金枪鱼、黄鳍金枪鱼因其营养价值较高，常被作为生鱼片的原料鱼，而素有 “ 金枪鱼之王 ” 的蓝鳍金枪鱼更是生鱼片的上选原料 13。长鳍金枪鱼和鲣鱼主要用来做金枪鱼罐头原料，但是，最近也
18、用长鳍金枪鱼来做生鱼片。黄鳍金 枪鱼、大眼金枪鱼、长鳍金枪鱼为延绳钓的主捕对象，鲣鱼为杆钓的主要对象。 目前，世界上有 70 多个国家和地区从事金枪鱼的捕捞生产，主要有日本、中国台湾省、韩国、美国、菲律宾、西班牙和印度尼西亚等，其产量约占世界金枪鱼总产量的70%。近年来，世界主要经济种类的金枪鱼年产量维持在 350400 万吨水平，产值达 300亿美元之多 14。 1.4 金枪鱼下脚料综合利用的研究进展 随着金枪鱼加工业的发展，金枪鱼功能食品的开发也逐渐兴起，这主要是因为金枪鱼的主要加工部位为鱼肉，产品以生鱼片和金枪鱼罐头为主，而对于鱼头、鱼皮 、鱼骨、内脏和碎肉等，则作为下脚料处理。而这些下
19、脚料大约占总重量的 5070%。研究表明，金枪鱼头眼窝中 DHA 的含量高达 30%40%，而 EPA 含量在 5%10%左右，是典型的“ DHA 高含量油 ” 15。国内有学者采用蛋白酶解法从黄鳍金枪鱼眼窝中提取鱼油，最终使鱼油中 DHA、 EPA 含量分别达到 23.63%和 4.84%，不饱和脂肪酸总含量达到38.47%16。 Jin-Wook Woo 等 1 7采用响应面法优化了从黄鳍金枪鱼背部皮肤中提取胶原蛋白的工艺，胶原蛋白的浓度最高可以达到 27.1%。胶原蛋白在皮革、 化妆品、食品、膜工业、制药业、生物医学材料等方面应用广泛。 Jae-Young Je 等 18考察了碱性蛋白酶
20、、凝乳蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶水解金枪鱼脊椎骨蛋白制备抗氧化活性肽的情况，其中中性蛋白酶的水解率最高，但胃蛋白酶的水解产物的清除自由基能力优于其他几种蛋白酶的水解产物，经色谱和质谱分离出的抗氧化活性肽对脂肪的氧化有显著的抑制作用，并能很好地清除 DPPH 自由基、羟自由基和超氧自由基。鱼骨是金枪鱼下脚料中的一个重要的组成部分，其中的蛋白含量大约占鱼体总蛋白含量的 30%。 Zhenyu Li 等 19采用截留分子量为 30kDa 的超滤膜从黄鳍金枪鱼脾脏中分离出了胃蛋白酶、胰岛素和胰凝乳蛋白酶，可用于制备酶制剂。金枪鱼在加工过程中产生大量碎肉，常被加工成鱼粉饲料，利用
21、价值较低。现代研究表明，采用蛋白酶对水产蛋白6 进行水解，往往可以获得一些具有特殊生理功能的活性肽。 Hui-Chun Wu 等 20采用一种商业蛋白酶 N 对鲭鱼蛋白进行水解并与自溶反应进行比较，发现酶解可以产生更多的游离氨基酸、肌肽等活性多肽，且这些活性肽对脂质的过氧化反应有明显的抑制作用，并对 DPPH 自由基有较好的清除能力。 1.5 蛋白质水解度的测定方法 21 蛋白酶对蛋白质的酶解作用是通过水解肽键实现的。衡量蛋白酶的水解效果或蛋白质的水解程度的一个重要指标是水解度（ Degree of hydrolysis, DH）代表蛋白质在水解过程中，肽键被裂解的程度或百分比。国内外，测定水
