1、 本科毕业论文 （ 20 届） 魔芋低聚糖对 ACD 小鼠皮肤内 微血管 的影响 所在学院 专业班级 食品科学与工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 目 录 摘要 .1 Abstract .2 1 前言 .3 1.1 接触性皮炎的研究进展 .3 1.2 魔芋葡甘聚糖免疫调节作用研究进展 .3 2 实验材料、主要仪器与试剂 .7 2.1 实验材料 .7 2.2 主要仪器 .7 2.3 实验试剂 .7 3 实验方法 .8 3.1 实验动物饲养及分组 .8 3.2 ACD 小鼠模型制造 .8 3.3 降解魔芋葡甘聚糖制备 .8 3.4 给药方法 .9 3.5 取材 .9 3.6 检
2、测 .9 4 实验结果与讨论 .11 4.1 魔芋葡甘低聚糖对 ACD 小鼠 体重的影响 .11 4.2 魔芋葡甘低聚糖对 ACD 小鼠行为影响 .12 4.3 魔芋葡甘低聚糖对 ACD 小鼠脾脏的影响 .12 4.4 魔芋葡甘低聚糖对 ACD 小鼠对微细血管的影响 .12 5 小结 .14 1 摘要 研究降解魔芋多糖（ DAKP）对 2， 4 一二硝基氯苯 (DNCB)致小鼠急性过敏性皮炎（ ACD）皮肤微血管的影响。方法将 DNCB 诱导的急性 ACD 小鼠随机分成 5 组，空白组，模型组，低、中、高剂量 DAKP 组，每天分别灌胃给予蒸馏水、 DAKP 2.0、3.0、 4.0 g/(k
3、g d)，连续 5w，每周称重一次。在实验末留取过敏性皮炎处皮肤做病理组织学检查。结果： DAKP 能明显缓解 ACD 小鼠症状， 中 、高剂量组 CD34+微血管数显著性低于模型组。 关键词 降解魔芋多糖（ DAKP）； ACD 小鼠；微细血管；免疫调节 2 Konjac oligosaccharide to ACD Imperceptible blood-vessel in mice within the influence of skin Abstract Degradation of konjac of polysaccharide (DAKP) or two of 2,4 dinit
4、rochlorobenzene (DNCB) induced acute allergic dermatitis (ACD) skin micrDNCBscular. Methods DNCB induced acute ACD mice were randomly divided into 5 groups, control group, model group, low, medium and high dose DAKP group given distilled water were administered daily, DAKP 2.0,3.0,4.0 g / (kg d) Con
5、tinuous 5w, once a week, weighing. At the end of the experiment specimens from the skin of atopic dermatitis at the pathological examination.Results: DAKP can relieve symptoms of ACD in mice; medium and high dose groups of two the number of mast cells was significantly lower than the model group, an
6、d almost no accumulation and mast cell degranulation. Results: DAKP can significantly ease symptoms, and mice ACD high-dosage groups CD34 + micrDNCBscular several significant below model group. Key words Degradation of konjac polysaccharide (DAKP); ACD mice; Imperceptible blood-vessel; immune regula
