1、 本科毕业论文 （ 20 届） 基于贻贝与大豆蛋白的生物胶黏剂研究 所在学院 专业班级 药学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 - 2 - 目 录 摘要 . 错误 !未定义书签。 Abstract .3 1 前言 .5 2 实验材料、主要仪器与试剂 .6 2.1 实验材料 .6 2.2 主要仪器 .6 2.3 主要试剂 . 错误 !未定义书签。 3 实验方法与 步骤 .7 3.1 工艺流程 .7 3.2 贻贝粗蛋白提取 . 错误 !未定义书签。 3.3 贻贝 -大豆蛋白复合胶黏剂的制备 . 错误 !未定义书签。 3.3.1 尿素浓度对大豆蛋白质胶黏剂的胶粘能力影响 .8 3.3
2、.2 碱尿复合变性剂对大豆蛋白胶黏剂的胶粘能力的影响 .8 3.3.3 考察不同比例混合的 大豆蛋白和贻贝蛋白胶 .8 3.3.4 搅拌时间对复合胶黏剂的影响 .8 3.4 木板样品的制备 .8 3.5 粘度的测定 .8 3.6 胶粘强度的测定 .9 4 实验结果及讨论 . 错误 !未定义书签。 4.1 不同尿素浓度变性大豆胶黏剂粘度性能测定 . 10 4.2 不同 pH 下尿素浓度变性大豆蛋白胶黏剂性能测定 错误 !未定义书签。 4.3 不同比例贻贝 -大豆复合胶黏剂性能测定 . 错误 !未定义书签。 4.4 不同搅拌时间的贻贝 -大豆复合胶黏剂性能测定 . 错误 !未定义书签。 5 结论
3、. 错误 !未定义书签。 参考文献 . 错误 !未定义书签。 - 3 - 基于贻贝和 大豆 蛋白的生物胶黏剂研究 摘要 目的： 主要是 研究 在 强 碱性条件下 用 尿素诱导大豆蛋白质的分子变性，然后再向其中引入贻贝蛋白 结 构 ，得到一种新型的贻贝 大豆蛋白复合胶黏剂。 方法： 首先选择不同的浓度的尿素变性大豆蛋白质，筛选出最佳尿素浓度；然后加入氢氧化钠，配置不同 pH 下的碱尿复合变性剂，诱导大豆蛋白质变。第三，在按上述实验筛选出的最佳条件， 在 配制 好 碱尿复合变性剂加入 按 不同比例混合的贻贝蛋白和大豆蛋白 粉 ，制备最佳贻贝 大豆复合胶黏剂。 结果： 当尿素浓度为 3mol/L，p
4、H=10.5，大豆蛋白和贻贝蛋白粉以 4： 6 混合，室温下 用 恒温 磁力搅拌 3h，得到的混合胶黏剂胶粘强度最佳， 结论 : 通过该方法制备的贻贝 -大豆蛋白复合胶黏剂，胶粘强度高，耐水 性好，该方法操作方便，设备要求简单 ，适合工业生产。 关键词 大豆蛋白 ;贻贝 蛋白 ;碱尿复合变性剂 ; - 4 - Study on mussels and soybean protein biological adhesive AbstractThis paper studied the effect of the urea modification on adhesion strength and
5、 viscosity of soy protein isolates (SPI) in a strong alkali conditions. Use of urea change the molecular structure of SPI in a strong alkali conditions, then introduce the mussels protein make a new type of Mussels -SPI composite adhesive. first, examining the effect of different urea concentration
