1、 本科毕业论文 （ 20 届） 苏云金芽孢杆菌壳聚糖酶水解作用研究 所在学院 专业班级 食品科学与工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 目录 1 前言 3 1.1 壳聚糖 3 1.2 壳寡糖 3 1.3 壳聚糖酶 3 2 材料和仪器 4 2.1 实验材料 4 2.2 主要仪器 5 3 实验方法 5 3.1 还原糖的测定 5 3.2 粘度的测定 7 3.3 不同结构壳聚糖对酶促反应的影响 7 4 结果与分析 8 4.1 酶的用量对酶促反应的影响 8 4.2 底物浓度对酶促反应的影响 8 4.3 反应时间对酶促反应的影响 9 4.4 反应温度对酶促反应的影响 10 4.5 反应
2、pH 对酶促反应的影响 10 4.6 金属离子对酶促反应的影响 11 4.7 酶促反应过程中粘度的变化 11 4.8 不同结构壳聚糖对酶促反应的影响 12 5 结论 12 参考文献 13 致谢 错误 !未定义书签。 1 苏云金芽孢杆菌壳聚糖酶水解作用研究 摘要 壳聚糖酶是专一性降解壳聚糖产生壳寡糖的水解酶，壳聚糖酶可有广泛的微生物产生。本论文在已经筛选得到产壳 聚糖酶的苏云金芽孢杆菌和分离纯化得到壳聚糖酶的基础上，对苏云金芽孢杆菌壳聚糖酶水解壳聚糖的作用影响因素进行研究，并对酶促反应动力学和酶促反应的特性进行研究。结果表明苏云金芽孢杆菌壳聚糖酶 适宜水解的温度条件为55 ；适宜水解的反应时间为
3、 34h，适宜水解的反应 pH 为 5.05.5，在这个 pH 条件下，底物壳聚糖也更容易溶解和降解； Ca2+、 Zn2+对酶促反应有一定的促进作用，而 Hg2+对该反应有明显的抑制作用 。 通过测定酶促反应过程中粘度的变化，表明苏云金芽孢杆菌壳聚糖酶 可能以内切的方式作用水解壳聚糖。 本论文为明 确苏云金芽孢杆菌壳聚糖酶的酶学特性和性质和为探索壳聚糖酶促水解适宜的条件提供基础和依据。 关键词 壳聚糖；水解；壳聚糖酶； 苏云金芽孢杆菌 2 Characterization of chitosan hydrolysis by the chitosanase from Bacillus thur
4、ingiensis Abstract Chitosanase is an enzyme that can hydrolyse various types of links in chitosan. Chitosanase can be produced by various microorganisms. In our previous study, the isolate from Bacillus thuringiensis which can produce chitosanase were screen and chitosanase was produced and purified
5、. The effects of reaction temperature, reaction time, pH and amount enzyme on the hydrolysis of chitosan by chitosanase from Bacillus thuringiensis was investigated in the present study. The results showed that he optimum temperature and pH of chitosanase from Bacillus thuringiensis was 55 C and 5.0
6、5.5, respectively. The optimum reaction time was 34h. The activity of chitosanase from Bacillus thuringiensis was markedly enhanced by Ca2+ and Zn2+. Howerver, The activity of chitosanase from Bacillus thuringiensis was significantly inhibited by Hg2+. The chitosanase from Bacillus thuringiensis cou
7、ld hydrolyze the chitosan by endo-splitting manner. This study would provide theoretical foundation for optimintion of hydrolysis of chitosan by the chitosanase from Bacillus thuringiensis. Key words Chitosan; Hydrolysis; Chitosanase; Bacillus thuringiensis 3 1 前言 1.1 壳聚糖 壳聚糖 (chitosan)是目前研究最多的多糖类分子