22、解度的方法很多，主要包括 pH- state 法 22、三硝基苯磺酸（ Trinitrobenzenesulfonic Acid, TNBS）法 23-25、邻苯二甲醛（ Ortho-phthalaldehyde, OPA）法 24、水合茚三酮（ ninhydrin）法 25、甲醛滴定法 26，此外，还有凝固点降低法和水溶性蛋白质的测定法。 2 实验材料、主要仪器与试剂 2.1 实验材料 金枪鱼碎肉，由浙江省远洋渔业集团公司宁波丰盛食品有限公司提供。 2.2 主要仪器 名称 型号 厂家 均质器 JZ- 型 铁道部电化院四方电器设备厂 电热恒温水箱表 CU420 型 上海益恒 实验仪器有限公司
23、电脑微波催化合成 /萃取仪 XH-100A 型 北京祥鹄科技发展有限公司 电热恒温鼓风干燥箱 HHG-9008 型 上海慧泰仪器制造有限公司 半微量定氮蒸馏器 SY.50-BWL 型 北京卓川电子科技有限公司 定氮消化炉 KDN-04 型 上海嘉定粮油仪器有限公司 精密酸度计 PHS-3C 型 上海精密科学仪器有限公司 恒温磁力搅拌器 JB-2 上海雷磁新泾仪器有限公司 高温鼓风干燥箱 HHG-9008 型 上海慧泰仪器制造有限公司 精密电子天平 BSA 124S 型 Sartorius 公司 低速冷冻离心机 CR21G 型 日本日立公司 恒温水浴锅 HH-8 江苏省金坛 市环宇科学仪器厂 2
24、.3 主要试剂 名称 规格 厂家 氢氧化钠 分析纯 A.R 南京化学试剂有限公司 次甲基蓝 分析纯 A.R 国药集团化学试剂有限公司 溴甲酚绿 Ind 国药集团化学试剂有限公司 无水乙醇 分析纯 A.R 国药集团化学试剂有限公司 甲基红 分析纯 A.R 国药集团化学试剂有限公司 硫酸钾 分析纯 A.R 国药集团化学试剂有限公司 7 浓硫酸 分析纯 A.R 国药集团化学试剂有限公司 硫酸铜 分析纯 A.R 国药集团化学试剂有限公司 硼酸 分析纯 A.R 国药集团化学试剂有限公司 异丙醇 分析纯 A.R 国药集团化学试剂有限公司 酚酞 Ind 国药集团化学试剂有限公司 胰蛋白酶 250 万 U/g
25、 国药集团化学试剂有限公司 木瓜蛋白酶 80 万 U/g 国药集团化学试剂有限公司 中性蛋 白酶 80 万 U/g 国药集团化学试剂有限公司 碱性蛋白酶 20 万 U/g 国药集团化学试剂有限公司 甲醛溶液 分析纯 A.R 国药集团化学试剂有限公司 浓盐酸 分析纯 A.R 南京化学试剂有限公司 百里酚酞 分析纯 A.R 国药集团化学试剂有限公司 3 实验方法 3.1 分析方法 3.1.1 蛋白质含量的测定 27,28：微量凯氏定氮法 X= C （ V1 -V2） 14.01 F/w 1000 100% C：盐酸标准液的浓度（ mol/L） V1： 滴定样品消耗的盐酸量（ mL） V2： 滴定空
26、白消耗的盐酸量（ mL） 14.01：氮的摩尔质量 F：氮换算为蛋白质的系数 w：样品的质量（ g） X：蛋白质含量（ %） 3.1.2 水解度测定 DH (%) =n100%/N n： 水解的肽键数 （ molg-1） N： 总肽键数 （ molg-1） 3.2 金枪鱼下脚料 酶解工艺流程 原料蛋白 （ 金枪鱼加工下脚料） 预处理 酶解 灭酶 分离 水解度测定 4 结果与分析 4.1 原料预处理 4.1.1 原料预处理方法： （ 1）直接烘干 ： 将金枪鱼碎肉 50g 解冻，加水 100mL，置于均质器中， 12000rpm搅拌，制成匀浆，于 105 烘干至粉状。 （ 2）脱脂干燥 ： 将金