6、on adhesive strength and viscosity of SPI. The urea concentration is confirmed, then add the sodium hydroxide, equipped with different pH of alkaline-urea composite degeneration agent, to induct SPI change. According to the above experiment, and to mix the different mixing ratio of soybean protein a
7、nd protein powder into alkaline-urea composite degeneration agent, to produce the Mussels-SPI composite adhesive. The results showed that When urea concentration is 3mol/L, pH=10.5, soybean protein and mussel protein powder mixed with 4:6, get mixture 3h mixed, at room temperatu- re, achieved the be
8、st adhesive effect. so, through using the method of the preparation of mussels-soybean protein composite adhesive, high strength, good water resistance, this method is simple and convenient operation, equipment requirements for industrial production. Keywords:Soy protein isolates; Mussel protein; Ca
9、ustic soda- Urea modification; - 5 - 前 言 近年来自然灾害频发，环境问题凸显，人类对环境问题更加关注，世界各国对不可再生的石油等战略资源的争夺不断升级，局部战争不断。所以寻找和开发可替代石油以及以石油为基础的新能源、新型 化工产品的研究，再次成为当今科技的主题和热点。 一直以来合成胶黏剂都是以 石油为基础开发的 ，尽管它们 粘接性能良好，也有很好的耐热，耐水性，但其主要的缺点在于：在使用过程中会释放酚类物质和含甲醛类物质，这些物质都会破坏环境，对人体造成伤害，且石油资源属于不可再生资源，随着时间推移，石油开采过度，石油数量减少，以它为基础开发的合成胶黏剂的
10、价格必将快速上升；同时当今社会利用大宗农产品加工后的副产物，开发可再生，可生物降解，低造价，对环境友好的新型生物胶黏剂来代替以石油为基础的传统高污染，高成本，低附加值的胶黏剂，以减 少对化石资源的过分依赖，减轻环境污染的压力，促进农副产品向高附加值的生物质资料转化，同时减缓木材资源的开发压力成为研究的热点 1。 蛋白质胶粘剂是一种以蛋白质作为主要原料的胶粘剂。按蛋白质原料的来源不同，可分为动物性蛋白质胶粘剂（如血胶、干酪素胶、皮骨胶等）和植物性蛋白质胶粘剂（如豆粉胶、豆蛋白胶等）两类 4。蛋白质作为胶粘剂 使用由来已久。早在公元前 3000 4000 年古埃及人就开始使用鸡蛋、动物胶等作胶粘剂
11、，广泛用于建筑领域。在北魏贾思勰著齐民要术中也记载了用动物皮 “煮胶 ”及其质量控制方法 5。 蛋白质胶黏剂的原料都是可再生资源，对环境没有污染，调胶设备简单，调制和使用方便，干状胶胶合强度较好，能满足一般室内使用的人造板的粘结要求。大豆蛋白是大宗农产品大豆加工中产生的主要副产物，是一种优良的植物性蛋白质，大豆资源丰富、品质优良、价格低廉，资料显示大豆蛋白总量约占全球植物蛋白蕴藏和消费总量的 60%，且我国大豆资源十分丰富，产量居世界第四位，使得大豆蛋白成为基于可再生资源、环保型天然胶粘剂最为理想的研究对象 6 。 但是， 大豆蛋白属于球形蛋白 (globulin)， 它的耐水性和耐热性均不理