7、tion 3 1 前言 1.1 接触性皮炎的研究进展 接触性皮炎 （ contact dermatitis， CD） ，是皮肤或粘膜暴露于单个或多个外源物质后在接触面或者其他部位出现炎症，又被称为环境和职业性皮肤炎 1-4。它是目前医学研究的一项重要项目，所涉及的领 域有临床医学、免疫学、皮肤病学、生理学、生物化学、化学工业、化妆品工业、食品和等。其表现主要有：丘疹、肿胀、水疮、红斑、剥脱性皮炎 1。根据其病因、发病机制、临床表现，至少可将接触性皮炎分为 6 种： 1、过敏性接触性皮炎； 2、皮肤原发要刺激； 3、速发型接触反应； 4、外原性光毒性反应及光变态反应； 5、非湿疹样接触性反应；
8、6、系统性接触性反应。 随着经济的发展，职业和环境中越来越多的致病因素暴露出来，导致许多新型的接触性皮炎的产生，已严重影响生产和人民健康。正因它与人们的工作生活密切相关，所以已成为当今医学研究领 域的热点。 根据相关数据显示，美国每年用于接触性皮炎方面的费用至少达 200 万 10 亿美元，主要用于生产、医疗及赔偿的花费 2。从近几年有关接触性皮炎的研究中可以知道：CD 尤其是 ACD，是一类主要由 T 细胞及其细胞因子功能失衡所引起的一种变态反应性疾病，它是在多基因遗传背景和环境因素作用下所发生的 8-11。有关研究显示： ACD 的发病机理不再是以往典型的 IV 型变态反应，它的效应细胞可
9、以为 CD8+ST 也可以是CD4+T 的 Th2 亚类。在某些 ACD 发生过程中 B 细胞也会起重要作用 1，其发病机理和异位性皮炎 （ atopic dermatitis,AD） 以及湿疹 （ cczmea） 存在着某些内在的相关性 4-8。因此，为寻找更有效的预防和治疗手段，对 ACD 进行研究十分有必要，这还对免疫学干预治疗具有重要的理论和实际意义。 1.2 魔芋葡甘聚糖免疫调节作用研究进展 魔芋 (Amorphophallus konjac)为天南星科魔芋属的多年生草本植物。它既可内服，也可外用，具有治疗咳嗽、气喘、疝气、乳房疼痛、烧伤以及血液和皮肤疾病的功效 12。魔芋的块茎中中
10、含丰富的葡甘聚糖 （ Konjae Glucomannan, KGM） ，常用于 中医药中，具有较高的药用、食用价值。 KGM 是由含 D-葡萄糖和 D-甘露糖结合的复合多糖。据现代研究表明： KGM 具有抗衰老、调节胃肠道、降血脂、减肥、降血糖、抗肿瘤和调节免疫等诸多功效。在美国和欧洲，纯化的魔芋粉已在食品添加剂和食品补充剂中推出使用13。 对于 KGM 的研究一直是研究的热点。前人研究发现，免疫活性在 KGM 众多生物学活性中是最为重要的。作为一种免疫调节剂，可被应用于肿瘤、病毒感染及超敏反应性疾病的临床治疗 14,15。魔芋葡甘聚糖不仅能激活 T 细胞、 B 细胞、巨噬细胞等免疫细胞，还
11、能调节体内白细胞 介素 -1（ IL-1） 、白细胞介素 -2（ IL-2） 、肿瘤坏死因子（ TNF）、干扰素 -（ IFN-） 等细胞因子的生成，活化补体等，从而增强机体免疫系统功能，在抗变态反应性疾病、抗肿瘤等多方面发挥重要的调节作用 13-15。 1.2.1 对免疫器官的影响 免疫器官是执行机体免疫功能的组织结构，也是淋巴细胞和其他免疫细胞发生、分化成熟、定居和增殖以及产生免疫应答的场所，其发育状况直接影响到机体的免疫力。4 按功能不同，可分为中枢免疫器官 （ 胸腺、腔上囊等 ） 和外周免疫器官 （ 脾脏、淋巴结等 ） 。 对胸腺、脾脏的重量及脾脏细胞的增生方面 的影响是 KGM 对免
12、疫器官发育的影响的主要表现。王玲等 16通过实验证实魔芋精粉（ AKP）对胸腺指数和脾指数具有增高作用，可明显促进小鼠免疫功能。 Wang17报道，剂量在 0.3 50 g/mL 之间分子量大于 10kDa的 KGM 酸降解物可显著促进小鼠脾脏细胞的增生，具有增强初级免疫反应的能力。由此可见， KGM 可以促进正常和免疫低下的动物免疫器官的发育，进而提高机体的免疫力。 1.2.2 对 T、 B 淋巴细胞免疫功能的调节作用 1.2.2.1 对 T 细胞的影响 在维持机体的免疫平衡和免疫监视功能中， T 细胞免疫的调节功能扮演了重要的角色，对机体抗肿瘤免疫起主导作用。 Wang17研究发现 KGM
