1、 本科毕业论文 （ 20 届） 赤魟软骨血管生成抑制因子的制备 所在学院 专业班级 药学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 2 目 录 摘要 .4 关键词 .4 1 前言 .6 2 实验材料与仪器 .6 2.1 原料 .6 2.2 试剂 .6 2.3 仪器 .7 3 实验方法 .7 3.1 分离提取赤魟总蛋白 .7 3.2 紫外吸收法绘制蛋白标准曲线并测定蛋白质含量 6.7 3.3 抗氧化活性测定 .8 3.3.1 清除 DPPH 自由基的能力测定（ DPPH 法） 7 .8 3.3.2 还原能力的测定（铁氰化钾还原法） 8.8 3.3.3 清除羟自由基能力的测定（邻二氮菲 F
2、e2+氧化法） 9-11 .8 3.4 离子交换层析 12 .8 3.4.1 cellulose ED-52 部分参数 .8 3.4.2 实验步骤 .9 3.4.3 电泳实验 13 .9 3.5 凝胶过滤层析 14 . 11 3.5.1 Sephadex G-75 的预处理 . 11 3.5.2 安装层析柱 . 11 3.5.3 填装 . 11 3.5.4 平衡 . 11 3.5.5 上样 . 11 3.5.6 洗脱 . 11 3.5.7 收集 . 11 3.5.8 保存 . 12 3.5.9 电泳实验 . 12 3.6 DAFN 抑制鸡胚绒毛尿囊膜 CAM 血管生成的测定 15. 12 4
3、结果与分析 . 12 4.1 抗氧化活性测定 . 12 4.1.1 60%硫酸铵提取物与 100%硫酸铵提取物 DPPH 清除率的比较 . 12 4.1.2 60%硫酸铵提取物与 100%硫酸铵提取物羟自由基清除能力的比 较 . 12 4.1.3 60%硫酸铵提取物与 100%硫酸铵提取物还原力的比较 . 12 4.2 离子交换层析 . 13 4.2.1 紫外检测 . 13 4.2.2 抗氧化能力 . 13 4.2.3 高效液相分析 . 13 4.2.4 电泳实验分析 . 14 4.3 凝胶过滤层析 . 14 4.3.1 紫外检测数据 . 14 4.3.2 抗氧化能力 . 14 4.3.3 高
4、效液相分析 . 15 4.3.3 电泳实验分析 . 15 3 4.4 DAFN 抑制鸡胚绒毛尿囊膜 CAM 血管生成的测定 . 16 5 小结 . 17 5.1 硫酸铵分级沉淀 . 17 5.2 柱层析方法 . 17 5.3 抗氧化活性研究 . 17 5.4 新生血管生成抑制因子 . 17 参考文献 . 18 致 谢 . 错误 !未定义书签。 附录 英文翻译 . 错误 !未定义书签。 附录 英文原文 . 错误 !未定义书签。 4 赤魟软骨血管生成抑制因子的制备 摘要 目的：从赤魟软骨中分离纯化出具有较强抗氧化活性的蛋白，并对其抑制新生血管的能力进行比较分析。方法：将赤魟软骨粉碎后离心，用 (N
5、H4)2SO4 分级沉淀得粗蛋白，通过离子交换层析和凝胶层析进行分离纯化， 电泳检测蛋白分子量，用 DPPH 清除率、羟自由基清除率、还原力比较分段部位和单体的抗氧化蛋白活性，比较其对鸡胚绒毛尿囊膜 CAM 血管生成的抑制程度。结果：经过分离纯化，得到了赤魟软骨血管生成抑制因子（ DASN），提取率为 1009 : 1； 12%的 SDS-PAGE 电泳结果所示，考马斯亮蓝染色显示为单一条带，证明已达到电泳纯，根据标准蛋白质的迁移率，测得其分子量为 58.2 kDa；运用 CAM 活性抑制模型进行药理学研究分析发现， 8 g DASN 对新生血管的抑制率已经高达 82.7%，表明 DASN 能
6、显著抑制 CAM 膜新生 血管生成，并且抑制效果具有一定的浓度依赖性； DPPH 清除率、羟自由基清除率、还原力三种体外抗氧化实验显示， DASN 的清除率分别为 84.41%、 59.13%、 0.262。结论：本实验运用多种现代分离技术从赤魟中分离得到的 DASN 具有显著的血管生成抑制作用，是抗肿瘤新药研发的重要资源。 关键词 赤魟；新生血管抑制因子；抗氧化 5 Preparation of neovascularization inhibitor factor from Dasyatis akajei Abstract： Objective: The angiogenesis inhi