27、枪鱼碎肉 50g 解冻，加水 100mL，置于均质器中， 12000rpm搅拌，制成匀浆。向匀浆中添加等体积的异丙醇，于 50 下脱脂 1.5h。脱脂后的鱼肉经真空抽滤去除异丙醇后，于 105 烘干至粉状。 （ 3）脱脂干燥后微波处理 ： 将 金枪鱼碎肉 50g 解冻、经脱脂干燥成粉状，设定微波萃取仪功率为 500W，温度 50 ，对鱼肉干粉进行微波处理 10min。 8 4.1.2 结果 分别各取一份按 4.1.1 的方法处理过的鱼肉干粉 15g，均按 1:3 的质量比加水制成匀浆液。向三份匀浆液中按 15000U/g 的用量添加胰蛋白酶，于 pH7.5、 45 下水解 6h，结果如表 3
28、所示。 表 3 不同预处理方式对水解率的影响 预处理方式 直接干燥 脱脂干燥 脱脂干燥 +微波 DH/% 3.71 6.67 8.98 原料蛋白不经脱脂和微波预处理时，其水解率很低（ 3.71%）。对原料进行脱脂处理后，水解率提高了 79.78%；进一步对脱脂鱼肉蛋白进行微波处理，最终水解率提高到原来的 2.4 倍。这是因为鱼肉脂肪与鱼肉蛋白结合较紧密，胰蛋白酶的最佳水解位点被脂肪遮掩，影响了蛋白酶水解能力的发挥，经异丙醇处理后，脂肪层被溶解，暴露了蛋白质的水解位点，使水解率提高；而微波可以破坏蛋白质的空间结构，使蛋白质分子由蜷曲状态变为舒展，利于蛋白质的水解。因此，本实验确定先对原料进行脱脂
29、和微波处理后，再进行后续操作。 4.2 酶解最佳工艺的 确定 以水解度（ DH）为考察指标，从胰蛋白酶、木瓜蛋白 酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶中筛选出两种水解度最大的酶作为水解用酶，考察酶添加量、酶解温度、 pH、酶解反应时间对酶解效果的影响，同时对两种酶的添加方式对水解效果的影响进行研究。在此基础上，采用正交试验确定最优化的酶解条件。 4.2.1 酶种的选择 取 四份经预处理后的鱼肉干粉各 15g，均按 1:3 的质量比加水制成匀浆液 100mL，分别用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶水解 6 小时，酶用量均为 15000U/g，pH 和温度为各商品酶的最适条件。酶解液采用加热灭酶
30、法，即将酶解液置于水浴中加热处理 10min。为使灭酶充分，加热过程中可以适当振荡。灭酶结束后，进行真空抽滤，收集滤液，测定被水解的肽键数，计算鱼肉蛋白的水解度，结果如表 4 所示。 表 4 不同蛋白酶酶解效果比较 酶种 反应条件 水解率（ DH） /% 温度 / pH 加酶量 /U/g 胰蛋白酶 45-50 7.5 15000 9.15 木瓜蛋白酶 50-55 6.5 15000 8.22 中性蛋白酶 50 7.0 15000 7.37 碱性蛋白酶 50 8.0 15000 6.50 由 表 4 可知，在加酶量相同的条件下，四种蛋白酶的水 解效果按由强到弱的顺序排列为：胰蛋白酶 木瓜蛋白酶 中性蛋白酶 碱性蛋白酶。因此，选择胰蛋白酶和木瓜蛋白酶作为双酶水解用酶，并对影响水解效果的因子进行考察。 4.2.2 单因素实验 4.2.2.1 酶添加量对水解效果的影响