13、 酸降解物能显著活化小鼠初始 T 细胞 （ native T cell） ，该类 KGM 酸降解物为 5 100g/mL 分子量小于 10kDa。而在Mizutani18等的报道中也有指出，魔芋精粉对小鼠机体有免疫增强作用，可以荷瘤小鼠T 淋巴 细胞增殖能力，进而降低小鼠瘤体重量。 此外，根据所分泌的细胞因子不同，辅助性 T 细胞 （ Th） 被分成 Th1 和 Th2。 Th1/Th2比值的动态平衡是保证正常免疫功能的重要因素，在清除病毒和肿瘤，诱导免疫耐受等方面起着重要作用，所以需维持在一个动态平衡状态 19。 Suzuki Y20等通过流氏细胞仪分析致敏小老鼠脾细胞亚群，实验结果显示证实
14、喂 养葡甘聚糖的过敏小鼠 Th1/Th2 比例明显改善，葡甘聚糖可使小老鼠体内 Th1 从 2.91升至 4.02，而 Th2 细胞则从 3.75降至 2.72；同时，调节性 T 细胞（ Treg）的分化比例从 14.5上升到 18.7。而在Onishi21等的免疫实验也表明，细微粉碎的 KGM（ PKGM）对 Th1/Th2 的比例起着正向调控作用，可以防止过敏性皮炎小鼠模型的皮肤炎症。 可见， KGM 可以促进 T 淋巴细胞活化，维持 Th1/Th2 比例平衡，从而提高机体的细胞免疫功能。 1.2.2.2 对 B 细胞的影响 B 淋巴细胞是免疫系 统中的抗体产生细胞，是免疫系统的重要组成细
15、胞。 KGM 对机体 B 淋巴细胞的活性具有一定的影响作用，可以调节 B 细胞分泌抗体的能力，尤其是对变态反应机体特异性抗体生成的量有明显抑制作用。注射水解 KGM 对卵清蛋白（ DNCB）致敏的 Balb/c 小鼠 B 细胞产 IgE 能力具有一定的影响， Hidenori Suzuki22等发现用 0.25 N 盐酸水解，大小介于 10 和 500 kDa 的 KGM 小鼠注射液能够抑制血浆总IgE 和 IgG1。 Onishi21等的免疫实验表明，细微粉碎的 KGM(PKGM)能明显减少变应性鼻炎模型小鼠的 抓鼻和喷嚏数，抑制 DNCB 刺激引起的 B 淋巴细胞增殖，降低血清总IgE 和
16、 DNCB 特异性 IgE 含量，防止特应性皮炎小鼠模型的皮肤炎症。而 Oomizu23等人在研究 PKGM 降低 DNCB 致敏小鼠血浆特异性 IgE 的机理时发现， KGM 是通过抑制B 细胞 IgE 表达的开关来降低血浆总 IgE 含量的。此外， KGM 能明显抑制 NC/Nga 小鼠特应性皮炎（ AD）模型湿疹的发展。 Nobukazu Onishi24等研究发现 KGM 可以控制NC/Nga 小鼠血清类风湿因子 IgG 抗体和 B 细胞激活因子肿瘤坏死因子家族 （ B 淋巴细5 胞刺激因子， BAFF） 的量。 1.2.3 对细胞因子的影响 对细胞因子的影响是 KGM 免疫调节的又一
17、个重要机制。细胞因子是一种多功能活性蛋白质或糖蛋白，由免疫活化细胞产生。它能调节细胞分化增殖和诱导细胞发挥其功能，在机体免疫应答中起着非常重要的作用 25。 大量实验证明， KGM 可以通过促进细胞因子的活化，从而提高机体的细胞免疫功能。 Wang17研究 KGM 及酸降解物免疫活性时发现，分子量大于 10 kDa 的 KGM 酸降解物可显著增加 NO、 IL-6 及 TNF-的表达，同时还增强小鼠骨髓细胞表面标志物表达（ CD11c， CD40， CD80， CD86） ，增加细胞因子 IL-1 和树突状细胞 （ DC）的趋化因子的产生。王玲等 16将小鼠巨噬细胞用 LPS（ 10 / L）
