1、 本科毕业论文 （ 20 届） 孔鳐 鱼肉蛋白抗氧化肽的 制备 和营养评价 所在学院 专业班级 药学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 目录 摘要 . 3 ABSTRACT . 4 前言 . 5 1 仪器与材料 . 6 1.1 实验仪器 . 6 1.2 实验材料 . 6 1.2.1 主要试剂 . 6 1.2.2 孔 鳐生物样本 . 6 2 实验方法 . 6 2.1 酶解制备抗氧化肽工艺路线 . 6 2.2 木瓜蛋白酶酶解条件优化 . 6 2.3 DPPH 自由基清除能力的测定 . 7 3.结果与讨论 . 7 3.1 单因素实验 . 7 3.1.1 酶解时间对孔鳐鱼肉蛋白酶解产物
2、 DPPH 清除率的影响 . 7 3.1.2 酶用量对孔鳐鱼肉蛋白酶解产物 DPPH 清除率的影响 . 7 3.1.3 酶解温度对孔鳐鱼肉蛋白酶解产物 DPPH 清除率的影响 . 8 3.1.4 酶解液 PH 值对孔鳐鱼肉蛋白酶解产物 DPPH 清除率的影响 . 8 3.2 正交试验及数据处理 . 9 4 小结 . 10 参考文献 . 10 3 孔鳐鱼肉蛋白抗氧化肽的制备和营养评价 摘要 目的：研究孔鳐鱼肉蛋白酶解产物的制备工艺及抗氧化活性。方法：用木瓜蛋白酶对孔鳐鱼肉蛋白进行酶解，以 DPPH 清除率为指标，通过单因素和正交试验确定木瓜蛋白酶的最佳酶解条件。结果：木瓜蛋白酶酶解孔鳐鱼肉蛋白制
3、备抗氧化肽的最佳酶解条件为：酶用量0.8%，调节 pH 值 7.0 在 60水浴下酶解 2h。结论：该研究结果显 示，孔鳐鱼肉蛋白的木瓜蛋白酶酶解物具有较强的抗氧化性，可经精深加工成为抗氧化食品或食品添加剂。 关键词 孔鳐鱼肉；抗氧化肽；木瓜蛋白酶； DPPH 自由基清除 4 The preparation and nutritional evaluation of antioxidant peptide from Raja porosa muscle Abstract objective: Study the processing technology and antioxidant pro
4、perties from raja porosa muscle by papain. Methods: The optimal conditions of papain hydrolysis were obtained by single-factor experiments and orthogonal design , and the antioxidant activities were evaluated by DPPH radical-scavenging activity. Results: Under the optimum parameters of enzymolysis t
5、ime of 2h, total enzyme dose of 0.8 %, enzymolysis temperature of 60 C and pH value of 7.0, the scavenging activity of DPPH radical reached to 28.42%. Conclusion: The results show that the hydrolysates of raja porosa muscle has strong oxidation resistance, it could be processed to antioxidant food o
6、r be food additive. Key words Raja porosa muscle; Antioxidant peptide; Papain; DPPH radical-scavenging 5 前言 海洋面积约占地球表面积的 71 %，海 洋生物物种占地球生物的 80 %以上，海洋中还有大量的海生藻类和微生物，可见 ,海洋是巨大的物质宝库。另外 ， 海洋生物处于高盐、高压、低温、低营养和无光照的环境中 ， 生态环境比陆生生物复杂得多 ， 各种海洋生物依其特殊的结构和功能维持其生命活动。海洋生物的多样性、复杂性和特殊性使源于其中的海洋天然产物在其生长和代谢过程中 ， 生产各种具有
7、特殊生理功能的活性物质 ， 并且某些特异的化学结构类型是陆地生物体内难以发现的 ， 这使得海洋成为创新药物和功能性保健食品的原料宝库 1。为了适应极端的海洋生物环境 ， 海洋生物蛋白质无论氨基酸的组 成还是氨基酸的序列均与陆地生物蛋白有很大的不同。同时 ， 海洋生物蛋白资源无论在种类和数量上均远远大于陆地蛋白资源 ， 且未得到很好的开发 2。天然存在的海洋活性多肽由于在生物体内含量低 ， 而且提取困难 ， 难以实现大量生产供给所需。随着酶工程技术的发展 ， 研究者逐渐注意到利用酶工程技术制备生物活性肽的可行性。营养蛋白的多肽链内部可能普遍存在着功能区 ， 选择适当的蛋白酶水解 ， 这些多肽有可