12、想。 而且蛋白胶粘剂的粘接强度还取决于蛋白质在水中的分散能力以及蛋白质中极性和非极性基团与木材的交联能力，未改性的蛋白质由于范德华力和分子间氢键和疏水键的作用，大多数的极性和非极性基团没有活性，所以由大豆蛋白直接制得的胶粘剂胶粘性比较差，适用范围有限。 所以可以通过化学改性、破坏和解开蛋白内部氢键或者打开蛋白分子肽链，也可以通过调整 pH值到 10以上使蛋白子分子水解，使其极性基团暴露，增强蛋白质的分散和伸展程度。氢氧化钠等强碱就可以很好的展开蛋白质分子，暴露蛋白质分子的极性和非极性基团，而这些基团可以和木材 分子进行交联从而提高粘接强度和耐水性 3。 生活在广袤的海洋中的贻贝类生物可以通过其
13、足部分泌的使其牢固贴附在船底，海岸礁石，以及其它的海洋生物表面。研究表明这种粘附能力主要是因为贻贝含有 6 种不同的具有黏附能力的蛋白 ( footprotein 1-6, fp-1- fp6) 42 。这些黏附蛋白中含大量的多巴 ( DOPA, L-3, 4-二羟基苯丙氨酸 )，多巴的苯酚基团具有很强的金属螯合能力，可以在金属类材料表面形成不可逆的有机金属络合物，多巴还能与蛋白质等极性聚合物形成很强的氢键，部分多巴氧化生成 邻位二醌，通过共轭加成反应与 Lys 和 Cys 之间产生共价交联，进一步增加它的内聚力，多巴通过其高亲和力和化学的多功能性实现了从有机物到金属等不同材料表面的黏附功 1
14、6。 .Akemi 等 15发现合成含多巴的多肽能通过多巴的儿茶酚氧和第 1 位氨基吸附在胶体金表面，也说明多巴是贻贝蛋白黏附的分子基础。 综上所述，本研究考虑在碱性条件下，用尿素诱导大豆蛋白分子变性，展开大豆蛋白质分子结构，然后引入贻贝蛋白 分子 ，通过贻贝体内的多巴作用和大豆蛋白质分子之间形成稳固的结合，得到一种新型具有高强度、高韧性、强防水性以 及强黏附能力的贻贝 大豆蛋白复合生物胶黏剂。 - 6 - 2 材料与方法 2.1 实验材料 大豆分离蛋白（蛋白含量 90%），黑龙江双河松嫩大豆生物有限责任公司 大豆浓缩蛋白（蛋白含量 70%），黑龙江双河松嫩大豆生物有限责任公司 大豆低温蛋白（
15、蛋白含量 54%），黑龙江双河松嫩大豆生物有限责任公司 贻贝购于本地市场， 樱桃木 购于本地市场 2.2 主要仪器 仪器名称 型号 /规格 厂家 恒温水槽 ZD-420 宁波江南仪器厂 恒温磁力搅拌器 Feb 85-2 型 常州国华电器有限公司 恒温干燥箱 DHG-9023A 上海一 恒科学仪器有限公司 电子天平 BSA 323S 型 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司 超声波清洗器 SK5200HP 上海科导超声仪器有限责任公司 托盘药物天平 BP- 型 上海精密科学仪器有限公司 高速冷冻离心机 CF16RX 日本日立 旋转粘度计 NDJ79 型 NDJ 同济大学机电厂 微机控制电子万能实验机
16、 WDT-10 型 深圳市凯强利机械有限公司 2.3 主要 试剂 试剂 厂家 尿素 （分析纯 ） 国药集团化学试剂有限公司 NaOH （分析纯 ） 国药集团化学试剂有限公司 98%BIT （分析纯 ） 上海晶纯试剂有限公司 磷酸氢二钠 Na2HPO412H2O （分析纯 ） 中国上海试剂总厂 磷酸二氢钠 NaH2PO42H2O （分析纯 ） 中国上海试剂总厂 硫酸铵 (NH4)2SO4 （分析纯 ） 中国上海试剂总厂 - 7 - 3 实验步骤 3.1 设计 工艺流程 剔肉匀浆 2 倍体积 PBS 缓冲液 4 ，提取 24h 过量 (NH4)2SO4 盐析 冷冻干燥 3.2 贻贝粗蛋白提取 贻贝
