1、 本科毕业论文 （ 20 届） 生物防腐剂的筛选及其在水产品中的应用 所在学院 专业班级 食品科学与工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 - 2 - 目录 摘要 . 1 ABSTRACT. 2 1 前言 . 3 1.1 概述 . 3 1.2 生物防腐剂的性质特点及应用 . 3 1.3 水产品的性质特点 . 4 1.4 冷冻鱼糜的介绍 . 4 2 实验材料、主要仪器 与试剂 . 5 2.1 实验材料 . 5 2.2 主要仪器 . 5 2.3 主要试剂 . 5 2.4 培养基 . 5 2.4.1 营养琼脂培养基 . 5 2.4.2 伊红美蓝琼脂（ EMB琼 脂） . 5 2.4.
2、3 乳糖胆盐发酵培养基 . 6 3 实验方法 . 6 3.1 鱼糜的工艺流程 . 6 3.2 抑菌圈直径的测定 . 6 3.3 挥发性盐基氮 TVB-N 的测定 . 6 3.3.1 样品处理 . 6 3.3.2 蒸馏滴定 . 6 3.4 菌落总数和大肠菌群的测定 . 6 3.4.1 添加防腐剂 . 6 3.4.2 菌落总数的测定 . 7 3.4.3 大肠菌群的检验 . 7 3.5 三甲胺 TMA 的测定 . 7 3.6 感官评定 . 8 4 实验结果与分析讨论 . 8 4.1 抑菌圈的直径大小 . 8 4.2 微生物分析 . 8 4.2.1 细菌总数 . 8 4.2.2 大肠菌群数（最大可能数
3、 MPN） . 9 4.3 化学分析 . 10 - 3 - 4.3.1 pH . 10 4.3.2 TVB-N. 10 4.3.3 TMA . 11 4.4 感官分析 . 12 5 小结 . 12 参考文献 . 13 致 谢 .错误 !未定义书签。 1 生物防腐剂的筛选及其在水产品中的应用 摘要 我国是 一个 渔业 生产 大国 ， 我国是世界上唯一 的 养殖 产 量 高于 捕捞 产 量 的国家，我国 养殖产量占世界养殖总产量 的 70%以上 。水产品极易发生腐败变质，一旦腐败变质其新鲜度和营养价值就会受到很大的影响，从而使得其食用价值、营 养成分和经济价值受到很大的损失。因此，我们需要采取适当
4、的防腐保鲜措施以减少水产品的腐败变质，延长其货架期。近年来，随着人们生活水平和消费水平的提高，对食品的安全要求也越来越高，越来越多的人开始关注生物防腐剂，这主要归因于生物防腐剂具有高效、无毒副作用、适用范围广、性能稳定，对食品无污染等优点，这也就使得其逐渐成为食品工业研究应用的热点。 本文主要分析鱼虾类水产品易腐败变质的原因及控制因素，三 种 不同来源的 生物防腐剂对冷冻鱼糜的抑菌效果 ，采用空白对照实验，对一些指标如抑菌圈的大小、微生物总数、大肠菌群、 TVB-N、 pH、三甲胺等的比较测定，通过感官评定来确定最佳生物防腐剂以及最佳抑菌浓度。实验结果表明三种防腐剂对冷冻鱼糜制品都有一定程度的
5、防腐效果，壳聚糖为最佳防腐剂且其最佳防腐浓度为 0.3g/mL，抑菌效果最强，其对大肠杆菌的抑菌圈直径为15.2mm，感官评定总平均分为 4 分，评定结果为较好；其次是茶多酚 ,最佳抑菌浓度也为0.2g/mL，其对大肠杆菌的抑菌圈直径为 14.9mm,感官评定 总平均分为 3.67 分，评定 结果为一般； 最后是乳酸链球菌素 ,其最佳抑菌浓度为 0.3g/mL，对大肠杆菌的抑菌圈直径为 4.7mm，感官评 定 总平均分为 3.3 分，评定 结果为一般 。这为水产品的防腐保鲜提供一些参考。 关键词 生物防腐剂；茶多酚；壳聚糖；乳酸链球菌素；冷冻鱼糜 2 Biological preservati
6、ves screening and its application in aquatic products Abstract China is the only country which aquaculture production higher than the capture yield ,Chinas aquaculture production accounts for 70% of world aquaculture production. Aquatic is prone to spoilage,once its freshness and nutritional value w
