1、 本科毕业论文 （ 20 届） 复合酶解制备海蜇抗肿瘤肽活性研究 所在学院 专业班级 药学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 - 1 - 目录 1 前言 .3 2 实验材料与仪器 .4 2.1 材料与试剂 .4 2.2 主要仪器 .4 3 实验方法 .4 3.1 海蜇活性肽的制备 .4 3.2 分离、纯化海蜇抗肿瘤活性肽 .5 3.3 海蜇抗肿瘤肽的活性测定 .5 4 实验结果及讨论 .6 4.1 分离纯化 .6 4.2 海蜇初 酶解液的抗肿瘤活性测定 .6 4.3 海蜇复合酶解液的抗肿瘤活性测定 .8 5 小结 . 11 参考文献 .12 1 摘要 目的： 从海蜇 ( Rho
2、pilem aesculentum)中分离纯化活性肽，并研究其抗肿瘤活性。方法： 海蜇经碱性蛋白酶初酶解、胰蛋白酶二次酶解后得复合酶解液，将酶解液、复合酶解液分别离心，收集上清液得海蜇活性肽粗品。粗品经超滤、 SephadexG-15 凝胶层析、冷冻干燥纯化得海蜇抗肿瘤活性肽，通过 MTT 法测定了初酶解产物对人前列腺癌细胞、肺癌细胞体外增殖的影响，以及 复合酶解产物对人前列腺癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞体外增殖的影响。 结果： 从海蜇中分离纯化得到多种活性肽， MTT 法表明了海蜇初酶解产物对肿瘤细胞的增殖有较强的抑制作用，复合酶解产物对肿瘤细胞具有抑制作用并有明显的量效依赖关系。结论： 复合
3、酶解制备的活性肽对肿瘤细胞有抑制作用。 关键词 海蜇；复合酶解；抗肿瘤；活性肽 2 Study on anti-tumor activity of the peptide Purified From jellyfish by composite enzymatic hydrolysis Abstract Objective: To isolate and purify the peptide from the jellyfish (Rhopilem aesculentum), and investigated its anti-tumor activity. Methods: First, j
4、ellyfish was hydrolysed by the alkaline protease enzyme and trypsin, we can get the enzyme solution, and after centrifugal the two kinds of enzyme solution, jellyfish crude peptides can be got by collectting the supernatant. Then, crude product was purified by ultrafiltration, SephadexG-15 gel chrom
5、atography, and freeze-drying and would to be the peptide with anti-tumor activity. Last, by MTT method, the enzymed solutions influence on the proliferation in vitro of human prostate cancer, lung cancer cells was determined, as well as complex hydrolysates effect on proliferation of human prostate
