1、 本科毕业论文 （ 20 届） 生物防腐剂的筛选及 其 在水产上的应用 所在学院 专业班级 食品科学与工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 目录 摘要 1 ABSTRACT2 1 前言 3 1.1 概述 3 1.2 生物防腐剂的性质特点及应用 3 1.3 水产品的特点 3 1.4 小黄鱼的介绍 4 2 实验材料、主要仪器与试剂 4 2.1 实验材料 4 2.2 主要仪器 4 2.3 主要试剂 5 2.4 培养基 5 3 实验方法 5 3.1 抑菌实验 6 3.2 抑菌圈直径的测定 6 3.3 竹荪对微生物的影响 6 3.4 水产品的品质评定 7 3.5 菌落总数 的 测定 7
2、 4 结果与分析 7 4.1 防腐剂对菌类的 抑菌效果 7 4.2 化学分析 8 4.3 微生物分析 10 4.4 感官分析 11 5 小结与展望 1 2 参考文献 12 致谢 1 4 1 摘要 本文 主要分析了 鱼虾类水产品易腐败变质的原因，四种来源不同 生物防腐剂对冷冻 小黄鱼 的抑菌效果 ，采用空白对照实验，对一些指标如抑菌圈的大小、微生物总数、 TVB-N、 pH等的比较测定，通过感官评定来确定最佳生物防腐剂以及最佳抑菌浓度。实验结果表明 长裙竹荪、 乳酸 链球菌素、溶菌酶、乌梅 都有一定程度的防腐效果， 几种生物防腐剂 对于病原菌的抑菌圈大小的观察，实验表明长群竹荪 对大肠杆菌 的抑
3、菌圈 直径为 13.2mm， ,乳酸链球菌素 的抑菌圈直径为11.2mm，溶菌酶的抑菌直径为 10.2mm，乌梅抑菌直径为 9.1mm。 其 说明长裙竹荪 抑菌效果最好，故以这种生物防腐剂为研究对象，选择冷冻小黄鱼，考察其加于不加对微生物、化学、感官等指标的影响。 这为水产品的防腐保鲜提供一些参考。 关键词 生物防腐剂；长裙竹荪；抑菌； 冷冻小黄鱼 2 Study on the Biological preservatives using of the frozen aquatic products Abstract This paper analyzes the deterioration
4、of perishable aquatic fish and shrimp reason, four sources of different preservatives on the inhibitory effect of small yellow croaker frozen by the control experiment, for some indicators such as the size of inhibition zone, the total number of microorganisms, TVB- N, pH and so the comparison deter
5、mination, through the sensory evaluation to determine the best preservative and the best inhibitory concentration. The results showed that bamboo sun dress, nisin, lysozyme, ebony have some degree of corrosion protection, bio-preservative for several pathogens the size of inhibition zone of observat