7、ill be greatly affected, which makes its food value and economic value of nutrients by the great loss. Therefore, we need to take appropriate measures to reduce the Preservation seafood spoilage, extending their shelf life. In recent years, as peoples living standards and consumption levels of food
8、safety requirements have become more sophisticated, more and more people are concerned about preservatives, This is mainly attributed to the preservative with high efficiency, non-toxic effects, wide application, stable performance, pollution-free, etc., this also makes it become a hot research in t
9、he food industry. This paper mainly analyzes the reason of easy deterioration for the seafood fish and control factors, the effect of three different sources of biological preservative for frozen surimi bacteriostatic ,through the analysis of frozen surimi composition,we can found the affects of var
10、ious biological preservatives on frozen surimi.Throught the blank placebo-controlled trial, the determination of some targets such as the size of bacteriostatic circles、 the total sum of microbiology、 Coliform bacteria count 、TVB-N、 pH、 trimethylamine (TMA), in contrast to determining the optimal bi
11、ological preservative, the experimental results show that three biological preservative for frozen surimi products have a anticorrosive effect at certain degree ,the Chitosan is the best preservative and its best anticorrosive concentration is 0.3 g/mL, the bacteriostatic effect of e. coli bacterios
12、tatic circle diameter is 15.2 mm, sensory overall average scores four ,the results is good; following is tea polyphenols, the best bacteriostatic concentration is 0.2 g/mL of e. coli, the bacteriostatic circle diameter is 14.9 mm, sensory overall average scores 3.67, the results we points is general
13、; The last is nisin, its best bacteriostatic concentration is 0.3 g/mL for e. coli, bacteriostatic circle diameter is 4.7 mm, sensory scores 3.3 , results is average general . This provide some references to seafood antisepsis . this will provides some references for aquatic products corrosion. Key
14、words Preservatives; TP; chitosan; Nisin; frozen surimi. 3 1 前言 1.1 概述 我国是 一个 渔业 生产 大国 ，据资料显示， 2007 年我国一季度水产品出口额为 21.7 亿美元，同比增长 18.2%；与此同时，进口额为 10.5 亿美元，同比增长了 30.7%。与此同时， 我国 的 水产养殖 呈现 集约化和规模化快速发展 趋势 ，水产业进入快速发展 的 时期 。到 2010 年，我国水产品总产量达 5373 万吨，连续 20 多年世界第一。 我国是世界上唯一 的 养殖 产 量 高于捕捞 产 量 的国家，我国 养殖产量占世界养殖
15、总产量 的 70%以上 1，是世界上其他国家的总产量的两倍多 。 水产品极易发生腐败变质，一 旦腐败变质其新鲜度和营养价值就会受到很大的影响，从而使得其食用价值、营养成分和经济价值受到很大的损失。因此，为了减少运输过程和储藏过程中因腐败变质而造成的资源浪费和经济损失，我们需要采取适当的防腐保鲜措施以减少水产品的腐败变质，使其新鲜度得到更大程度的保持，延长其货架期。 1.2 生物防腐剂的性质特点及应用 生物防腐剂 即天然防腐剂， 主要包括一些有机酸、多肽类物质，是微生物在代谢过程中产生的一种抗菌物质，其作用机理主要是在微生物细胞膜上形成微孔，使细胞膜的通透性增大，同时其产生的能量也会给系统造成破
16、坏， 由于有 机酸、多肽类物质都很容易进入微生物细胞 ，因而其能快速抑制微生物的生长繁殖 2，从而达到抑菌的效果 。 生物防腐剂主要来源有三个方面： 一般来源于植物、动物及微生物三种，即植物源生物防腐剂、动物源生物防腐剂、微生物源生物防腐剂三大类。植物源生物防腐剂主要有茶多酚、香辛料、中草药等3，动物源生物防腐剂主要有壳聚糖、鱼精蛋白、蜂胶等，微生物源生物防腐剂主要有乳酸链球菌素（ Nisin） 4、纳他霉素 5、 聚赖氨酸 6 等。生物防腐剂在水产品防腐保鲜方面的应用我国还尚处于初步阶段，还有待于发展。 近年来，随着人们 生活水平和消费水平的提高，对食品的安全要求也越来越高，越来越多的人开始
17、关注生物防腐剂，这主要归因于生物防腐剂具有高效、无毒副作用、适用范围广、性能稳定，对食品无污染等优点，这也就使得其逐渐成为食品工业研究应用的热点，生物防腐剂将逐渐代替传统的化学防腐剂这是未来防腐剂发展的必然趋势。国内外对于生物防腐剂的研究是越来越重视，近年来，有不少关于这方面的研究报道，还有不少新型生物防腐剂被研究出来并应用到食品行业且取得了较好的效果。 茶多酚（ Tea polyphenol，简称 TP）是茶叶中多酚类物质的总称。经研究发现 绿茶中茶多酚 的 含量 比 较高 ， 占 到 其干重的 20%-30%7。 茶多酚的作用是除去活性氧，螯合金属离子，与氧化酶结合等 8，现在经常用于食品
