1、 本科毕业论文 （ 20 届） 魔芋低聚糖对 ACD 小鼠皮肤内肥大细胞的影响 所在学院 专业班级 食品科学与工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 目 录 摘要 .1 Abstract .2 1 前言 .3 1.1 接触性皮炎的研究进展 .3 1.2 魔芋葡甘聚糖免疫调节作用研究进展 .3 2 实验材料、主要仪器与试剂 .6 2.1 实验材料 .6 2.2 主要仪器 .6 2.3 实验试剂 .6 3 实验方法 .7 3.1 实验动物饲养及分组 .7 3.2 ACD 小鼠模型制造 .7 3.3 降解魔芋葡甘聚糖制备 .7 3.4 给药方法 .8 3.5 取材 .8 3.6 检测
2、 .8 4 实验结果与讨论 .9 4.1 魔芋葡甘低聚糖对 ACD 小 鼠体重的影响 .9 4.2 魔芋葡甘低聚糖对 ACD 小鼠行为影响 .10 4.3 魔芋葡甘低聚糖对 ACD 小鼠脾脏的影响 .10 4.4 魔芋葡甘低聚糖对 ACD 小鼠对肥大细胞的影响 .10 5 小结 .11 1 摘要 研究降解魔芋多糖（ DAKP）对 2， 4 一二硝基氯苯 (DNCB)致小鼠急性过敏性皮炎（ ACD）皮肤肥大细胞的影响。方法：将 DNCB 诱导的急性 ACD 小鼠随机分成 5组，空白组，模型组，低、中、高剂量 DAKP 组，每天分别灌胃给予蒸馏水、 DAKP 2.0、3.0、 4.0 g/(kgd
3、)，连续 5w，每周称重一次。在实验末留取过敏性皮炎处皮肤做病理组织学检查。结果： DAKP 能明显缓解 ACD 小鼠症 状；中、高两个剂量组肥大细胞的数量极显著性低于模型组，且几乎未见肥大细胞聚集与脱颗粒现象。结论： DAKP 能抑制ACD 小鼠皮肤肥大细胞聚集及脱颗粒，进而改善 ACD 小鼠的皮肤炎性症状。 关键词 降解魔芋多糖（ DAKP）； ACD 小鼠；肥大细胞；免疫调节 2 Abstract Degradation of konjac of polysaccharide (DAKP) or two of 2,4 dinitrochlorobenzene (DNCB) induced
4、 acute allergic dermatitis (ACD) skin mast cells. Methods DNCB induced acute ACD mice were randomly divided into 5 groups, control group, model group, low, medium and high dose DAKP group given distilled water were administered daily, DAKP 2.0,3.0,4.0 g / (kg d) Continuous 5w, once a week, weighing.
5、 At the end of the experiment specimens from the skin of atopic dermatitis at the pathological examination.Results: DAKP can relieve symptoms of ACD in mice; medium and high dose groups of two the number of mast cells was significantly lower than the model group, and almost no accumulation and mast
6、cell degranulation. Conclusion DAKP ACD mouse skin can inhibit aggregation and degranulation of mast cells, thereby improving the skin of mice with inflammatory symptoms of ACD. Key words Degradation of konjac polysaccharide (DAKP); ACD mice; mast cell; immune regulation 3 1 前言 1.1 接触性皮炎的研究进展 接触性皮炎