6、ion, experiments show that the length of the E. coli group Dictyophora inhibition zone diameter of 13.2mm, nisin inhibition zone diameter of 11.2mm, diameter of inhibition of lysozyme 10.2mm, ebony inhibition diameter of 9.1mm. The inhibitory effect of bamboo fungus that dress the best, so in order
7、to study this biological preservatives, choose frozen yellow croaker was investigated without the added to the microbial, chemical, sensory and other indexes. This aquatic Preservation to provide some reference. Key words Biological preservative; Bamboo Sun Dress; Antibacterial; Freezing little yell
8、ow croaker 3 1 前言 1.1 概述 我国海域和内海水域面积都很辽阔，水产资源丰富，水产品种类繁多，有鱼类、虾蟹类、头足类、贝类及藻类等。我国海域地处热带、亚热带和温带三个气候带，鱼类有冷水性、温水性和暖水性之分，总计 2500 余种，我国水产品产量约占世界总产量的三分之一，位居世界首位， 2007 年全国水产品产量约 4800 万吨，其中淡水产品产量约 2100万吨，海洋 捕捞产品产量 1400 万吨，海水养殖产品产量 1300 万吨。我国的水产品加工企业和水产品加工已逐步成为中国渔业的支柱产业。 水产品营养丰富、味道鲜美，并具有低脂肪、高蛋白、营养平衡性好的特点，深受人们的喜爱
9、，是我们摄取动物性蛋白的重要来源之一，也是合理膳食结构中不可缺少的重要组成部分。 据统计说明我国 2000 年的水产品总量为 4.1 亿吨，比 1999 年增长了 3.8%。同时，我国作为渔业大国，水产养殖这一块的规模发展也极其快速，水产业进入快速发展阶段，到 2005 年我国水产品总产量达 5.1 亿吨，产值高达 4016.1 亿元 。并且，我国的养殖产量超过捕捞产量，养殖产的量占到世界养殖总产量的 70%以上 1。所以我国对水产品腐败变质相当重视，所以现在对生物防腐剂的研究逐渐加强。而且水产品容易防腐变质，一旦鲜度变差其价值就下降很多，很有可能丧失它的食用价值并且造成严重的经济损失。为了减
10、少储运过程中因腐败变质而造成的资源浪费及重大经济损失，需要采取适当防腐保鲜措施以减少水产品的腐败变质。 1.2 生物防腐剂的性质特点及应用 生物防腐剂 即天然防腐剂， 主要包括一些有机酸、多肽类物质，是微生物在代谢过程中产生的一种抗菌物质，其作用机理主要 是在微生物细胞膜上形成微孔，使细胞膜的通透性增大，同时其产生的能量也会给系统造成破坏， 由于有机酸、多肽类物质都很容易进入微生物细胞 ，因而其能快速抑制微生物的生长繁殖 2，从而达到抑菌的效果 。 生物防腐剂主要来源有三个方面： 一般来源于植物、动物及微生物三种，即植物源生物防腐剂、动物源生物防腐剂、微生物源生物防腐剂三大类。植物源生物防腐剂
11、主要有茶多酚、香辛料、中草药等 3，动物源生物防腐剂主要有壳聚糖、鱼精蛋白、蜂胶等，微生物源生物防腐剂主要有乳酸链球菌素（ Nisin） 4、纳他霉素 5、 聚赖氨酸 6 等 。生物防腐剂在水产品防腐保鲜方面的应用我国还尚处于初步阶段，还有待于发展。 近年来，随着人们生活水平和消费水平的提高，对食品的安全要求也越来越高，越来越多的人开始关注生物防腐剂，这主要归因于生物防腐剂具有高效、无毒副作用、适用范围广、性能稳定，对食品无污染等优点，这也就使得其逐渐成为食品工业研究应用的热点，生物防腐剂将逐渐代替传统的化学防腐剂这是未来防腐剂发展的必然趋势。国内外对于生物防腐剂的研究是越来越重视，近年来，有