18、的防腐保鲜中，并取得了较好的效果。 蒋建平等 人 9研究 发现 ，茶多酚对冷 冻 肉 制品 有 着 显著的 防腐 效果， 和 VE、 VC一起使 用时的 防腐 效果更好。 壳聚糖的防腐抑菌作用主要有两个方面：一是能在微生物的外表面形成一层膜，这层膜可抑制微生物的进入；二是其本身就能抑制某些微生物的生长繁殖。壳聚糖的来源很多，同时它还具备其它生物防腐剂所共有的成本低、无毒副作用，防腐效果较好等特点，而且又不会污染食品。近年来已成为国内外生物防腐剂研究的热点，目前已应用于肉类等食品中。段静芸等人 10研究表明壳聚糖脱乙酰程度越高，对冷冻肉制品的防腐效果就越好。乳酸链球菌素是由乳酸链球菌产生的一种多
19、肽类物质。乳酸链球菌素能抑制大部分的革兰氏阳性菌4 如：肉毒梭状芽孢杆菌、耐热细菌等的生长繁殖，而对酵母菌、霉菌等真菌却没有效果。乳酸链球菌素具有没有毒副作用、使用量少、防腐效果好等特点，愈来愈受到人们的关注。 在一般 情况下， 乳酸链球菌素 对 革兰氏阴性菌 G-菌 是无效的 ，然而，在加热、冷冻和 用 EDTA处理 的情况下，乳酸链球菌素 对大肠杆菌、沙门氏菌等 部分革兰氏阴性 菌 却很有效 11。 随着人们消费水平和生活水平的不断提高，对食品质量安全的要求也要严格，同时对食品的加工体系与消费形态也有了更高的要求，天然、安全、无污染的生物防腐剂将逐渐取代传统的化学防腐剂。来源于微生物的生物
20、防腐剂在水产品工业中的应用是最有发展前途的，这是因为微生物生长繁殖速度快，生产成本又要低，因此微生物来源的生物防腐剂可以进行工业化大生产 12。 生物防腐剂在水产品的应用与传统防腐方法相比，具有很多的优点，如对人体毒副作用小、对水产品的品质影响小等，所以受到了 人们的普遍重视和推崇 13。但目前生物防腐剂在水产品防腐保鲜的应用研究尚处于起步阶段且价格也较贵，所以国内外对该方面的研究还不多；同时，生物防腐对水产品的防腐效果的研究还只是在实验室水平，是否能够大规模的使用于水产品的防腐保鲜，还有待进一步的实验论证。因此，只有在保证食品食用安全的前提下，大力加强生物防腐剂对水产品的抑菌防腐效果及机理的
21、研究，才能为水产品防腐技术提供新的技术，保持水产品的鲜度、延长货架期，保持其食用价值，从而促进水产品经济效益的明显提高。相信未来，生物防腐剂在水产品的应用前景 14将会很 好。 1.3 水产品的性质特点 水产品主要有如下特点： 1.给人体提供丰富的维生素和矿物质等营养元素； 2.含不饱和脂肪酸（ EPA和 DHA）； 3.能提供卵磷脂（健脑）； 4 还能给人类提供优质蛋白质 。 近几年有 发现 在水产品中 富含 n 3 不饱和脂肪酸 以及 其 它 活性物质， 这些物质 对心血管 疾 病 很 有疗效的 ，愈来愈 受到人们的 青睐 。 鱼虾贝类 肉 组织比一般 的 动物 肉 组织 更 易 发生 腐
22、败 变质 ，其主要原因有： 鱼虾贝类中所 含水分 较 多，适合 于 细菌 的生长 繁殖； 鱼虾贝类 肉 组织 比较软 ，细菌 更 易分解； 鱼虾贝类死后， 在短时间内 呈 现 弱碱性， 这环境 适合 于 细菌 的 生长繁殖； 鱼虾贝类肉 本身 附着细菌的机会 就大 ， 而且 腐败后 很容易 接触到肌肉 组织而 引起腐败变质；对于虾、蟹之类的 甲壳 类水产品来 讲， 由于其肉质中存在 某些 蛋白酶，在保 藏 过程中 其 肉质会 产生 白浊 的 现象，风味 会 变差，肉质 也会 变软 ，较难 抑制微生物 的生长 繁殖，因此冷藏 的保藏 期也很短 15。鱼虾贝类 等 对储运 及 销售环境的要求 很
23、高，特别是在炎热的 夏季 ， 如果 不 采用 冷却措施，在销售过程中 就非常容易发生 腐败变质 ，从而造成巨大的经济价值损失和食用价值破坏 。 1.4 冷冻鱼糜的介绍 冷冻鱼糜是将原料鱼经过采肉、漂洗、脱水后，加入糖类 、磷酸盐等使蛋白质抗冻变性的添加剂，使其在低温下能较长时间 贮 藏的一种鱼糜制品。冷冻鱼糜具有蛋白 含量高 、脂肪低 、杂 质 少、口感 好 、弹性 强 等特点 ，鱼糜制品主要有 如鱼丸、鱼饼 、 鱼肉火腿、鱼香肠等深加工鱼肉产品 。 冷冻鱼糜加工技术， 使得 原料鱼肉蛋白质冷冻变性 的 问题 成功的 解决了 。 冷冻鱼糜是生产各类鱼糜制品的原料，它主要是通过漂洗 工序 除 掉