7、（ contact dermatitis， CD） ，是皮肤或粘膜暴露于单个或多个外源物质后在接触面或者其他部位出现炎症，又被称为环境和职业性皮肤炎 1-4。它是目前医学研究的一项重要项目，所涉及的领域有临床医学、免疫学、皮肤病学、生理学、生物化学、化学工业、 化妆品工业、食品和等。其表现主要有：丘疹、肿胀、水疮、红斑、剥脱性皮炎 1。根据其病因、发病机制、临床表现，至少可将接触性皮炎分为 6 种： 1、过敏性接触性皮炎； 2、皮肤原发要刺激； 3、速发型接触反应； 4、外原性光毒性反应及光变态反应； 5、非湿疹样接触性反应； 6、系统性接触性反应。 随着经济的发展，职业和环境中越来越多的致病
8、因素暴露出来，导致许多新型的接触性皮炎的产生，已严重影响生产和人民健康。正因它与人们的工作生活密切相关，所以已成为当今医学研究领域的热点。 根据相关数据显示，美国每年用于接触性皮炎方面的费 用至少达 200 万 10 亿美元，主要用于生产、医疗及赔偿的花费 2。从近几年有关接触性皮炎的研究中可以知道：CD 尤其是 ACD，是一类主要由 T 细胞及其细胞因子功能失衡所引起的一种变态反应性疾病，它是在多基因遗传背景和环境因素作用下所发生的 8-11。有关研究显示： ACD 的发病机理不再是以往典型的 IV 型变态反应，它的效应细胞可以为 CD8+ST 也可以是CD4+T 的 Th2 亚类。在某些
9、ACD 发生过程中 B 细胞也会起重要作用 1，其发病机理和异位性皮炎 （ atopic dermatitis,AD） 以及湿疹 （ cczmea） 存在着某些内在的相关性 4-8。因此，为寻找更有效的预防和治疗手段，对 ACD 进行研究十分有必要，这还对免疫学干预治疗具有重要的理论和实际意义。 1.2 魔芋葡甘聚糖免疫调节作用研究进展 魔芋 (Amorphophallus konjac)是一种 多年生 的 草本植物 ，属 天南星科魔芋属。它既可内服，也可外用，具有治疗咳嗽、气喘、疝气、乳房疼痛、烧伤以及血液和皮肤疾病的功效 12。魔芋的块茎中中含丰富的葡甘聚糖 （ Konjae Glucom
10、annan, KGM） ，常用于中医药中，具有较高的药用、食用价值。 KGM 是由含 D-葡萄糖和 D-甘露糖结合的复合多糖。据现代研究表明： KGM 有 诸多功效 ，可以延缓 衰老、调节胃肠道、降 低 血脂、降血糖、抗肿瘤和调节免疫等。在美国和欧洲，纯化的魔芋粉已在食品添加剂和食品补充剂中推出使用 13。 对于 KGM 的研究一直是研究的热点。 据相关 研究，在 KGM 的 众多生物学活性中免疫活性是最为重要的。作为一种免疫调节剂， KGM 可被应用于肿瘤、病毒感染 以 及超敏反应性疾病的临床治疗 14,15。 此外， 魔芋葡甘聚糖不仅能 将 T 细胞、 B 细胞、巨噬细胞等免疫细胞激活，还
11、能 对 体内 的 白细胞介素 -1（ IL-1） 、白细胞介素 -2（ IL-2） 、肿瘤坏死因子（ TNF）、干扰素 -（ IFN-） 等细胞因子的生成 进行 调节，从而 将 机体免疫系统功能增强 。这 在抗变态反应性疾病、抗肿瘤等 重 多方面 都 发挥重要的调节作用 13-15。 1.2.1 对免疫器官的影响 免疫器官是执行机体免疫功能的组织结构，也是淋巴细胞和其他免疫细胞发生、分化成熟、定居和增殖以及产生免疫应答的场所，其发育状况直接影响到机体的免疫力。4 按功能不同，可分为中枢免疫器官 （ 胸腺、腔上囊等 ） 和外周免疫器官 （ 脾脏、淋巴结等 ） 。 对胸腺、脾脏的重量及脾脏细胞的增