6、cancer, lung cancer cells and gastric cancer cells in vitro was determined, too. Results: From the jellyfish a variety of active peptides can be isolated and purified,and MTT method showed that the enzyme products effect on tumor cell proliferation was strongly inhibited and the compound hydrolyzate
7、 can inhibit the tumor cells with a significant dose dependent. Conclusion: The activie peptide prepared by composite enzymatic hydrolysis inhibited tumor cells. Key words jellyfish； composite enzymatic hydrolysis; anti-tumor； active peptides 3 1 前言 恶性肿瘤是严重危害人类健康的重大疾病，已成为我国人口死亡的最主要原因之一。2005 年全球共有约 7
8、50 万人死于恶性肿瘤，我国每年约有 130 万人死于癌症，并且发病率呈逐年上升趋势。药物治疗是恶性肿瘤综合疗法中的一种重要方法，传统的抗癌药物研究主要着重于细胞毒药物的研发，细胞毒类抗肿瘤药物是目前化学治疗的一种主要手段，并在未来的相当长时期内仍将占据主导地位 。近年来，生命科学的迅速发展为肿瘤治疗提供了许多新的、令人感兴趣的肿瘤治疗途径，肿瘤的血管系统、癌基因产物及信号转导通路成为抗癌药物作用的新靶点 1。 海洋是一个巨大的天然产物宝库 ,约占地球表面积 71%。据估计约有 50 余万种动物和13000 余种植物栖息于海洋环境之中 ,海洋生物物种数量远高于陆地生物。生长在海洋特殊环境 (高
9、盐、高压、缺氧、缺少光照等 )中的海洋生物 ,在它们的生长和代谢过程中 ,会产生大量具有特殊化学结、构特殊生理活性功能的物质， 对新药的研发具有诱人的应用前景 2。 1968 年美国国家癌症研究院 (NCI)对海洋生物资源的抗癌活性筛选使海洋药物的研究成为一个独立的领域，由海洋生物中发现具有独特抗肿瘤作用的新药引起世界各国的极大兴趣，各国对海洋生物抗肿瘤进行了大量的研究 3。目前经 FDA 批准进入临床研究的抗肿瘤药物中有 10 余种来源于海洋。根据其作用机理，海洋抗肿瘤药物涵盖干扰 DNA 大分子合成的药物、影响微管聚合的药物、以抑制新生血管形成为靶点的抗肿瘤药物以及作用于细胞周期的药物等
10、4。其抗肿瘤作用机理复杂多样，已发现的抗肿瘤作用的海洋活性物质已有上百种。因此，海洋抗肿瘤抑制剂的研制开发 具有广阔的前景。 海蜇 ( Rhopilem aesculentum)俗称 “鮓鱼 ”，隶属于腔肠动物门 (Coelentera)，钵水母纲(Scyphozoa)，根口水母目 (Rhizostomeae)，根口水母科 (Rhizostomatidae)，海蜇属 (Rhopilema)的无缘膜动物。海蜇的蛋白质占其干重 的 50，其氨基酸成分种类齐全，必须氨基酸含量丰富 5。已有研究表明，海蜇对高血压、慢性气管炎、哮喘、热痰咳嗽、胃溃疡、单纯性甲状腺肿和颈淋巴结肿等有一定疗效。 海蜇作为一
11、种医食兼用的海洋生物，其营养与药效功 能已被大量文献记载 6。 海蜇中具有各种功效的主要是肽类物质，即生物活性肽（ biologically active peptides,简称 BAPP）。 生物活性肽是一类具有优化机体代谢环境、有益于机体健康的活性 多肽。 具有抗肿瘤效果的生物活性肽又称抗肿瘤肽。 如今酶解蛋白来源正从陆地生物向海洋生物转变，多种海洋生物蛋白被酶解，提取出了具有抗氧化、抗肿瘤、降血压、抗凝血等多种生物活性功能的多肽 生物活性多肽抗肿瘤作用研究一直是国内外研究热点，已从多种陆地生物及海洋生物中分离出了抗肿瘤多肽，部分已应用于临床 人们。现如 今所提取的抗肿瘤蛋白主要有从海鞘、