17、洗净用手术刀剔肉，称取 200g，加少量 0.02molL-1 PBS（ pH7.4）缓冲溶液（以下简称 PBS）用组织捣碎机捣碎；加入 2 倍体积 (W/V)的 PBS 缓慢搅拌 30min， 4 提取 24h。 4 离心两次，转数分别为 5000rmin-1， 14000 rmin-1，时间分别为 15 min， 20min 取上清液，即为贻贝粗提物，测量体积；取贻贝粗提液，在冰浴条件下，缓慢加入过量 (NH4)2SO4 细颗粒，边加边搅拌。待 (NH4)2SO4细颗粒完全溶解，静置 24h， 14000 rmin-1 低温高速离心，得贻贝（ NH4)2SO4 沉淀蛋白。沉淀用 2倍体积
18、(W/V)的 PBS 溶解， 4 ， PBS 透析过夜，冷冻干燥成粉。放于冰箱备用 3.3 贻贝 大豆蛋白复合胶黏剂的制备 新鲜贻贝 贻贝组织液 98%BIT 大豆蛋白 贻贝粗蛋白 碱尿复合变性剂 贻贝蛋白粉 贻贝 大豆蛋白 复合胶黏剂 贻贝粗提物 - 8 - 3.3.1 尿素浓度考察 在室温下配制尿素溶液（ 1mol/L、 3mol/L、 5mol/L），尿素溶液的浓度是基于前人的研究选择的，将 5g 大豆分离蛋白分散在 50 mL 尿素溶液中，加入防腐剂， 0.1%BIT（ V/m， m 为胶黏 剂质量） 室温下用恒温磁力搅拌器搅拌 3 小时，转速为 1400 r/min， 使其充分反应。
19、 设置一个空白对照组，直接将 5g 大豆分离蛋白分散在 50 mL 水中，加入 0.1%BIT 室温下用恒温磁力搅拌器搅拌 3 小时，转速为 1400 r/min,使其充分反应。 3.3.2 pH 对胶黏剂胶粘强度的影响 在其他条件不变的情况下，按实验 3.2.1 配制最佳尿素溶液，并用 0.5mol/L 氢氧化钠溶液将尿素溶液 pH 分别调节至 8， 9， 10， 11， 12，配制成碱尿复合变性剂。向 5g 大豆分离蛋白中加入 50mL的碱尿复合变性剂， 0.1%BIT（ V/m） 室温下用恒温磁力搅拌器搅拌 3 小时，转速为 1400 r/min， 使其充分反应。 3.3.3 大豆蛋白和
20、贻贝蛋白粉比例的考察 分别以 质量比 9： 1、 8： 2、 6： 4、 4： 6、 2： 8 的 大豆蛋白和贻贝蛋白粉混合为研究对象，以 3.3.1、3.3.2、 3.3.3 试验中的最佳条件配置碱尿复合变性剂。向 5g 的各种比例的混合蛋白粉中加入 50 mL的碱尿复合变性剂， 0.1% BIT（ V/m） 室温下用恒温磁力搅拌器搅拌 3 小时，转速为 1400 r/min， 使其充分反应。 3.3.4 搅拌时间考察 保持其他条件不变， 搅拌时间分别为 1h， 2h， 3h， 4h， 6h。 3.4 木板样品的制备 从市场上买的樱桃木，使用前在硅胶干燥器中存放。表面积为 2050mm2 的
21、木材表面用接在磨砂机上的三种不同规格的砂纸进行处理，加在砂纸上的力要与木板表面平行，确保木材表面不同部位受力相等，使同一块木材表面各处的粗糙度均一。其中木板粗糙度值 90、 40、 20 表示用 180、 280和 320 目的砂纸处理，反映木块表面的粗糙度水平，值越大代表木块表面越粗糙。 3.5 粘度的测定 测定不同浓度（ 1、 3、 5mol/L）的尿素溶液处理下的 SPI 粘度，粘度的 测定采用 NDJ-79 旋转粘度计法：用 NDJ-79 旋转粘度计测定大豆分离蛋白与化学修饰后的大豆分离蛋白粘度。先估计试样的粘度范围，选用合适的转子（使读数在刻度盘的 20%-80%范围内）。将待测样品
22、倒入，同时将容器中的试样和转子用恒温水浴恒温至 25 ，打开开关，待指针稳定后读出刻度盘上的读数。 最终粘度 =刻度盘读数 转子系数。 3.6 胶粘强度的测定 （ 1）按照图 1.1 所示制备粘接后的木块样品。每块木板的尺寸是 32050mm（高 、 宽和长），每三块木板胶接成一个木块样品。 - 9 - 图 1.1 木块胶接 示意图 （图中箭头表示胶粘强度测定时的拉伸方向） Fig.1.1 Illustration of glued wood (Arrows in fig.2.1mean the test direction in the process of adhesion strengt