24、 色素、水溶性蛋白质等 物质 ，并添加糖5 类、多磷酸盐等 抗 蛋白质变性剂后冷冻贮藏。 本实验主要是研究不同浓度的茶多酚、壳聚糖、乳酸链球菌素三种防腐剂的防腐效果的比较，采用空白对照实验，通过一些指 标的测定比较，从而筛选出最佳防腐剂及最佳防腐浓度，并将它应用在水产品冷冻鱼糜中。 2 实验材料、主要仪器与试剂 2.1 实验材料 本实验所用 原料 为 定海 北门 菜 市场的鲜 海水鱼 ，原料获取后立即放入 04 冰箱中冷藏。 供试菌株包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌、蜡样芽胞杆菌、普通变形球菌，均有浙江海洋学院食品科学与工程实验室提供。 2.2 主要仪器 仪器名称 型号 厂
25、家 离心机 TGL-16C 上海安亭科学 仪器厂 生化培养箱 SPX 型 宁波江南仪器厂 恒温培养振荡器 ZHWY-100C 上海智城分析仪器制造有限公司 台式电子天平 TD3102 余姚金诺天平仪器有限公司 电热恒温水浴锅 HHS 型 上海棱光技术有限公司 立式杀菌锅 SB-2000 型 上海博迅实业有限公司 半微量定氮器 91676500 型 泰兴市创新化玻仪器有限公司 2.3 主要试剂 试剂 (规格 ) 厂家 乳酸链球菌素 浙江银象 生物工程有限公司 壳聚糖 宁波市镇海海鑫生物制品有限公司 茶多酚 南昌东盛化工 科技有限公司 蛋白胨 国药集团化学试剂有限公司 琼脂粉 国药集团化学试剂有限
26、公司 革兰氏染色试剂盒 青岛高科园海博生物技术有限公司 氧化镁 辽宁省营口仁恒镁业有限公司 2.4 培养基 2.4.1 营养琼脂培养基 取蛋白胨 10g，琼脂粉 20g， 5g 牛肉膏， 3g 酵母膏， 5g 氯化钠加入 1000mL水中，于微温下溶解，煮沸，滤清，调节 pH值至 7.00.2。于 121 灭菌 20min 后备用。 2.4.2 伊红美蓝琼脂（ EMB琼脂） 将 10g 蛋白胨、 2g 磷酸盐和 17g 琼脂溶解于 1000mL 蒸馏水中，校正 pH至 7.1，分装6 于锥形瓶内，于 121 下高压灭菌 15min。临用时加入 10g 乳糖并加热熔化琼脂，冷却至 5055 ，加
27、入 20mL2%伊红水溶液和 10mL0.65%美蓝溶液，摇匀，倾注平板。 2.4.3 乳糖胆盐发酵培养基 将 20g 蛋白胨， 5g 牛胆盐和 10g 乳糖溶于 1000mL 蒸馏水中，调 pH值至 7.4，加入0.6mL1.6%溴甲酚紫溶液，分装于试管，每管 10mL， 0.07MPa 下灭菌 15 20min。 3 实验方法 3.1 鱼糜的工艺流程 原料 前 处理 采肉 漂洗 脱水 精滤 斩拌、 擂溃 冻结 3.2 抑菌圈直径的测定 刮取适量用营养琼脂培养后的供试菌株的菌苔至无菌生理盐水中，制成含菌量为 5107-5 108CFU/mL 的菌悬液，分别取各供试菌液倒入营养琼脂平板培养基中
28、涂布均匀，用打孔器将滤纸打成直径为 8mm的小圆纸片，分别浸没到浓度为 0.1 g/mL、 0.2 g/mL和 0.3g/mL的茶多酚溶液、壳聚糖溶液 16和乳酸链球菌素溶液中浸泡 5min，取出沥去多余的茶多酚溶液、壳聚糖溶液和乳酸链球菌素溶液， 分散平贴于平板培养基中，细菌置于 37 培养 48h后测量抑菌圈直径大小。 3.3 挥发性盐基氮 TVB-N 的测定 17 采用 总 挥发性盐基氮 TVB-N 作为鱼糜腐败 变质 的化学指标。 TVB-N 的测定采用 半微量定氮法测定。 3.3.1 样品处理 称取鱼糜样品 20g，放入锥形瓶中，加入 100mL 蒸馏水，不时的振荡摇匀， 30min