7、bitors was isolated and purified from Dasyatis akjei, and its antioxidant activities and angiogenesis inhibiting effect were also evaluated. Methods: The cartilage of Dasyatis akjei was chopped and extracted. The supernatant was collected and centrifuged. The crude protein was fractioned through pre
8、cipitation with ammonium sulfate and centrifugation. The sediments were collected, dialyze and lyophilized. The following purification was done by DE-52 Sepharose ion-exchange column chromatography. The final purification was done by Sephadex G-75 repeatedly until the electrophoresis pattern was fou
9、nd only one band. The antioxidant activities were evaluated through DPPH/hydroxyl radical-scavenging activity and reducing power. The anti-angiogenesis activity was investigated by inhibiting the formation of the blood vessels of the chick embryo chorioallantoic membrane (CAM). Results: Angiogenesis
10、 inhibitor was separated and purified from the cartilage of Dasyatis akjei. The extraction rate of DASN was 1009: 1； The purified DASN was homogeneous as a single band on a coomasie brilliant blue- stained 12 % SDS-PAGE gel electrophresis. According to the migration rate of standard protein, the mol
11、ecular weights of DASN is 58.2 kDa； With CAM activity inhibition model, the inhibition rate of DASN was up to 82.7% at the concentration of 8g, and the dosages of angiogenesis inhibitor correlated with the inhibitory effect of angiogenesis in the CAM； Through DPPH/hydroxyl radical-scavenging activit
12、y and reducing power, the in vitro antioxidant activities of DASN were 84.41%, 59.13% and 0.262, respectively. Conclusion: In the experiment, the angiogenesis inhibitor from the cartilage of Dasyatis akjei showed significant angiogenesis inhibiting effect, and it was known as a kind of important res
13、ource for researching anticancer drugs. Key words： Dasyatis akjei； neovascularization inhibitor factor； antioxidant 6 1 前言 海洋覆盖着地球表面积的 71%，是生命的发源地。地球上现存的 300 500 万种生物中海洋生物占 80以上，据统计，已知的海洋生物大约有 300000 种，而且这些已知种可能仅仅只占所有海洋生物种类的一小部分，海洋所具有的这种物种多样性构成了抗肿瘤天然药物资源化学多样性的基础 1。同时，由于海洋存在许多极端环境，如高压 (深海 )、低温 (极地、深海