12、海绵、软体动物、珊瑚中提取的环行多肽，从贝类、海参、乌贼墨等中提取的糖蛋白，还有从海藻、 鲎 、鲨鱼软骨中提取的多肽 7-9。 而在活性多肽的提取方法上，目前的研究已越来越多地集中在蛋白酶解上。 目前，已经有人从海蜇头、腕部制备了降血压肽，并且对其降血压功能进行了检测，也有人将制备提取的降血压肽做成口服液。但是对于酶解制备海蜇蛋白抗肿瘤活性肽的研究4 尚较少。因此，针对目前海洋活性肽开发的瓶颈和贻贝活性肽的研究现状，本实验采用复合酶解的方法得到海蜇粗品，通过膜分离技术、葡聚糖凝胶柱 层析技术等方法从海蜇酶解物中分离、纯化得海蜇活性肽，继而采用 MTT 法测定海蜇活性肽对人前列腺癌细胞、肺癌细胞
13、、胃癌细胞体外增殖的影响，为海蜇多肽的抗肿瘤活性提供依据，从而对海蜇的深度开发和利用提供参考。 2 实验材料与仪器 2.1 材料与试剂 海蜇，购自舟山市场，用温水浸泡洗涤以除去明矾和盐分并沥干，切成条状，于水中浸泡 12h 左右，取出沥干，放入 DS-1 高速组织捣拌机中捣碎匀浆， -20 冷藏备用；胎牛血清，购自杭州四季青生物工程有限公司；胰蛋白酶、 碱性蛋白酶， 购自于北京亚太恒信生物科技有限公司 ； F12 粉末培养 基和 MTT 试剂，均购自美国 SIGMA 公司； SephadexG-15 凝胶，购自上海如吉生物科技发展有限公司； 二甲基亚砜，购自美国 AMRESCO 公司； 选取人
14、前列腺癌细胞 PC-3，肺癌细胞 H1299，胃癌细胞 MGC-803，原购自中科院上海细胞库，由本实验室传代保存； 其余试剂均为 分析纯； 2.2 主要仪器 BSA124S 型电子天平， 购自 德国 Sartorius AG 公司； DS-1 型高速组织捣碎机， 购自 上海标本模型厂； CF16RXII 高速冷冻离心机， 购自 日立 HITACHI 公司； SSW 型微电脑电热恒温槽， 购自 上海博迅 实业有限公司医疗设备厂；膜过滤装置，购自上海摩速仪器有限公司； RE-2000A 旋转蒸发仪，购自上海亚荣生化仪器厂； 722S 可见分光光度计， 购自 上海恒平科学仪器有限公司； PHS-2
15、5C 酸度计，购自上海理达仪器厂； 85-2 恒温磁力搅拌器，购自常州国华电器有限公司； ZHJH-C1209C 型超净工作台， 购自 上海智诚分析仪器制造有限公司； Forma 3111 型 CO2 培养箱， 购自 美国 Thermo 公司；倒置显微镜， 购自 日本 OLYMPUS公司；酶标仪， 购自 美国 Bio-Rad 公司。 3 实验方法 3.1 海蜇活性肽的制备 3.1.1 样品预处理 用温水浸泡洗涤海蜇以除去明矾和盐分，沥干后切成条状，于水中浸泡 12h左右，取出5 再沥干，捣碎匀浆。另外，用氢氧化钠和浓盐酸配置 pH10.5的缓冲液，备用。 3.1.2 制备海蜇活性肽 10 将海
16、蜇匀浆用 PH为 10.5的缓冲液溶解（料水比为 1： 2），并用氢氧化钠溶液调节混合液PH到 10.5，然后加入适量 碱性蛋白酶 （ 加酶量为 1000 U/g） ，于 pH10、 55 条件下酶解 4h，将酶解液加热至 95 100 灭酶 15min，在初酶解液中加入适量胰蛋白酶 （ 加酶量为 1000 U/g） ，于 pH8.1、 37 条件下酶解 3h ，将复合酶解液加热至 95 100 灭酶 15min，然后将酶解液在 4 以 9000 r min-1 离心 20 min ，收集上清液，置入大烧杯中，进而使用旋转蒸发仪对复合酶解液进行旋蒸浓缩，将样品量浓缩至原体积的三分之一左右，将浓
17、缩液置于 4冷藏箱中 保存。 3.2 分离、纯化海蜇抗肿瘤活性肽 3.2.1 酶解液的初 步分离 (超滤 ) 本实验采用截取分子量为 3K、 5K、 10K的 3种膜进行超滤，将初酶解液和复合酶解液分别通过超滤膜 ,，得到 4种不同分子量的酶解液，分别为分子量 3k、 3k 5k、 5k 10k、10k，将各组分冷冻干燥为海蜇活性肽粉末。先将初酶解活性肽粉末作为抗肿瘤的样品，初步确定各组分抗肿瘤肽的活性，然后再测定复合酶解获得的多肽进行抗肿瘤活性测定，并对最佳活性肽组分进行大规模的初步收集。 3.2.2 SephadexG-15 凝胶层析 11 SephadexG-15 凝胶柱主要用于分离分子