12、生方面的影响是 KGM 对免疫器官发育的 影响的主要表现。王玲等 16通过实验证实魔芋精粉（ AKP）对胸腺指数和脾指数具有增高作用，可明显促进小鼠免疫功能。 Wang17报道， KGM 酸 降解物 ，特别是 剂量在 0.3 50g/mL之间 且 分子量大于 10kDa 的 KGM 能对 小鼠脾脏细胞的增生 具有明显的促进作用 ，具有增强初级免疫反应的能力。由此可见，正常 或 免疫低下的动物 的 免疫器官的发育 ， KGM具有一定的 促进 作用 ，进而 再对 机体的免疫力 进行 提高。 1.2.2 对 T、 B 淋巴细胞免疫功能的调节作用 1.2.2.1 对 T 细胞的影响 在 对 维持机体的
13、免疫平衡 和 免疫监视功能中， T 细胞免疫的调节功能扮演了重要的角色，对机体抗肿瘤免疫起主导作用。 Wang17研究发现 KGM 酸降解物能显著活化小鼠初始 T 细胞 （ native T cell） ，该类 KGM 酸降解物为 5 100g/mL 分子量小于 10kDa。而在 Mizutani18等的报道中也有指出，魔芋精粉对小鼠机体 的 免疫 有 增强作 用，可以 对 小鼠 T 淋巴细胞增殖能力 进行 荷瘤， 从 而降低小鼠瘤体 的 重量。 此外，根据所分泌的细胞因子不同，辅助性 T 细胞 （ Th）可以 分成 Th1 和 Th2。保证正常免疫功能的 一项 重要因素 就 是 Th1/Th
14、2 比值的动态平衡 ，它 在清除病毒和肿瘤，诱导免疫耐受等方面 均 起着重要作用，所以 必须 维持在一个动态平衡状态 19。 Suzuki Y20等 利用 流氏细胞仪 对 致敏小老鼠脾细胞亚群 进行 分析， 其 实验结果显示 被 喂养葡甘聚糖的过敏小鼠 的 Th1/Th2 比例明显改善，体内 Th1 从 2.91升至 4.02，而 Th2 细胞则从3.75降至 2.72；同时，调节性 T 细胞（ Treg）的分化比例从 14.5上升到 18.7。而在 Onishi21等的免疫实验也表明，细微粉碎的 KGM（ PKGM）对 Th1/Th2 的比例起着正向调控作用，可以防止过敏性皮炎小鼠模型的皮肤
15、炎症。 可见， KGM 可以 对 活化 T 淋巴细胞 进行 促进，维持 Th1/Th2 比例 的 平衡，从而 使机体的细胞免疫功能 得到 提高。 1.2.2.2 对 B 细胞的影响 B 淋巴细胞是免疫系统 中 的重要组成细胞，是免疫系统中的抗体产生细胞。 KGM对机体 B 淋巴细胞的活性具有一定的影响作用，可以 对 B 细胞分泌抗体的能力 进行调节 ，尤其是 能 明显抑制变态反应机体特异性抗体生成的量。注射水解 KGM 对卵清蛋白（ DNCB）致敏的 Balb/c 小鼠 B 细胞产 IgE 能力具有一定的影响， Hidenori Suzuki22等发现用 0.25 N 盐酸水解，大小介于 10
16、 和 500 kDa 的 KGM 小鼠注射液能够抑制血浆总IgE 和 IgG1。 Onishi21等的免疫实验表明，细微粉碎 的 KGM(PKGM)能明显减少变应性鼻炎模型小鼠的抓鼻和喷嚏数，抑制 DNCB 刺激引起的 B 淋巴细胞增殖，降低血清总IgE 和 DNCB 特异性 IgE 含量，防止特应性皮炎小鼠模型的皮肤炎症。而 Oomizu23等人在研究 PKGM 降低 DNCB 致敏小鼠血浆特异性 IgE 的机理时发现， KGM 是通过抑制B 细胞 IgE 表达的开关来降低血浆总 IgE 含量的。此外， KGM 能明显抑制 NC/Nga 小鼠特应性皮炎（ AD）模型湿疹的发展。 Nobuka
17、zu Onishi24等研究发现 KGM 可以控制NC/Nga 小鼠血清类风湿因子 IgG 抗体和 B 细胞激活因子肿瘤坏死因子家族 （ B 淋巴细5 胞刺激因子， BAFF） 的量。 1.2.3 对细胞因子的影响 对细胞因子的影响是 KGM 免疫调节的又一个重要机制。细胞因子是一种 具有 多功能活性 的 蛋白质或糖蛋白， 它是 由免疫活化细胞产生。它能调节细胞分化增殖和诱导细胞发挥其功能，在机体免疫应答中起着非常重要的作用 25。 大量 研究 证明， KGM 可以通过 对 细胞因子 的 活化 进行 促进，从而提高机体的细胞免疫功能。 Wang17研究 KGM 及酸降解物免疫活性时发现，分子量