14、 )、高温 (海底火山口 )和高盐等，使得海洋生物也随之产生了与陆地生物不同的代谢途径和机体防御机制。迄今海洋生物中已发现三千余种新型活性物质 2，其中包括生物碱类、萜类、大环聚酯类、肽类、聚醚类及多糖类等化合物。也已证实，不少海洋生物活性物质具有抗肿瘤、抗病毒、抗真菌、抗艾滋病、抗心脑血管疾病、抗老年痴呆症以 及抗疲劳、增强免疫、延缓衰老等功效。同时，海洋生物蛋白资源无论在种类还是在数量上都远远大于陆地蛋白资源。因此，海洋生物是新型药物的重要分子库，从海洋生物及其代谢产物中筛选和提取具有特异化学结构的天然活性物质成为抗肿瘤药物开发的重要来源。 肿瘤的靶向治疗是近几年抗肿瘤药物研发的重要方向。
15、新生血管生成作为抗肿瘤药物的重要靶点，近年来受到国内外的广泛关注 3。恶性肿瘤的新生血管生长活跃，依靠丰富毛细血管网提供活跃代谢环境，肿瘤得以快速生长和转移。阻断肿瘤的血管生成成为新型抗肿瘤药物研究的重要方向。此外还有其他多 种病理过程与新生血管过度增生有关，如：慢性感染、特异性免疫反应等。因而抑制新生血管生长，对上述疾病的治疗，尤其恶性肿瘤的防治具有重要意义。 自 1975 年 Brem 和 Folkman 研究发现软骨能抑制肿瘤新生血管生长以来，许多研究者已从多种动物的软骨中发现有分子量不等的抑制肿瘤生长的活性因子存在 4，如 10-14 ku U-995，18 ku SCAIF-1， 8
16、0 ku SCAIF-80 等，都具有一定的血管生成抑制活性，其中绝大部分来自于鲨鱼软骨。赤魟与鲨鱼同属软骨鱼类，软骨成分大致相同，赤魟软骨含量占其体重的 17 % ，远高于鲨鱼软骨占其体重的比例 (8 %)，其资源也较鲨鱼资源丰富。在我国各海区均有分布，主要分布于我国东海、南海及其它沿海，长江口咸淡水中亦有，属于暖水性底层鱼类。但是国内有关海洋抗肿瘤活性物质的研究水平相对落后， 对于赤魟软骨蛋白的研究报道并不多见。了解其在国外的研究进展、加强我国对其研究和开发的工作，对于有效利用海洋生物资源，开发出具有我国自主知识产权的抗肿瘤新药有着十分重要的理论意义和实际价值。 本实验以赤魟软骨为原料，利
17、用硫酸铵沉淀法、透析提离子交换柱层析和凝胶柱层析等技术提取活性蛋白并分 析其体外抗氧化作用，为其保健及治疗作用提供了一定的药理基础。 2 实验材料与仪器 2.1 原料 自舟山水产市场购得赤魟， 种属由浙江海洋学院赵盛龙教授鉴定， 用手术刀剔除鱼肉，得到软骨。 2.2 试剂 填料 Sephadex G-75、 DEAE-52 抗氧化的试剂 DPPH、乙醇、磷酸盐缓冲液、铁氰化钾、三氯乙酸（ TCA）、三氯化铁、邻二氮菲、硫酸亚铁、 H2O2 电泳试剂 丙稀酰胺、甲叉双丙 烯 酰胺、甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷（ Tris）、 SDS、过硫酸铵、 TEMED(甲基乙二胺， N,N,N,N-tetram
18、ethyl ethylenediamine)、蔗糖、琉基乙醇、 溴 酚蓝、盐酸、低相对分子质量标准蛋白质含有 6 种已知相对分7 子质量的蛋白质组合试剂 (上海生物化学研究所 ) 其它 磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、硫酸铵、氢氧化钠 、乙醇、新洁尔灭、硫酸软骨素 2.3 仪器 仪器名称 型号 厂商 恒流泵 BT 1-100 上海琪特分析仪器有限公司 自动部份收集器 BSZ-100-LCD 上海琪特分析仪器有限公司 梯度混合器 TH-1000A 上海琪特分析仪器有限公司 紫外分光光 度计 U2800 日本日立紫外可见分光光度计有限公司 低温冰柜 BC/BD-220GS 海尔 低温高速离心机 C
19、R21G 日本日立 超声波清洗器 SK5200H 上海科技超声仪器有限公司生产 冷冻干燥机 FD-1000 上海爱朗仪器有限公司 真空干燥箱 DZF-6050 上海精宏实验设备有限公司 隔水式恒温培养箱 GNP-9080 上海精宏实验设备有限公司 手提式压力蒸汽灭菌锅 YSQ 上海华线医用仪器有限公司 超纯水系统 Milli-Q50 美国 Millipore 公司 高速组织 捣 碎机 DS-1 上海标本模型厂 电泳仪 041BR 美国 Bio-rad 公司 高效液相 Agilent-1200 美国 Agilent 公司 电子天平 TP320 上海民桥精密科学仪器有限公司 电热恒温水浴锅 HWS