18、量 1500 的样品。将 SephadexG-15 凝胶颗料装柱，完毕后用去离子水平衡，然后将选取组分海蜇复合酶解活性肽粉末用去离子水溶解稀释后作为样品上样，紫外分分光光度计 280nm 下进行检测，以去离子 水 3ml/min 进行洗脱，并收集洗脱液，根据吸光度将每个峰的洗脱液汇集，将得到的各主要峰进行抗肿瘤实验，确定各主要峰的抗肿瘤作用。 3.3 海蜇抗肿瘤肽的活性测定 3.3.1 细胞培养 选取人前列腺癌细胞 PC-3，肺癌细胞 H1299，胃癌细胞 MGC-803（原购自中科院上海细胞库，由本实验室传代保存），用含 10%胎牛血清的 RPMI1640 完全培养基于 37 ， 5% CO
19、2 培养箱中培养至对数生长期。 3.3.2 海蜇初酶解液、复合酶解液对肿瘤细胞增殖抑制率的测定 12-14 配置不同浓度 的 海蜇初酶解液和复合酶解液 ，取 对数生长期的细胞制成悬液 ， 接种至96 孔板 ，每孔 200 L，于 5% CO2， 37 培养 24 h，然后分别 加入 1mg/ml、 5mg/ml、 10mg/ml、6 15 mg/ml 、 20mg/ml 等浓度的海蜇酶解溶液，每个浓度设 3 个平行孔，同时设不加药对照组 ， 置 5% CO2， 37 培养箱中 孵育 48 h， 培养结束加 MTT 继续培养 4 h， 用 PBS 清洗孔板，加入 DMSO150ml，振荡 10m
20、in，置 酶联免疫检测仪在 490nm 测吸光度 ， 计算细胞增殖抑制指数（ IR），计算公式如下： IR=(对照组 A 值 -加药组 A 值 )/对照组 A 值 100% 4 实验结果及讨论 4.1 分离纯化 海蜇 复合 酶解液经超滤后分为 4 种不同分子量的酶解液， 分别为 3k、 3k 5k、 5k 10k、 10k， 对其 10k图 2 超滤分离海蜇初酶解液各组分对 PC-3 细胞增殖抑制指数 01020304050607080901001 5 10 15 20海蜇肽浓度（m g / m l ）细胞增殖抑制指数IR（%）10k图 3 超滤分离海蜇初酶解液各组分对 H1299 细胞增殖抑
21、制指数 由图 2、图 3 可以看出，经碱性蛋白酶酶解获得的海蜇多肽粗品对人前列腺癌 PC-3 细胞、肺癌 H1299 细胞体外增殖具有显著而强烈的抑制作用。并且，分子量 3k 的海蜇多肽粗品对上述两种肿瘤细胞体外增殖的抑制作用最强，其中， 分子量 3k 的海蜇多肽液20mg/ml 浓度时对前列腺癌 PC-3 细胞体外增殖的抑制指数高达 95.49%，对肺癌 H1299 细胞体外增殖的抑制指数约为 79.54%， 而分子量 10k 的海蜇多肽液对这两种肿瘤细胞体外增殖的抑制作用比较差，甚至未达半数抑制率。 经过对海蜇初酶解液抗肿瘤活性的测定，表明海蜇多肽确实具有抗肿瘤活性，这就为我8 们接下来的
22、将海蜇匀浆进行复合酶解并测定其抗肿瘤活性奠定了基础，另外，这次的实验结果告诉我们，分子量 3k 的海蜇多肽液抗肿瘤效果最好，这也为我们接下来将海蜇复合酶解液粗品中分子量 3k 的样品进行了葡聚糖凝胶柱层析纯化、进一步研究其抗肿瘤活性提供了依据。 4.3 海蜇复合酶解液的抗肿瘤活性 测定 将复合酶解所得的海蜇多肽液分为 1mg/ml、 5mg/ml、 10mg/ml、 15 mg/ml 、 20mg/ml 5个 浓度，分别检测其对 人前列腺癌细胞 PC-3、肺癌细胞 H1299、胃癌细胞 MGC-803 体外增殖的影响 ， 结果如下 : 0102030405060701 5 10 15 20海蜇肽浓度（m g / m l ）细胞增殖抑制指数IR（%）10k图 4 超滤分离活性肽各组分对 PC-3 细胞增殖抑制指数 0102030405060701 5 10 15 20海蜇肽浓度（m g / m l ）细胞增殖抑制指数IR（%）10k图 5 超滤分离活性肽各组分对 H1299 细胞增殖抑制指数 殖抑制指数IR（ %）