18、大于 10 kDa 的 KGM酸降解物可显著增加 NO、 IL-6 及 TNF-的表达，同时还增强小鼠骨髓细胞表面标志物表达（ CD11c， CD40， CD80， CD86） ，增加细胞因子 IL-1 和树突状细胞 （ DC）的趋化因子的产生。王玲等 16将小鼠巨噬细胞用 LPS（ 10 / L）孵育 18 24后，培养上清中 IL-1 和 TNF- 水平均随 KGM 浓度的增加而增加，表明 KGM 对巨噬细胞合成和释放IL-1 和 TNF- 具明显促进作用。吕正光 26通过 ELISA 检测发现 KGM 对溃疡性结肠炎大鼠 IFN -/IL-4 的比值失衡有明显的调理作用，此外， Oomi
19、zu 的实验还发现 PKGM 可以减少小鼠 IL-4 和 IFN-的基因表达水平，进而影响细胞因子的表达。 Hidenori Suzuki24等研究发现水解 KGM 可以促进单核细胞分泌 IFN -，可显著增 强小鼠腹腔巨噬细胞分泌 TNF 和 IL - 1 的能力。李映丽 25等给昆明系小鼠灌胃，持续 25d， 观察魔芋甘露聚糖对其免疫功能影响。结果表明 ， 魔芋甘露聚糖组半数溶血值 （ HC50） 、淋巴细胞刺激指数 （ SI） 及细胞毒百分率明显上升，并增强 TNF 产生。 Onishi N27等给 4 周龄 NC/Nga 小鼠喂食魔芋葡甘聚糖 8 至 9 周，每 2 个星期对其搔抓行
20、为和临床症状进行评估。从第 6 周开始， PKGM 喂养的小鼠的搔抓行为明显减少，且这种症状是呈剂量依赖性的。连续 PKGM 喂养还可以显著抑制小鼠皮肤细胞角化，对皮肤肥大细胞增生及嗜酸细胞增多的湿疹皮肤病灶有明显改善。同时，血清 P 物质（局部炎性细胞因子）， IL-10 水平和 IL-4 和 TNF- 与对照组相比也均显著降低 （ P0.01） 。 1.2.4 对肠道免疫功能的调节作用 1.2.4.1 对肠粘膜抗体产生的调节 肠道黏膜免疫构成机体防止肠道感染的第一道防线，肠道免疫屏障也是肠黏膜屏障的重要组成部分。 Yamada K28等研究表明 KGM 喂养的小鼠肠系膜淋巴细胞产 IgA
21、和IgG 水平比其他喂养组明显增高，认为 KGM 对机体免疫功能的增强，这主要表现在肠道免疫系统。史艳莉 29等通过系列实验证明 KGM 对大负荷训练大鼠粘膜 SIgA 具有一定的影响，在大负荷训练期间补充 一定量的 KGM可以调节和提高训练机体的肠粘膜 IgA的免疫屏障功能。 实验中， 他们对大鼠 进行 8 周大负荷训练 后发现 ， 喂食 KGM 的 大鼠体中 血浆内 的 毒素、肠粘膜通透性和细菌移位率 有所 升高，小肠 IgA 浆细胞个数、平均光密度和肠液 SIgA 含量均显著高于大负荷训练对照组 （ P0.05） 。 1.2.4.2 对肠道菌群的调节 肠道内的正常菌群数量庞大、结构复杂。
22、在维持正常免疫功能方面，正常肠道菌群能促进免疫系统发育，发挥重要作用。 Chen HL30通过临床实验表明，魔芋膳食补充可以提高病人对疾病的免疫力，明显改善病人排便及结肠生态。 Chen HL31通过给 7 周龄6 雄性 Balb/c 小鼠喂食 2.5、 5、和 7.5的 KGM 及酸水 解物，研究 KGM 与其酸水解物对盲肠和粪便菌群的影响 。 实验表明， KGM 及酸水解物可以通过改善 Balb/c 小鼠肠道菌群环境进而增强小鼠免疫力。所得的实验结果为：小鼠的盲肠厌氧菌和双歧杆菌数量在第 2 周和第 4 周时分别比对照组明显增加；盲肠产气荚膜梭菌数量在第 4 周显着降低；而在第周 2 和第