8、，由几丁质 (chitin)经脱乙酰作用得到，是甲壳素最基本、最重要的衍生物。纯净的壳聚糖为白色粉末或片状固体，比重 0.3，常温下能稳定存在。由于其化学性质较为活泼，可以发生多种化学反应，因而在化妆品、医药、农业、环保等多个领域中被广泛应用 1。 1.2 壳寡糖 壳寡糖 2(Chitooligosaccharides，简称 COS)，学名 -1， 4-寡糖 -葡萄糖胺，壳聚糖经降解后得到的产物 。 与壳聚糖相比， COS 具有水溶性较好、功能作用大、生物活性高等优点，且溶解度较高，易被生物体吸收。研究证明： COS 具有提高免疫，抑制癌肿细胞生长，促进肝脾抗体形成，促进钙及矿物质的吸收，增殖
9、双歧杆菌、乳酸菌等人体有益菌群，降血脂、降血压、降血糖、调节 胆固醇 ，减肥，预防成人疾病等功能，因此 COS 在医药、功能性领域均受到广泛关注。 1.3 壳聚糖酶 在获取壳寡糖的工艺中，酶降解因其作用条件温和，产率高，对环境无污染一直是首选方式 3，制备时用到的壳聚糖酶是一种专一性降解壳聚糖的新酶。 壳聚糖酶的发现来源于 Monaghan4在研究真菌和细菌的过程中偶然提出的，当时的定义是对线性的壳聚糖具有专一的水解性，此后在 1992 年国际酶学会议上被系统命名。 壳聚糖酶分布广泛，主要存在于细菌 (如 Myxobacter,Aporocy top age,Arty robacter)、放线
10、菌、真菌 5(如 Rhizopus, Aspp errgillus)中。 根据酶的产生特点，可将壳聚糖酶分为诱导型和组成型，大多数的壳聚糖酶属于诱导酶，在适当的底物浓度条件下大量合成，而在正常的细胞代谢过程中，微量或不合成。而根据酶对壳聚糖的作用方式，可将壳聚糖酶分为外切酶 6和内切酶。大多数壳聚糖酶属于内切酶，降解壳聚糖生成壳二糖、壳三糖等寡聚体的混合物。 壳聚糖分子量在 2350kD7之间，一般来说，从微生物中提取的壳 聚糖酶分子量为2000040000，也存在少数高分子量壳聚糖酶，如曲酶 Aspergillus fumigatus。壳聚糖酶大部分为碱性蛋白，等电点 （ pI)变化范围较大
11、，大多集中在 4.010.1。大多数微生物的壳聚糖酶4 具有较好的热稳定性，在 3060， pH8为 6.08.0时反应最稳定，而金属离子尤其是重金属离子对壳聚糖酶活性有不同程度的影响，将壳聚糖酶用螯合剂、烷化剂和多种金属离子进行处理，发现螯合剂、烷化剂对酶活都没有影响，而金属离子中只有 Co2+9能够抑制酶的活性。 在工业上主要用于 COS的制备， COS在前文中已提到，因其有较好的水溶性更利于人体吸收，在食品工业、医药、功能性领域有着诱人的前景，而酶降解制备 COS法有着其他方法比如酸降法制备 COS所不能比拟的优点，因此使用专一性的壳聚糖酶生产 COS已经成为研究的热点。壳聚糖原料来源广
12、泛，其降解产物 COS的应用前景宽广，而通过采用专一的壳聚糖酶进行降解能有效利用底物，并且作用条件温和、反应易控制、对环境无污染，随着研究的深入，壳聚糖酶的应用将更加高效，从而给生产带来更大的效益。 国内关于 壳聚糖酶 的研究较少，研究者们筛选得到一系列产细壳聚糖酶的 菌株如曲霉10、青霉菌 11、和细菌属假单孢菌，并对这些 壳聚糖酶 进行了分离 12-16、纯化和性质鉴定。本 论文在已经筛选得到产壳聚糖酶的苏云金芽孢杆菌和分离纯化得到壳聚糖酶的基础上，对苏云金芽孢杆菌壳聚糖酶水解壳聚糖酶的作用影响因素进行研究，并对酶促反应动力学和酶促反应的特性进行研究，旨在明确苏云金芽孢杆菌壳聚糖酶的酶学特
13、性和性质， 并 为探索壳聚糖酶促水解适宜的条件奠定基础。 2 材料和仪器 2.1 实验材料 2.1.1 原料 壳聚糖酶（苏云金芽孢杆菌提取，由浙江海洋学院食品与药学学院、医学院陈小娥老 师实验室提供）；不同粘均分子量壳聚糖（由浙江海洋学院食品与药学学院、医学院陈小娥老师实验室提供）。 2.1.2 主要试剂 试剂 纯度 产地 壳聚糖 酶 酶活力 5 104 U/g 上海生化试剂厂 壳聚 糖 分析纯 NOVO 公司 乙醇 分析纯 宜兴市化学试剂三厂 碳酸钠 分析纯 宁波市化学试剂厂 氢氧化钠 分析纯 中国上海试剂总厂 铁氰化钾 分析纯 中国医药上海化学试剂公司 硫代硫酸钠 分析纯 中国医药上海化学