18、孵育 18 24后，培 养上清中IL-1和 TNF-水平均随 KGM浓度的增加而增加，表明 KGM对巨噬细胞合成和释放 IL-1和 TNF- 具明显促进作用。吕正光 26通过 ELISA 检测发现 KGM 对溃疡性结肠炎大鼠IFN -/IL-4 的比值失衡有明显的调理作用，此外， Oomizu 的实验还发现 PKGM 可以减少小鼠 IL-4 和 IFN- 的基因表达水平，进而影响细胞因子的表达。 Hidenori Suzuki24等研究发现水解 KGM 可以促进单核细胞分泌 IFN -，可显著增强小鼠腹腔巨噬细胞分泌TNF 和 IL - 1 的能力。李映丽 25等 给昆明系小鼠灌胃，持续 25
19、d,观察魔芋甘露聚糖对其免疫功能影响。结果表明 ,魔芋甘露聚糖组半数溶血值 （ HC50） 、淋巴细胞刺激指数 （ SI）及细胞毒百分率明显上升，并增强 TNF 产生。 Onishi N27等给 4 周龄 NC/Nga 小鼠喂食魔芋葡甘聚糖 8 至 9 周，每 2 个星期对其搔抓行为和临床症状进行评估。从第 6 周开始， PKGM 喂养的小鼠的搔抓行为明 显减少，且这种症状是呈剂量依赖性的。连续 PKGM 喂养还可以显著抑制小鼠皮肤细胞角化，对皮肤肥大细胞增生及嗜酸细胞增多的湿疹皮肤病灶有明显改善。同时，血清 P 物质（局部炎性细胞因子）， IL-10 水平和 IL-4 和 TNF- 与对照组
20、相比也均显著降低 （ P0.01） 。 1.2.4 对肠道免疫功能的调节作用 1.2.4.1 对肠粘膜抗体产生的调节 肠道黏膜免疫构成机体防止肠道感染的第一道防线，肠道免疫屏障也是肠黏膜屏障的重要组成部分。 Yamada K28等研究表明 KGM 喂养的小鼠肠系膜淋巴细胞产 IgA 和IgG 水平比其他喂养组明显增高，认为 KGM 对机体免疫功能的增强，这主要表现在肠道免疫系统。史艳莉 29等通过系列实验证明 KGM 对大负荷训练大鼠粘膜 SIgA 具有一定的影响，在大负荷训练期间补充 KGM 可以调节和提高训练机体的肠粘膜 IgA 的免疫屏障功能。他们对大鼠通过 8 周大负荷训练后发现，喂食
21、 KGM 大鼠的血浆内毒素、肠粘膜通透性和细菌移位率升高，小肠 IgA 浆细胞个数、 平均光密度和肠液 SIgA 含量均显著高于大负荷训练对照组 （ P0.05） 。 1.2.4.2 对肠道菌群的调节 肠道内的正常菌群数量庞大、结构复杂。在维持正常免疫功能方面，正常肠道菌群能促进免疫系统发育，发挥重要作用。 Chen HL30通过临床实验表明，魔芋膳食补充可以提高病人对疾病的免疫力，明显改善病人排便及结肠生态。 Chen HL31通过给 7 周龄6 雄性 Balb/c 小鼠喂食 2.5、 5、和 7.5的 KGM 及酸水解物，研究 KGM 与其酸水解物对盲肠和粪便菌群的影响 。 实验表明， K
22、GM 及酸水解物可以通过改善 Balb/c 小鼠肠道菌群环境进而增强小鼠免疫力。所得的实验结果为：小鼠的盲肠厌氧菌和双歧杆菌数量在第 2 周和第 4 周时分别比对照组明显增加；盲肠产气荚膜梭菌数量在第 4 周显着降低；而在第周 2 和第 4 周时，盲肠醋酸和丙酸浓度含量也分别增加；另外，只需 2.5的 KGM 量即可增加肠道双歧杆菌数量。 7 2 实验材料、主要仪器与试剂 2.1 实验材料 2.1.1 实验小鼠 清洁级 ICR 小鼠，浙江省实验动物中心，许可证号 scxk（浙） 20080033，常规饲食喂水，实验开始前禁食不禁水 14h。 2.1.2 主要试剂及仪器 丙酮， 2， 4 一二硝
23、基氯苯 (DNCB)，硫化钠 （西亚试剂公司），氯雷他定（国药准字H20041044,湖北丝宝药业有限公司）。戊巴比妥钠 (美国 Bioszune)，魔芋葡甘聚糖（福建农林大学食品科学院提供）。 2.2 主要仪器 仪器名称 型号 产地 立式自动电热压力蒸汽灭菌器 LDZX 40BI 型 上海申安医疗器械厂 冰箱 BCD-236H Sanyo 旋转式恒温振 荡器 DSHZ 300A 型 江苏太仓实验仪器厂 精密 pH 计 pHS-3C 型 上海精密科学仪器有限公司 电子天平 BS110S 北京赛多利斯仪器系统有限公司 数显式电热恒温干燥器 202-S 上海森信实验仪器有限公司 超净工作台 ESC