12、不少关于这方面的研究报道，还有不少新型生物防腐剂被研究出来并应用到食品行业且取得了较好的 效果。 随着人们消费水平和生活水平的不断提高，对食品质量安全的要求也要严格，同时4 对食品的加工体系与消费形态也有了更高的要求，天然、安全、无污染的生物防腐剂将逐渐取代传统的化学防腐剂。来源于微生物的生物防腐剂在水产品工业中的应用是最有发展前途的，这是因为微生物生长繁殖速度快，生产成本又要低，因此微生物来源的生物防腐剂可以进行工业化大生产 12。 生物防腐剂在水产品的应用与传统防腐方法相比，具有很多的优点，如对人体毒副作用小、对水产品的品质影响小等，所以受到了人们的普遍重视和推崇 13。但目前生物防腐剂在
13、水 产品防腐保鲜的应用研究尚处于起步阶段且价格也较贵，所以国内外对该方面的研究还不多；同时，生物防腐对水产品的防腐效果的研究还只是在实验室水平，是否能够大规模的使用于水产品的防腐保鲜，还有待进一步的实验论证。因此，只有在保证食品食用安全的前提下，大力加强生物防腐剂对水产品的抑菌防腐效果及机理的研究，才能为水产品防腐技术提供新的技术，保持水产品的鲜度、延长货架期，保持其食用价值，从而促进水产品经济效益的明显提高。相信未来，生物防腐剂在水产品的应用前景 14将会很好。 1.3 水产品的特点 水产品具有味道鲜美、营 养丰富、保健作用强等特点，近几年发现 水产品中 富含对心血管病有疗效的 n 3不饱和
14、脂肪酸和其他活性物质，愈来愈受到人们的欢迎。 鱼虾贝类肌肉组织比一般动物 肌 肉组织容易腐败，其主要原因有： 鱼虾贝类肌肉中含水分 较 多，适合细菌繁殖； 鱼虾贝类 肌 肉组织脆弱，细菌容易分解； 鱼虾贝类死后，肉很快呈 现 弱碱性，适合细菌繁殖及生长； 鱼虾贝类肉 本身 附着细菌的机会多，尤其鳃及内脏附着的细菌多，腐败后 很容易 接触到肌肉， 而 引起肌肉的腐败变质； 鱼虾贝类肉所附着的细菌大多 数是 中温细菌，在常温下繁殖很快； 鱼虾贝类肉所含天然免疫物质 相 对较 少。 由于鱼虾贝类等水产品肌肉中水分含量约 为 70，组织脆弱、天然免疫物质少、不饱和脂肪酸易氧化及可溶性蛋白质含量 较 高
15、，因此比一般的动物肉组织容易腐败，不易贮藏。鱼虾贝类鲜品对储运销售环境的要求高，特别是在炎热的季节，若不加冷却防范措施，在销售过程中 非常容易 腐败变质。 因而具有既能保持水产品的原有风味和营养成分，又能长期贮藏，并且食用也较方便的 “ 冷冻水产品 ” 不仅深受广大消费者的欢迎 ， 而且也能满足内陆消费者对海产品的需求，成为人们日常餐桌上不可缺少的美味佳肴。 1.4 小黄鱼的介绍 小黄鱼 ，脊椎动物， 鱼纲 ，石首鱼科，又名：小鲜、大眼、花色、小黄瓜、古鱼、黄鳞鱼、小春色、金龙、厚鳞仔，也叫 “ 黄花鱼 ” 、 “ 小黄花 ” 。体形似大黄鱼，但头较长，眼较小， 鳞片 较大，尾柄短而宽，椎骨
16、28 30 块。耳石较大。体长约 20 余厘米。体背灰褐色，腹部金黄 色。为近海底层结群性洄游 鱼类 ，栖息于泥质或泥沙底质的海区。产卵场在沿岸海区水深 10 25 米，越冬场一般为 40 80 米，鱼群有明显的垂直移动现象，黄昏时上升 ,黎明下降 ,白昼栖息于底层或近底层。 本实验主要是研究 乳 酸链球菌素、长裙竹荪、乌梅、溶菌酶 对不同供试菌株的抑菌圈直径的影响。 采用空白对照实验，通过一些指标的测定比较，从而筛选出最佳防腐剂，5 并将它应用在水产品冷冻小黄鱼中。 2 实验材料、主要仪器与试剂 2.1 实验材料 本实验所用样品为舟山北门市场的冷冻小黄鱼，原料获取后立即放入 04 冰箱中冷藏