23、 4 周时，盲肠醋酸和丙酸浓度含量也分别增加；另外，只需 2.5的 KGM 量即可增加肠道双歧杆菌数量。 2 实验材料、主要仪器与试剂 2.1 实验材料 2.1.1 实验小鼠 清洁级 ICR 小鼠，浙江省实验动物中心，许可证号 scxk（浙） 20080033，常规饲食喂水 ，实验开始前禁食不禁水 14h。 2.1.2 主要试剂及仪器 丙酮， 2， 4 一二硝基氯苯 (DNCB)，硫化钠（西亚试剂公司），氯雷他定（国药准字H20041044,湖北丝宝药业有限公司）。戊巴比妥钠 (美国 Bioszune)，魔芋葡甘聚糖（福建农林大学食品科学院提供）。 2.2 主要仪器 仪器名称 型号 产地 立式
24、自动电热压力蒸汽灭菌器 LDZX 40BI 型 上海申安医疗器械厂 冰箱 BCD-236H Sanyo 旋转式恒温振荡器 DSHZ 300A 型 江苏太仓实验仪器厂 精密 pH 计 pHS-3C 型 上海精密科学仪器有限公司 电子天平 BS110S 北京赛多利斯仪器系统有限公司 数显式电热恒温干燥器 202-S 上海森信实验 仪器有限公司 超净工作台 ESCO 上海金鹏分析仪器有限公司 电子分析天平 BS110 北京赛多利斯天平有限公司 电热恒温液浴锅 HHS 型 上海棱光技术有限公司 显微镜 BH-2 Olympus 2.3 实验试剂 试剂名称 级别 生产厂家 丙酮 分析纯 国药集团化学试剂
25、有限公司 DNCB 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 硫化钠 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 氯雷他定 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 磷酸二氢钾 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 七水硫酸镁 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 磷酸铵 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 氯化钙 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 7 氯化钠 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 3 实验方法 3.1 实验动物饲养及分组 3.1.1 实验动物饲养 从浙江省实验动物中 心购买回来清洁级 ICR 小鼠一共 50 只，放于试验用动物饲养房。选用 4 只白色塑料饲养箱，用清水洗净饲养箱，放于干燥处晾干。在 4 只饲养箱中垫
26、入厚度约 2cm 的木刨花，木刨花要选择无毒、无异味 ， 吸湿性好 ， 少油脂、粉尘的非松木刨花。垫料在使用之前先过筛，粉尘和粗大玉米秸秆、刨花去掉，再经 132 高压蒸汽灭菌 5min， 干燥 4min 后使用。把 50 只小鼠平均放入饲养箱中，盖好网格盖子。取 4 只经灭菌的饲养饮水瓶，饮水瓶各倒入蒸馏水 200ml，放入饲养箱。 14h 后各放入实验用饲养饲料 350g，并观察饮水瓶水量，把剩余的水倒掉，之 后重新加入蒸馏水200ml。 每周更换垫料两次，换上经洗刷消毒过的饲养箱和垫料。换出的废垫料用垃圾袋装好及时扔掉以免产生臭味。清理的过程中需要带一次性塑胶手套，每更换一个饲养箱之后在
27、消毒液里清洗一下手套，以防止交叉污染。在清洗饲养箱过程中取出仔细观察小鼠，如果发现可疑伤病动物，立即将其移出饲养箱，待查原因。清理换窝过程中，如果有动物掉到地上，不再放回饲养箱，随污物传出室外，淘汰处理。每天早上 7 点，中午 12点，晚上 6 点检查添加饲料，不可一次添得过多，每次加入 200g，以保持饲料的新鲜和避免浪费，掉到地上的饲料 不可再用，清扫收集传出室外。同时检查饮水瓶中蒸馏水的水量，每天定时倒出剩余的水，加入新鲜蒸馏水 200ml。 每天早上在检查完小鼠后，用消毒液擦拭饲养房的走廊及出入口的窗台、地面，每周彻底清扫、消毒一次，做到窗明几净不留死角。每次进入饲养房前穿好工作服，带