29、 后过滤，滤液放入 04 冰箱备用。 3.3.2 蒸馏滴定 将冷凝管下端伸入到盛有 34 滴混合指示液和 10mL 吸收液的锥形瓶，使其下端没入吸收液的液面以下，准确吸取 10.0mL 上述样品的滤液于反 应室内，加入 10.0mL 的氧化镁混悬液（ 10g/L），迅速盖上瓶塞并加水，通蒸汽蒸馏 5min 停止，吸收液用盐酸标准溶液（ 0.010mol/L）或硫酸标准滴定液滴定，直到出现蓝紫色，并且 30s 不发生变化即可判定为滴定终点。同时做空白对照实验。 3.4 菌落总数和大肠菌群的测定 3.4.1 添加防腐剂 茶多酚：用少量 的蒸馏 水溶解后，在斩拌工序 中 加入，在配方中的浓度 分别
30、是 0.1g/mL，0.2 g/mL， 0.3 g/mL。 7 壳聚糖： 用少量 的蒸馏 水溶解后，在斩拌工序 中 加入 ，浓度分别是 0.1 g/mL， 0.2 g/mL，0.3 g/mL。 乳酸链球菌素 ： 用少量 的蒸馏 水溶解后 ， 在斩拌工序 中 加入，在配方中的浓度 分别 是0.1 g/mL， 0.2 g/mL， 0.3 g/mL。 在 实验中，每种防腐剂按 照 3 种不同浓度单独使用于 冷冻 鱼糜中， 这步过程是在在斩拌工序中加入，且 斩拌 要 均匀，按鱼糜 的 生产工艺制成 鱼糜 成品。成品在常温下保存，每 5 天抽 取 1 次 样品 分别检测细菌总数和大肠杆菌个数。每次指标测
31、定两次，取平均值作 为实验 结果。 3.4.2 菌落总数的测定 微生物菌落总数的测定包括间接法和直接法，其中直接法计算的含有活菌和死菌，而间接法 只计活菌，因此本实验采用稀释涂布法这一间接法对鱼糜制品中的细菌总数进行测定。 将 20g 鱼糜放于无菌研钵 中切 碎研细，加入 180mL 的 无菌生理盐水，充分研磨 配制成1:10 的稀释液 ，摇匀备用 。 用 1mL 灭菌 的 吸管吸取 1mL 的上述 稀释液， 加 入 9mL 灭菌 的 生理盐水， 缓慢 振 荡 摇匀 试管， 使其 均匀混合， 配 成 1:100 的稀释液。 再 取 1mL 灭菌 的 吸管，按 照前面的 操作 顺序 做 10 倍
32、 的 递增稀释 液， 做 3 个稀释度。在做稀释度的同时，移 取 1mL 的待测 稀释液于 已倒有营养琼脂的 培养皿 中 ，每个稀释度做两个 平板取平均值，于 30 的 恒温箱内 倒置 培养24h，培养结束后， 选取菌落数在 30300 之间的平板为菌落总数测定标准，记下各平板 中 的菌落数后，求出同 一 稀释度的各 个 平板 的 平均菌落数。 3.4.3 大肠菌群的检验 乳糖发酵试验： 取 1mL 灭菌吸管，将 前述的 稀释液接种 至 乳糖胆盐发酵管内， 置于 37恒温 培养 箱内培养 24h， 每一 个 稀释度接种三管， 观察是否产气。 分离试验： 将 所有 产气的发酵管分别 划线接种到
33、伊红美蓝琼脂 （ EMB 琼脂） 平板上 ，36 1 培养 18-24h，观察菌落形态。 证实实验： 在平板上挑取可疑 的 大肠菌群菌落 1-2 个进行革兰氏染色 观察 ，同时接种 到乳糖发 酵管 ， 36 1 培养 24 2h，观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌即可报告为大肠菌群阳性。 根据证实 实验 为大肠菌群阳性的管数 ， 查 阅 MPN（最大可能数） 检索表 ， 即每 100mL 大 肠菌群的 MPN 值。 3.5 三甲胺 TMA 的测定 本实验利用 “强酸滴定一元弱碱”原理 19，采用化学滴定法进行三甲胺含量的测定，具体为：取 20g 鱼糜制品捣碎，加入 180mL 蒸馏水，用盐酸标准溶液（ 1.000mol/L）（ 取一支洁净的 20mL移液管，用硼砂标准溶液洗涤 3次。准确移取 20.00mL硼砂标准溶液于 250mL洁净的锥形瓶中，加入甲基红指示剂 2 滴，用待定的盐酸溶液滴定，至溶液颜色由黄色转变为橙色 30s 不退色，即为滴定终点。记录所消耗盐酸的体积，平行滴定 3-4 次。计算盐酸溶液的浓度。 ）滴定鱼糜样品溶液，从而测得三甲胺的摩尔数。