17、。供试菌株包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌、普通变形杆菌，均由浙江海洋学院食品科学与工程实验室提供。 2.2 主要仪器 仪器名称 型号 厂家 pH 计 DECTA320A/C 梅特勒托利多公司 离心机 TGL-16C 上海安亭科学仪器厂 恒温培 养振荡器 ZHWY-100C 上海智城分析仪器制造有限公司 净化工作台 SW-CJ-1F 苏州净化设备有限公司 电热恒温水浴锅 HHS 型 上海棱光技术有限公司 双目生物显微镜 XSP-2C 上海光学显微镜 台式电子天平 TD3102 余姚金诺天平仪器有限公司 压力蒸汽灭菌锅 YXQ-LS-30522 上海博讯实业有限公司医疗设备厂
18、 2.3 主要试剂 试剂（规格） 规格 厂家 乳酸链球菌素 食品级 兰州伟日生物工程有限公司 长裙竹荪 食品级 无锡太阳绿宝科技有限公司 乌梅 食品级 广州市纵望新材料科技有限公司 溶菌酶 食品级 兰州伟日生物工程有限公司 蛋白胨 生化试剂 国药集团上海化学试剂有限公司 氯化钠 分析纯 国药集团上海化学试剂有限公司 琼脂 分析纯 国药集团上海化学试剂有限公司 牛肉膏 分析纯 国药集团上海化学试剂有限公司 2.4 培养基 细菌固体培养基（ g/L）：牛肉膏 5，蛋白胨 10，氯化钠 5，琼脂 20 细菌液体培养基（ g/L）：牛肉膏 5，蛋白胨 10，氯化钠 5 3 实验方法 3.1 抑菌试验
19、3.1.1 供试菌株的 准备 在无菌操作台上将供试菌种移接到相对应的试管斜面培养基上，将细菌置 30 培养箱内培养 19-25h，之后将它们置于 4 冰箱冷藏备用。 6 3.1.2 培养基营养制备 将配制好 营养琼脂培养基 121 ， 20min 灭菌后倾注于无菌的培养皿中，每皿约20ml。 3.1.3 供试菌株悬浮液的制备及平板接种 分别用接种环挑取少许菌体于装有 10ml 无菌水的试管内，振荡均匀，制成菌悬浮液，调整菌悬浮液的溶液浓度，使其含菌体为 106-107CFU/mL，即得供试菌株的悬浮液。分别取各供试菌液 0.2 mL 倒入营养琼脂平板培养基中涂布 均匀 。 3.1.4 滤纸圆片
20、测试培养 用打孔器将定性滤纸打成直径 6mm 的小圆片，灭菌后分别 浸 没到浓度为 0.3 g/mL的 长裙竹荪、乌梅、溶菌酶、乳酸链球菌素中 5min， 取出沥去多余的茶多酚溶液、壳聚糖溶液和乳酸链球菌素溶液，分散平贴于平板培养基中，细菌置于 37 培养 48h 后测量抑菌圈直径大小。 3.2 抑菌圈直径的测定 刮取适量用营养琼脂培养后的供试菌株的菌苔至无菌生理盐水中，制成含菌量为 5 107-5 108CFU/mL 的菌悬液，分别取各供试菌液倒入营养琼脂平板培养基中涂布均匀，用打孔器将滤纸打成直径为 8mm 的小圆纸片，分别浸没到浓度为 0.1 g/mL、 0.3 g/mL和 0.5 g/
21、mL 的茶多酚溶液、壳聚糖溶液 16和乳酸链球菌素溶液中浸泡 5min，取出沥去多余的茶多酚溶液、壳聚糖溶液和乳酸链球菌素溶液，分散平贴于平板培养基中，细菌置于 37 培养 48h 后测量抑菌圈直径大小。 3.3 竹荪对微生物抑菌的影响 试验竹荪对水产品抑菌的影响，测试其对冷冻小黄鱼的抑菌效果是否明显。 3.3.1 保鲜液配制 以 1000m1为配制单位，将竹荪提取液溶解在 50m1浓度为 0.101mo l /L的 HCl中，加入 950m1的蒸馏水中，并混和均匀 。 3.3.2 冷冻小黄鱼肉样处理 将加入竹荪的小黄鱼和不加竹荪小黄鱼分别保存在 4 的 恒 温箱中贮藏一个月后，每 4天取样一
22、次，取 20 g加到灭菌生理盐水中，用匀浆机处理均匀到 10-7在重中取 0.1 mL到培养基上观察。 每隔 3天 测一 次 菌落总数、 pH值 和 感官指 标 。 3.3.3 pH 测定 取一定量的鱼肉，加入 10 倍体积的蒸馏水，用高速分散均质机均质几分钟，放置10min 后，用 pH 计测定。 3.3.4 蛋白质测定 7 精确称取 25g 干净的鱼肉，捣碎后移入干燥的 100mL 凯氏定氮 瓶中，采 GB/T 5009.5-2003 中的凯氏定氮法进行测定。 3.4 水产品 的 品质评定 3.4.1 挥发性盐基氮 (TVBN)的测定 采用挥发性盐基氮 (TVBN)作为鱼糜腐败的化学指标。