20、12 上海一恒科技仪器有限公司 超级恒温槽 SC-15 宁波江南仪器厂 3 实验方法 3.1 分离提取赤魟总蛋白 用手术刀将赤魟软骨剪成小块，洗净，称重为 1970 克。再用组织粉碎机将其捣碎，匀浆，加入 2 倍体积 (W/V)的 PBS（ pH =7.4； c=0.02 molL-1），静置于 4 环境中提取 24 小时，低温离心（参数设定： 5000rmin-1， 20min）。 在离心所得上清液中逐次加入饱和度分别为 60%和 100%的 (NH4)2SO4 进行分级沉淀 5，于 4 环境中静置 12 小时后，用低温高速离心机离心，得到 (NH4)2SO4 饱和度为 60%和 100%时
21、所析出的两种不同的沉淀。将沉淀溶解于 PBS（同上）中，于 4 环境中用蒸馏水透析过夜，离心得上清液，将其冷冻干燥。最后得 60%(NH4)2SO4 沉淀蛋白 17.78 克， 100%(NH4)2SO4 沉淀蛋白 10.96 克。 3.2 紫外吸收法绘制蛋白标准曲线并测定蛋 白质含量 6 蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在 280nm 处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比，且各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大，因此紫外吸收法是测定蛋白质含量最常用的法。 配置 0.25mg/mL、 0.50 mg/mL、 0.75
22、 mg/mL、 1.0 mg/mL、 1.25 mg/mL 牛血清白蛋白标准液， 8 y = 0.6808x - 0.05R2= 0.999100.10.20.30.40.50.60.70.80.90 0.25 0.5 0.75 1 1.25 1.5浓度m g / m l吸光度(A)以试剂为空白参比于 280 nm 处测其吸光度， 以浓度 (C)为横坐标，吸光值 (A)为纵坐标，绘制标准曲线（图 1）。得到 回 归 方 程 为 ：A=0.6808C-0.05 R2=0.9991，该方 程 在 所 测 范 围 内（ 0.25-1.25mg/mL）线性关系良好。 3.3 抗氧化活性测定 3.3.1
23、 清除 DPPH 自由基的能力测定（ DPPH 法） 7 制备 0.02% DPPH99.5%乙醇溶液（用 100mL99.5%的乙醇溶解 0.02gDPPH）。 DPPH 自由基清除能力按照 1998 年 Bersuder， Hole and Smith 描述的方法进行。 对照： 500L蒸馏水 + 125L浓度为 0.02%DPPH99.5%乙醇液 + 500L乙醇； 样品： 500L样品 + 125L浓度为 0.02% DPPH99.5%乙醇液 + 500L乙醇； 空白： 500L样品 + 125L乙醇 + 500L乙醇。 把混合物在暗室室温下放置 60 分钟，然后测定在 517nm 处
24、吸光值。自由基清除率按照下面公式计算：清除率 %=(对照 +空白 -样品 )/对照。 （注：样品指 0.2 mg/mL、 0.4 mg/mL、 0.6mg/mL、 0.8 mg/mL、 1.0mg/mL 的 60%(NH4)2SO4提取物和 100%(NH4)2SO4 提取物） 3.3.2 还原能力的测定（铁氰化钾还原法） 8 制备磷酸盐缓冲液 (pH =6.6； c=0.2 molL-1)、 1%铁氰化钾、 10%三氯乙酸（ TCA）、 0.1%三氯化铁。还原力测定按照 Oyaizu(1988)方法进行。 分别取 2mL 0.2 mg/mL、 0.4 mg/mL、 0.6mg/mL、 0.8
25、 mg/mL、 1.0mg/mL 的 60%(NH4)2SO4提取物和 100%(NH4)2SO4 提取物于试管中，依次加入磷酸盐缓冲液 2 mL、 1% 铁氰化钾 2mL，充分混匀后在 50 保 温 20 分钟，接着加入 2 mL 10% 的 TCA 充分混匀，离心后取出 2 mL 上清液混合物于试管中，加入 2 mL 蒸馏水和 0.4 mL 0.1% 三氯化铁（ FeCl3）于试管中，反应10 分钟，在 700 nm 处测定吸光值，吸光值高表明还原力高。 3.3.3 清除羟自由基能力的测定（邻二氮菲 Fe2+氧化法） 9-11 制备 0.75mmol/L 邻二氮菲、 PBS（ pH =7.