8、能被释放出来 ， 从而制备各种各样的生物活性肽。目前 ， 酶工程技术已经应用于医药、食品、饲料生产等领域中。 随着酶工程技术的发展 ， 研究者逐渐注意 到利用酶工程技术制备生物活性肽的可行性。营养蛋白的多肽链内部可能普遍存在着功能区 ， 选择适当的蛋白酶水解 ， 这些多肽有可能被释放出来 ， 从而制备各种各样的生物活性肽 2。酶解法一般使用蛋白酶，其中包括植物蛋白酶、动物蛋白酶和微生物蛋白酶。植物蛋白酶制备抗氧化肽一般选用木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶 3。李志忠等 4以大豆为原料用木瓜蛋白酶酶解得到的产物具有强烈的抗氧化能力。陈美珍 5等人在研究大豆分离蛋白酶解物清除自由基能力时 ， 清除自由基能力
9、最强的是木瓜蛋白酶酶解物。郭瑶 6在研究罗非鱼胶原肽抗氧化活性时首选菠 萝蛋白酶。对于同一蛋白底物，由于不同蛋白酶的酶切位点不同 ， 所得到的肽片断分子质量大小和氨基酸组成也各有差异 ， 因此水解产物的理化功能特性也会有较明显的差别。比如胰蛋白酶酶解位点较少 ， 所以酶切产物片断较大。木瓜蛋白酶的酶切位点广泛 ， 释放出来的肽的分子质量比较小 7。故本实验选择酶切位点较广泛的木瓜蛋白酶酶解孔鳐鱼肉。 近年来，随着人们对海洋资源认识的提高，从海洋生物中不断发现一些具有抗氧化活性的化合物， Kunio Suetsuna 等 8在对虾肉中得到抗氧化肽。 S. Ranathunga 等 9从海曼中获得
10、 抗氧化多肽。 盘赛昆等 10在鳙鱼肉酶解物中获得具有清除羟自由基的寡肽。丁利君等 11在鳕鱼蛋白中获得较高活性的抗氧化多肽。阎欲晓 12用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶酶解罗非鱼肉获得具有超氧自由基清除作用的活性肽。因此海洋生物抗氧化剂的研究也逐渐受到重视。 很多证据显示，活性氧 (ROS)和自由基在许多退行性疾病如癌症、动脉硬化及糖尿病等中起重要作用，它们的形成是呼吸过程中不可避免的 13。这些自由基非常地不稳定，它们能迅速地同机体中的其它基团或物质发生反应，导致细胞或组织的氧化损伤。生物机体依靠多种由酶系 (SOD、 GSH-Px、 CAT、 GST 等 )和非酶系 (葡萄糖、维生素、氨基酸类等
11、 )物质组成的抗氧化体系，对抗活性氧及自由基。但是，这些防御体系并不能阻止所有氧化损伤。生物体通过补充含有抗氧化物质的成分，可以有效地减少氧化损伤对机体的危害。目前食品行业普遍使用的抗氧化剂多为化学合成 ， 其本身具有毒副作用 。 因此 ， 寻找天然的抗氧化剂已成为人们的研究热点。 孔鳐（ Raja porosa Gunther）俗称劳板鱼、劳子、甫鱼等 ， 属脊索动物门 ， 鳐科 ， 我国分布于黄海、渤海、东海 ， 产量大 ， 为重要的渔业捕捞对象 14。 国内外 对于孔瑶生物活性物质6 的开发研究几乎为零 ,因此，采取现代高科技手段提取分离生物活性物质，研制开发孔瑶的精深加工制品、功能食品
12、及海洋药物 ,使其具有广阔的应用开发前景。 本文采用正交试验优化木瓜蛋白酶酶解制备孔鳐鱼肉蛋白抗氧化肽，以 DPPH 清除率为依据测定其抗氧化性能。 1 仪器与材料 1.1 实验仪器 仪器名称 厂家 UV-1100 紫外可见分光光度计 上海马普达仪器有限公司 SK5200H 超声波清洗器 上海科技超声仪器有限公司生产 TP320 电子天平 上海民桥精密科学仪器有限公司 TDL-40B 离心机 上 海安亭科学仪器厂 SC-15 超级恒温槽 宁波江南仪器厂 Milli-Q50 超纯水系统 美国 Millipore 公司 JJ-2 组织捣碎机 上海梅香仪器有限公司 1.2 实验材料 1.2.1 主要
13、试剂 二苯代苦味酰基自由基 (DPPH)、木瓜蛋白酶，上海源聚生物科技有限公司进口分装；无水乙醇、无水乙醚、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、盐酸、氢氧化钠均为国产分析纯。 试验用水为自制二次蒸馏水。 1.2.2 孔鳐生物样本 实验用孔鳐于 2009 年 10 月购于浙江省舟山市定海区南珍水产市场，种属由浙江海洋学院赵盛龙教授鉴定。 标本存放于浙江海洋学院食品与药学学院药学实验室。 2 实验方法 2.1 酶解制备抗氧化肽工艺路线 孔鳐去皮、去软骨后，取用鱼肉加入适量磷酸盐缓冲液（ PBS）混合，放入组织捣碎机将孔鳐鱼肉捣碎成匀浆。匀浆中加入 200ml 乙醚脱脂，混合均匀后在 4 下放置 24h，加入适
14、量PBS 离心去除上清液 （ 6000r/min； 15min） ，直至无乙醚气味，得沉淀物 572g。取沉淀物加入相同 质量 的 PBS 缓冲液稀释，在水浴保温条件下加入一定量的木瓜蛋白酶混合均匀后酶解，酶解到设定时间将酶解液于 90 以上水浴中灭活 15min，离心， 取上清液，做抗氧化试验。 2.2 木瓜蛋白酶酶解条件优化 以 DPPH 清除率为指标考察加酶量、酶解时间、提取液 pH、温度对木瓜蛋白酶酶解制备赤鱿鱼酮体蛋白抗氧化肽的影响，见图 1-图 4. 根据单因素试验设计正交试验，确定木瓜蛋白酶酶解制备孔鳐鱼肉抗氧化肽的工艺路线。L9(34)正交试验设计因素和水平见表 1。 表 1