23、h measurement) 将制备的大豆蛋白胶粘剂滴到中间木块的胶接面上，用另外两块木块分别在涂布面积为 2020 mm 上将大豆蛋白胶粘剂铺展直到表面完全被润湿。将涂了胶的木块在室温下放置 10min 后，用手将涂了胶的木块如图 1.1 所示搭粘 在一起，放置在 0.5 型平板硫化机上热压 10min，温度为 120 ，压力为 1MPa，冷却后放在聚乙烯袋子中室温下放置 4d。 （ 2）由 WDT-10 型微机控制电子万能实验测定木材样品的胶粘强度，拉伸速度为 10mm/min。记录拉断样品所用的最大拉力（ N），每个样品的数据是 6 个平行样的测量平均值。胶粘强度用下列公式 (2.1)计
24、算得出： (1.1) 4 实验结果 与讨论 4.1 不同尿素浓度变性大豆胶黏剂粘度性能测定 图 4.1.1 不同浓度的尿素对 SPI 粘度的影响 Fig.4.1.1. Effect of different urea concentration on viscosity of SPI 由图 4.1.1 可以看出，大豆分离蛋白（ SPI）经不同浓度尿素修饰后，蛋白质水溶液粘度先升高后下降：当尿素浓度小于 3mol/L 时，随着尿素浓度的增加，粘度也越来越大；当尿素浓度大于 3mol/L时，随着尿素浓度的增加，粘度反而越来越小。当尿素浓度为 3mol/L 时，大豆蛋白胶粘剂粘度最大。 00.511
25、.522.50 1 2 3 4 5 6尿素浓度（mo l/ L）粘度（MPa）- 10 - 实验结果说明，尿素加入使蛋白质分子的空 间结构部分发生改变。因为 尿素可与大豆蛋白的羟基相互作用，破坏蛋白质中的氢键，从而破坏蛋白质的二级结构。 尿素是极性分子，当少量尿素加入蛋白溶液中时，尿素分子能与水分子迅速形成分子间氢键，使蛋白质分子周围环境极性发生变化，影响蛋白质分子之间的疏水基相互作用，蛋白质分子展开，更多的非极性基团暴露，表现为 -折叠含量降低，无规卷曲含量增加。即尿素的添加使大豆蛋白 -折叠结构部分转化为无规卷曲和 -转角。疏水基团的暴露使得与底物间的作用力增强，同时更多的带负电的基团在碱
26、性环境中可用发挥作用。带电荷的基团间的静电相互作 用增大，因此蛋白质分子间的相互作用增强，表现为 SPI浆状物的粘度增加。当尿素浓度达到 5mol/L时，溶液粘度低于空白样，这可能是因为高浓度的尿素引起了 SPI的过度变性，蛋白的空间结构几乎被彻底破坏。 图 4.1.2不同浓度的尿素对 SPI胶粘强度的影响 Fig.4.1.2 Effect of different urea concentration on adhesive strength of SPI 如图 4.1.2所示，尿素浓度 为 1 mol/L和 3 mol/L变性大豆分离蛋 白时，大豆分离蛋白的粘接强度有所提高，且尿素浓度在
27、1 mol/L胶粘强度最大 , 但是当但尿素浓度大于 1 mol/L 大豆分离蛋白的粘接强度是逐步降低的，当尿素浓度为 5mol/L时 ，胶粘强度甚至低于蛋白质变性之前。影响蛋白质胶粘强度的因素很多，分析原因主要 为： 1、考虑大豆分离蛋白胶黏剂的粘度影响：当蛋白质胶黏剂被涂布在木材表面时 ,如果尿素浓 度小于 1mol/L时，则胶黏剂粘度太低，胶黏剂很容易渗透到木材内部，并产生流挂现象，干燥速度过快，胶粘效果变差；当尿素浓度 大于 3mol/L时，胶黏剂粘度太高，又不容易渗透到 木材内部，只能在木材表面产生胶粘作用。所以只是尿素浓度在 1mol/L-3mol/L时，变性大豆分离蛋白才表现出优于未变性大豆分离蛋白的胶粘性能。 所以浓度为 1mol/L的尿素变形大豆蛋白质得到的胶黏剂胶粘强度最佳。 4.2 不同 pH下尿素浓度变性大豆蛋白胶黏剂性能测定 012345670 1 3 5尿素浓度（mol/L）胶粘强度(MPa)