26、4； c=0.02 molL-1）、 0.75mmol 硫酸亚铁、 0.12%H2O2。分别取 1mL 0.2 mg/mL、 0.4 mg/mL、 0.6mg/mL、 0.8 mg/mL、 1.0mg/mL 的60%(NH4)2SO4 提取物和 100%(NH4)2SO4 提取物， 1mL0.75 mmol/L 的邻二氮菲溶液于试管中，依次加入 2 mLPBS、 1 mL 蒸馏水，充分混匀后，加入 1 mL 0.75 mmol/L 的硫酸亚铁溶液，混匀，加入 1 mL 质量分数为 0.12%的 H2O2，于 37 水浴 90 min，于 536 nm 处测其吸光度为As；用 1mL 蒸馏水代替
27、 1mL H2O2 作为 Ab；用 1 mL 的蒸馏水代替样品溶液作为 Ap。 样品对羟自由基清除率 =(As-Ap)/(Ab-Ap)100% 3.4 离子交换层析 12 3.4.1 cellulose ED-52 部分参数 英文名称 DEAE cellulose DE-52 图 1 牛白蛋白标准曲线 9 CAS 号 9000-11-7 功能团 二乙氨乙基 正常 PH 范围 2 9.5 小离子电量 0.88 1.08meg/dg (dg=dry gram，千克重 ) 蛋白容积 700mg/dg（蛋白体积是指 0.01M ph8.5 磷酸缓冲液 牛血清白蛋白） 蛋白容积 /柱体积 130mg/m
28、L 每升所需的离子交换剂柱床体积 0.90（离子交换剂重量的数 字考虑到溶胀，容易去除及使用过程中离子离子交换剩余颗粒） 填料密度 0.19dg/mL（填料密度的状态为 0.05M PH7.5磷酸缓冲液） 性状 干燥细结晶或纤维状 用途 用于柱色谱分析，以分离提纯多糖、肽、核苷酸、酶、血清组分和病毒等，阴离子交换填料 保存 RT 3.4.2 实验步骤 3.4.2.1 DEAE-52 的预处理 取 0.5 molL-1 氢氧化钠溶液 500 mL，撒入 DEAE-52 30g，混匀，室温放置 2h（间歇轻微搅拌），倒去上清液，重复操作 1 次。水洗 2 次至中性。再用 500 mL 0.5 mo
29、lL-1 盐酸溶液清洗2 次（方法同上）。水洗 2 次至中性。 3.4.2.2 安装层析柱 清洗所以组件，将柱顶与泵相连，柱底部与自动收集器相连接，垂直安装在铁架台上。 3.4.2.3 填装 控制柱底流速，倒入适量蒸馏水；将处理好的 DEAE-52 与 PBS（ pH =7.4； c=0.02 molL-1）搅匀，用玻璃棒引流沿壁慢慢倒入柱中，待悬浊液装满整个柱子，停倒，等液面下降适当高度，再继续添加；当沉降面接近标准高度时，注意倾倒流速，防止冲击沉降面而影响其平整度；最后用 PBS 灌满柱剩下容积 。启动泵， 以 2mL/min 冲压柱子直至柱体积恒定（一般 45min），柱体积约为 250
30、mL。 3.4.2.4 平衡 用约 540 mL（ 约 柱体积的 2 倍）的 PBS 冲柱以平衡 DEAE-52。 3.4.2.5 上样 用适量 PBS 溶解冷冻干燥的粗蛋白，控制蛋白浓度约为 50mg/mL，上样 3mL。 3.4.2.6 洗脱 分别以 0.1 molL-1 、 0.5 molL-1 的 NaCl-PBS 溶液阶梯洗脱 2 倍柱体积，流速 1mL/min。 3.4.2.7 收集 设定自动收集器的参数，每 3min 换管 1 次，即 10mL 一管 。 3.4.2.8 保存 将所得样品灌入透析袋， 于 4 环境中用蒸馏水透析过夜。冷冻干燥。保存。 3.4.3 电泳实验 13 3
31、.4.3.1 制备电泳试剂 10 （ 1）低相对分子质量标准蛋白质含有 6 种已知相对分子质量的蛋白质组合试剂 (上海生物化学研究所 )：按说明书要求开管分装，即每个包装加人 200L去离子水充分溶解，然后分装于 20个小塑料离心管， -20 保存。分装后每份体积 10L，每种标准蛋白的含量为 2g，用时按下述待侧样品的加热变性处理。 （ 2）待测蛋白质样品：取蛋白样品 0.5mg，加入 0.01 mol/L 磷酸缓冲液 (pH=7.0)溶解。以下同标准蛋白质一样，加入等体积的样品缓冲液，混匀，在沸水浴中加热 3 min，待电泳时用于上样。 （ 3） 30%丙烯酞胺凝胶贮液：称取 29g 无结块的丙烯酞胺 (Acr,aerylamide)和 1g 甲叉 -双丙烯酸胺 (Bis,N,N一 me