24、O 上海金鹏分析 仪器有限公司 电子分析天平 BS110 北京赛多利斯天平有限公司 电热恒温液浴锅 HHS 型 上海棱光技术有限公司 显微镜 BH-2 Olympus 2.3 实验试剂 试剂名称 级别 生产厂家 丙酮 分 析纯 国药集团化学试剂有限公司 DNCB 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 硫化钠 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 氯雷他定 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 磷酸二氢钾 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 七水硫酸镁 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 磷酸铵 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 氯化钙 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 氯化钠 分析纯 国药集团化学试剂有限公司
25、 8 3 实验方法 3.1 实验动物饲养及分组 3.1.1 实验动物饲养 从浙江省实验动物中心购买回来清洁级 ICR 小鼠一共 50 只，放于试验用动物饲养房。选用 4 只白色塑料饲养箱，用清水洗净饲养箱，放于干燥处晾干。在 4 只饲 养箱中垫入约 2cm 厚度的木刨花，木刨花要选择无毒、无异味、吸湿性好、油脂、粉尘少的非松木刨花。垫料在使用之前先过筛，粉尘和粗大玉米秸秆、刨花去掉，再经 132 ， 5min高压蒸汽灭菌干燥 4min 后使用。把 50 只小鼠平均放入饲养箱中，盖好网格盖子。取 4只经灭菌的饲养饮水瓶，饮水瓶各倒入蒸馏水 200ml，放入饲养箱。 14h 后各放入实验用饲养饲料
26、 350g，并观察饮水瓶水量，把剩余的水倒掉，之后重新加入蒸馏水 200ml。 每周更换垫料两次，换上经洗刷消毒过的饲养箱和垫料。换出的废垫料用垃圾袋装好及时扔掉以免产生臭味。 清理的过程中需要带一次性塑胶手套，每更换一个饲养箱之后在消毒液里清洗一下手套，以防止交叉污染。在清洗饲养箱过程中取出仔细观察小鼠，如果发现可疑伤病动物，立即将其移出饲养箱，待查原因。清理换窝过程中，如果有动物掉到地上，不再放回饲养箱，随污物传出室外，淘汰处理。每天早上 7 点，中午 12点，晚上 6 点检查添加饲料，不可一次添得过多，每次加入 200g，以保持饲料的新鲜和避免浪费，掉到地上的饲料不可再用，清扫收集传出室
27、外。同时检查饮水瓶中蒸馏水的水量，每天定时倒出剩余的水，加入新鲜蒸馏水 200ml。 每天早上在检查完小 鼠后，用消毒液擦拭饲养房的走廊及出入口的窗台、地面，每周彻底清扫、消毒一次，做到窗明几净不留死角。每次进入饲养房前穿好工作服，带好工作帽、工作口罩与一次性塑胶手套，以减少污染。 3.1.2 实验动物分组 将 50 只小鼠随机分为 5 组进行实验，每组小鼠平均体重 25g：空白组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组 10 只；实验开始即对每组小鼠灌胃，低剂量组为降解魔芋多糖用量为 2. 0 g/(kgd)；中剂量组为降解魔芋多糖用量为 3. 0 g/(kgd)；高剂量组为降解魔芋多糖
28、用量为 4. 0 g/(kgd)。 3.2 ACD 小 鼠模型制造 各组小鼠均在背部和腹部取 22cm2 范围用硫化钠脱毛，实验开始的第 1 天，用加样器量取 7%DNCB 溶液 25ul，用棉球涂均匀的抹于实验组小鼠腹部致敏，第 2 天再强化一次。第 7 天在鼠背部脱毛区涂抹 1%DNCB 溶液 5ul 激发。 24h 后可造成小鼠背部急性 ACD 模型。空白组小鼠也同上涂抹等量蒸馏水。 3.3 降解魔芋葡甘聚糖制备 在 500mL 甲醇中投入魔芋葡甘聚糖 50 mg，以 2mol/L 加入氢氧化钠，在恒温磁力搅拌器中， 70 ，搅拌 12h。冷却至室温，以盐酸调 pH 值至 3， 70 ，继续加热搅拌24h，以氢氧化钠调 pH 值至中性。减压蒸发去掉甲醇，按 1： 5 的体积比加入 950mL/L乙醇沉淀过夜。过滤，冻干即得 DAKP。