23、 TVBN 的测定采用 SCT 3032-2007 中的方法 进行 。 3.4.2 感官评定 由 9 人组成的观感小组按 W illiam s 介绍的 9 点评分法进行打分 14 : 项目 1 2 3 4 5 6 7 8 9 色泽 气味 滋味 组织状态 非常差 很差 差 较差 一般 较好 好 很好 非常好 由 9 名 经过训练的评价员组成感官评定小组，对 小黄鱼 样品的气味、色泽、质地、煮后口感等进行综合评分。 判断 货 架期时需要 考 虑 安 全系 数 ， 实验 取 6 或 6 以上 可 接受 ， 即货架寿 命 的终点。 3.5 菌落总数的测定 3.5.1 防腐剂的添加 实验中，将竹荪添加到
24、各种冷冻小黄鱼中，保存在 4 的 恒 温箱中贮藏一个月后，每 4 天取样一次，取 20 g 加到灭菌生理盐水中，用匀浆机处理均匀到 10-7 在重中取 0.1 mL到培养基上观察。 每 35 天抽样 1 次分别检测细菌总数、 pH 值 和 感官 。每次每种防腐剂的每种浓度各取用 20g(20g/袋 )，每次指标测 定两次，取平均值作为结果。 3.5.2 菌落总数测定 按 GB 47891 17 94肉与肉制品检测取样，遇有胀袋或开袋后感官性状异常，停止本处理及其它检验 2。 微生物菌落总数 (A PC )根据 GB 47891 2 94 进行测定，以 cfu /g 计，超过 5 104 cfu
25、 / g 为微生物超标。 4 结果与分析 4.1 防腐剂对菌类的抑菌效果 本试验采用枯草芽胞杆菌，金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，沙门氏菌，黑曲霉，作为测试菌种，分别测量 对 其的抑菌圈。结果见表 1。 8 表 1 乳酸链球菌素、长裙 竹荪、乌梅、溶菌酶 对不同供试菌株的抑菌圈直径的影响 供试菌种 抑菌圈直径（ mm） 空白 乳酸链球菌素 长裙竹荪 乌梅 溶菌酶 大肠杆菌 11.2 13.2 9.1 10.2 - 金黄色葡萄球菌 9.2 11.4 7.2 8.3 - 沙门氏菌 9.3 11.5 7.3 8.5 - 枯草芽孢杆菌 10.1 12.1 8.1 9.1 - 普通变形杆菌 12.3 14.2
26、 10.2 11.2 - 通过抑菌圈实验可以很好地反映防腐剂的抑菌能力，抑菌圈直径越大，说明抑菌效果越强。从表 1 的结果可以看出 ，四种生物防腐剂乳酸链球菌素、长裙竹荪、乌梅、溶菌酶对供试菌株的生长均表现出一定的抑制效果。其中乳酸链球菌素对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等革兰氏阳性细菌表现出较强的抑制作用，而对大肠杆菌、沙门氏菌等革兰氏阴性细菌的抑制作用较弱，这与乳酸链球菌素的抑制原理相符合。对于本文选择的供试菌株，长裙竹荪的抑制作用强于乳酸链球菌素、乌梅和溶菌酶。故选长裙竹荪作防腐剂对水产品小黄鱼做进一步研究。 4.2 化学分析 4.2.1 pH 值 按理论分析， pH值越低的产品，防腐效果越好。而 鱼虾贝类死后，肉很快呈弱碱性，冷冻小黄鱼 在加工过程中根据生产需要必须要添加磷酸盐，而磷酸盐加入到肉制品中后必然将 pH值向高点移动，从而达到保水性的目的。就保水性来讲， pH值越高越好。但许多微生物的 pH值生长范围也恰在此范围内。在同等的防腐剂添加量下， pH值不一样，所表现的防腐效果不一样。本试验中使用竹荪调节 pH值。冷冻小黄鱼的 pH值的高低，会直接影响到产品的货架期，一般低温鱼肉类制品的 pH值控制在 5.8 6.2。 图 1 竹荪对 冷冻小黄鱼 pH的影响 由 图 1 冷冻小黄鱼的 pH 值在加有防腐剂与没加防腐剂的情况下一样，都会下降，