14、试剂公司 醋酸 分析纯 中国医药上海化学试剂公司 淀粉 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 盐酸 分析纯 国药集 团化学试剂有限公司 氯化钡 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 氯化 钙 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 硫酸锌 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 5 硫酸镁 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 硫酸铜 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 硫酸铁 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 氯化 汞 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 碘化钾 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 碘化汞 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 醋酸铅 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 硫酸锌 分析纯 国药集团化学试剂有限公司
15、 硫酸钠 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 铁氰化钾 优级 纯 国药集团化学试剂有限公司 重铬酸钾 优级 纯 国药集团化学试剂有限公司 2.2 主要仪器 仪器名称 型号 厂家 电热恒温水浴锅 HHS 上海博讯实业有限公司医疗设备厂 电子天平 TD 型 余姚金诺天平仪器有限公司 旋转蒸发仪 N-1000D-WA 型 日本 EYELA 公司 电热恒温鼓风干燥箱 DGG 9140A 型 上海齐欣科学仪器有限公司 高速离心机 TG16-WS 上海卢湘仪离心机仪器有限公司 精密 pH 计 pHS-3C 型 上海精密科学仪器有限公司 分光光度计 UV2100 型 尤尼柯（上海）仪器有限公司 电子天平 BS
16、110S 型 背景赛多利斯仪器系统有限公司 低温超速离心机 GR21G HITACHI CENTRIFUGE 3 实验方法 3.1 还原糖的测定 （ 1）测定方法：夏费 索姆吉法 （ 2）方法原理：还原糖与已知过量的铁氰化钾碱性溶液作用，生成亚铁氰化钾和糖酸： 而过量的铁氰化钾在 HOAc 存在下与 KI 作用，生成游离的 I2： 6 2Fe(CN)63-+2I-HOAcI2+2Fe(CN)64- 为方便此反应完全，加入 ZnSO4 溶液以沉淀除去反应产物 3Fe(CN)63-： 2Zn2+Fe(CN)64-Zn2Fe(CN)6白色沉淀 最后用标准 Na2S2O3 溶 液滴定生成的 I2，以淀
17、粉为指示剂 I2+2S2O32-=S4O63-+2I- 根据空白滴定和样品滴定所消耗铁氰化钾结果的差值，进一步换算成样品消耗的准确的0.0500molL-1K3Fe(CN)6 的 mL 数，再从 下表 查出相应的萄萄糖 mg 数。 0.0500mol L-1K3Fe(CN)6 的 mL 数和其相当的葡萄糖的 mg 数 mL 1/10 mL 数 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 0 - - - - - 0.725 0.87 1.015 1.18 1.34 1 1.51 1.67 1.83 2.00 2.16 2.31 2.47 2.62 2.78 2
18、.94 2 3.10 3.26 3.42 3.58 3.74 3.90 4.06 4.22 4.38 4.54 3 4.72 4.88 5.04 5.20 5.36 5.53 5.70 5.86 6.03 6.20 4 6.37 6.54 6.71 6.88 7.05 7.22 7.39 7.55 7.72 7.89 5 8.06 3.22 8.39 8.56 8.72 8.89 9.06 9.22 9.39 9.55 6 9.72 9.89 10.06 10.23 10.41 10.58 10.75 10.92 11.10 11.28 7 11.46 11.64 11.82 12.00 12
19、.18 12.36 12.54 12.73 12.91 13.10 8 13.28 13.46 13.63 13.80 13.97 14.14 14.31 14.49 14.66 14.83 9 14.99 - - - - - - - - - （ 3）试剂配制： 0.0500molL-1 铁氰化钾：准确称取 105 烘干 K3Fe(CN)6(优级纯 )15.4700g 和无水Na2CO3(分析纯 )70g 溶于水后洗入 1L 容量瓶中，定容，保存于棕色瓶中。 0.05molL-1 硫代硫酸钠：称取 Na2S2O35H2O(优级纯 )12.5g 溶于刚煮沸冷却的水中，加入 Na2CO3 约 0.