28、好工作帽、工作口罩与一次性塑胶手套，以减少污染。 3.1.2 实验动物分组 将 50 只小鼠随机分为 5 组进行实验，每组小鼠平均体重 25g：空白组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组 10 只；实验开始即对每组小鼠灌胃，低剂量组为降解魔芋多糖用量为 2. 0 g/(kgd)；中剂量组为降解魔芋多糖用量为 3. 0 g/(kgd)；高剂量组为降解魔芋多糖用量为 4. 0 g/(kgd)。 3.2 ACD 小鼠模型制造 各组小鼠均在背部和腹部取 22cm2 范围用硫化钠脱毛，实验开始的第 1 天，用加样器量取 7%DNCB 溶液 25ul，用棉球涂均匀的抹于实验组小鼠腹部致敏，第 2
29、天再强化一次。第 7 天在鼠背部脱毛区涂抹 1%DNCB 溶液 5ul 激发。 24h 后可造成小鼠背部急性 ACD 模型。空白组小鼠也同上涂抹等量蒸馏水。 3.3 降解魔芋葡甘聚糖制备 在 500mL 甲醇中投入魔芋葡甘聚糖 50 mg，以 2mol/L 加 入氢氧化钠，在恒温磁力搅拌器中， 70 ，搅拌 12h。冷却至室温，以盐酸调 pH 值至 3， 70 ，继续加热搅拌24h，以氢氧化钠调 pH 值至中性。减压蒸发去掉甲醇，按 1： 5 的体积比加入 950mL/L8 乙醇沉淀过夜。过滤，冻干即得 DAKP。 3.4 给药方法 灌药自致敏前 ld 开始，各组小鼠均每日给药 1 次，每次灌
30、胃量为 0.4ml。 ACD 模型再于激发前 2h 及激发后 6h 灌药 1 次。各量组分别：降解魔芋多糖在灌胃低剂量组时的用量为 2. 0 g/(kgd)；降解魔芋多糖在灌胃中剂量组的为用量为 3. 0 g/(kgd)；降解魔芋多糖在灌 胃高剂量组的用量为 4. 0 g/(kgd);使用氯雷他定组灌服 4倍的等效量氯雷他定，模型组要用等量蒸馏水灌胃。 小鼠灌胃方法：保持小鼠的头部和颈部成一直线，方便灌胃针头进入，动作要轻柔，从口角进入，防止损失食道。之后准备好灌胃的针头。一般可从市场上购买，如果没有的话，用 12 号的针头，把 12 号的针头针尖剪去，然后将剪去的头端磨掉磨平。市面上买的灌胃
31、针头的头端是用锡或者其他方法处理好了的锐口，而自己是不可能将所有的尖头都磨掉的，因而使用这种针头灌胃，可能会造成小鼠食道的损伤。抓小鼠的动作也很简单，用左手的小指 和无名指抓住小鼠的尾巴，用其他的三个手指抓住小鼠的颈部。因为小鼠始终在活动中，如果一次抓的感觉不是很顺手，就要放开重新抓，切记不要逞强而进行下一步的操作。之后就抓好小鼠就可以灌胃了，一般是用 1ml 的注射器装上灌胃针头。灌胃针头是从小鼠的嘴角进入，首先要压住舌头，抵住上颚，轻轻向内推进，进入食管后会有一个刺空感，之后进入食道后就可以推注药液了，灌胃的针头也可以是再往里面深入一点，以防止药液从口中流出。灌胃容积一般是 0.1 0.2
32、ml/10g，最大0.35ml/10g，每只小鼠的灌胃最大容积不超过 0.8ml。 3.5 取材 急性模型激发后 24h，小鼠背部皮肤潮红、肿胀、增厚，或有渗出、结痴；慢性模型激发后 72h，小鼠背部皮肤呈片状红斑，皮肤表面粗糙、角化、脱屑。以上症状符合急、慢性 ACD 的临床表现，说明造模成功。小鼠摘眼球取血，脱颈处死。小鼠处死后于注射点周围 2cm 内剪毛后剪取鼠皮肤 ， 生理盐水冲洗后置于 Bouns 液中固定 48h， 常规水、包埋， 6m 石蜡切片。 3.6 检测 3.6.1 小鼠的体重变化 测量实验进程中的第 1、第 7、第 14、第 21、第 28 天和第 35 天各组小鼠的体重，并进行比较。 3.6.2 小鼠行为变化 观察实验进程中的第 1、第 7、第 14、第 21、第 28 天和第 35 天各组小鼠行为的变化，并进行比较。 3.6.3 小鼠胸腺和脾脏重量的影响 测量实验进程中的第 1、第 7、第 14、第 21、第 28 天和第 35 天各组小鼠的体重，并进行比较。 3.6.4 肥大细胞染色与计数 肥大细胞的染色采用甲苯胺蓝改良染色法。具体操作为：将小鼠皮肤切片浸入高锰