20、1g，稀释至 1L，保存于棕色瓶中，一天后进行标定。准确称取重铬酸钾 (优级纯 )0.1g 于 250mL 三角瓶中，加水 30mL 使溶解，加入 KI 1.5g 和 6molL-1HCl 5mL，在暗处放置 5min 后，再加入 50mL，用 Na2S2O3 溶液滴定， 当溶液由棕红色变浅黄色时，加入淀粉指示剂 1mL，继续滴定至溶液由蓝色突变为亮绿色 (Cr3+的颜色 )为终点。按下式计算出 c Na2S2O3 标准溶液的浓度 (molL-1)。 c Na2S2O3=K2Cr2O7(g)/(294.19/6000V Na2S2O3) 10gL-1 淀粉指示剂：可溶性淀粉 1g 和碘化汞 (
21、HgI2，作防腐用 )5mg，用少量水调匀后，缓缓倾入 100mL 沸水中，继续煮沸至溶液变透明止。 7 ZnSO4-KI 混合液：称取 ZnSO47H2O 31.25g 溶于水，稀释至 500mL，称取 KI12.5g 溶于水，稀释至 100mL，贮于暗处。临用前按 4 体积的 ZnSO4 与 1 体积 KI 比例混合，当天使用。 90gL-1 醋酸：量取 37%HOAc 260mL 稀释至 1L； 饱和 Na2CO3 溶液 ； 100gL-1 中性醋酸铅溶液 ； 饱和硫酸钠溶液 。 3.1.1 酶的用量对酶促反应的影响 采用反应温度 55 ， pH5.0，底物浓度 0.25mmol/L，反
22、应时间 30min，分别加入不同量的壳聚糖酶液，测定释放出的还原糖量。 3.1.2 底物浓度对酶促反应的影响 采用反应温度 55， pH5.0，加入壳聚糖酶，反应 30min，分别用底物浓 度为 1.0， 2.0，3.0， 4.0， 5.0mg/mL 壳聚糖溶液，测定释放出的还原糖量。 3.1.3 反应时间对酶促反应的影响 采用反应温度 55， pH5.0，底物浓度 2.0mg/mL，加入壳聚糖酶，分别反应 15min， 30min，60min， 120min， 180min，测定释放出的还原糖量。 3.1.4 反应温度对酶促反应的影响 采用反应温度 55， pH5.0，底物浓度 2.0mg/
23、mL，加入壳聚糖酶，反应时间 30min，分别在 30， 40， 50， 60， 70下进行，测定释放出的还原糖量。 3.1.5 反应 pH 对酶促反应的影响 采用反应温度 55，底物浓度 2.0mg/mL，加入壳聚糖酶，反应时间 30min，分别在 pH为 4.0， 4.5， 5.0， 5.5， 6.0 的条件下进行，测定释放出的还原糖量。 3.1.6 金属离子对酶促反应的影响 采用反应温度 55 ， pH5.0，底物浓度 2.0mg/mL，加入壳聚糖酶，反应时间 30min，配置含一定浓度的 Ca2+， Pb2+， Zn2+， Fe3+， Cu2+， Hg2+离子溶液，测定释放出的还原糖量
24、。 3.2 粘度的测定 使用 HAAKE粘度仪 (RV-12)采用 2号转子，剪切速率为 256r/min，达到设定温度后，将 1.5%壳聚糖溶液 40mL加入到 0.1mL纯酶液中，测量开始，仪器自动记录读数，在 10min内完成，计算酶的初解速度 vi，以 mpa s/min为单位，对照实验用水代替酶液。粘度降低百分比 (VDP)的计算公式： VDP=(V0-Vi)/V0，其中 V0为初始粘度， Vi为 5min后的粘度值，并减去空白对照的相应值。 3.3 不同结构壳聚糖对酶促反应的影响 采用反应温度 55， pH5.0，底物浓度 2.0mg/mL，加入壳聚糖酶，反应时间 30min，选8
25、 取 3 种不同分子量和结构的壳聚糖作为底物，测定 释放出的还原糖量。 4 结果与 分析 4.1 酶的用量对酶促反应的影响 00.050.10.150.20.250.30.350 2 4 6 8 10 12 14酶底比（U/m L）还原糖浓度（mmol/L）图 1 酶的用量对酶促反应的影响 从图 1 可以看出，酶底比越大，还原糖浓度也越高。酶底比为 4U/mL 时，还原糖浓度为 0.05mmol/L，当酶底比达到 12U/mL 时，还原糖浓度为 0.33mmol/L。当底物浓度一定时，随着酶底比的增加，也就是酶量的增加，还原糖产生的量也就越多，二者基本呈线性关系（ y = 0.0351x - 0.1029）。 4.2 底物浓度对酶促反应的影响 0204060801001201401 2 3 4 5 61/S(L/g)1/V(minL/mol)图 2 底物浓度对酶促反应的影响