15、正交试验因素水平表 Table 1 The fac tors and levels of enzymatic hydrolysis c onditions 水平 因素 7 A 时间（ h） B 酶用量（ %） C 温度（ ） D pH 值 1 2 0.6 50 5 2 3 0.8 55 6 3 4 1.0 60 7 2.3 DPPH 自由基清除能力的测定 15 DPPH 自由基清除能力按照 Bersuder（ 1998） 描述的方法进行。 500 l样品与 500 l的99.5%乙醇混合，加入 125 l DPPH浓度为 0.02% 的 99.5%乙醇溶液。混合物在暗室室温下放置 60 分钟，
16、于 517 nm 处测定吸光值。 自由基清除率按照下面公式计算：清除率 % =（对照 +空白 -样品） /对照。 对照： 500 l蒸馏水 + 125 l浓度为 0.02% DPPH 99.5%乙醇液 + 500 l乙醇 99.5%；样品：500 l样品 + 125l浓度为 0.02% DPPH 99.5%乙醇液 + 500 l乙醇；空白： 500 l样品 + 125 l乙醇 + 500 l乙醇 。 3.结果与讨论 3.1 单因素实验 3.1.1 酶解时间对孔鳐鱼肉蛋白酶解产物 DPPH 清除率的影响 如图 1 所示：酶解时间对酶解度有较大影响。随着酶解时间的延长，孔鳐鱼肉蛋白酶解产物的 DP
17、PH 清除率逐渐增加， 3h 的酶解产物对 DPPH 的清除率达到最高值，而超 过 3h 酶解产物对 DPPH 的清除率迅速下降，因此酶解时间以 3h 为宜。 05101520250 1 2 3 4 5 6 7时间 / hDPPH清除率/%图 1 酶解时间对酶解产物 DPPH 清除率的影响 Fig.1 Effects of enzymatic hydrolysis time on clearance rate of DPPH of enzymatic hydrolysate 3.1.2 酶用量对孔鳐鱼肉蛋白酶解产物 DPPH 清除率的影响 如图 2 所示，随着酶用量的增加，孔鳐鱼肉蛋白的酶解产
18、物 DPPH 清除率上升。当酶用量超过 0.8%时， DPPH 清除率上升趋缓，并有下降趋势。酶也 是蛋白，用量过多会对实验产生影响，并考虑实验成本，故选择酶用量为 0.8%。 8 10121416182022240.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6酶量/%DPPH清除率/%图 2 酶用量对酶解产物 DPPH 清除率的影响 Fig.2 Effec ts of amount of enzyme on c learanc e rate of DPPH of enzymatic hydrolysate 3.1.3 酶解温度对孔鳐鱼肉蛋白酶解产物 DPPH 清除率的影响 如图 3 所示，
19、在一定温度范围内，温度对孔鳐鱼肉蛋白的酶解产物 DPPH 清除率影响显著，随着温度的升高， DPPH 清除率增大。但当温度超过 60 时 DPPH 清除率下降。温度过高或过低都会影响酶的活性，故酶解温度选择 60 为宜。 101214161820222426283040 45 50 55 60 65 70温度 / DPPH清除率/%图 3 酶解温度对酶解产物 DPPH 清除率的影响 Fig.3 Effec ts of temperature on c learanc e rate of DPPH of enzymatic hydrolysate 3.1.4 酶解液 PH 值对孔鳐鱼肉蛋白酶解产
20、物 DPPH 清除率的影响 如图 4 所示，酶解液的 PH 值对孔鳐鱼肉蛋白酶解产物 DPPH 清除率有较大影响。随着 PH 的上升， DPPH 清除率逐渐增大。当 PH 超过 7.0 时 DPPH 清除率显著下降。 PH 值影响酶分子的构象及酶分子和底物的解离状态，也影响酶的活性和酶促反应速度。 PH 值过高或过低均不利于酶促反应，故选择酶解液的 PH 值为 7.0。 9 10121416182022244 5 6 7 8 9 10PH 值DPPH清除率/%图 4 酶解液 pH 对酶解产物 DPPH 清除率的影响 Fig.4 Effec ts of pH on c learanc e rat
21、e of DPPH of enzymatic hydrolysate 3.2 正交试验及数据处理 由单因素试验结果可知，酶解的最佳条件为，用酶量 0.8%，于 60 、 PH7.0 的条件下酶解 3h。但 在实际操作中，各因素之间会相互交叉影响。因此，为了 全面考察影响因素， 在单因素试验及数据分析基础上，以酶用量、酶解温度、 pH 值、酶解时间为考察因素，每个因素各取 3 个水平（表 1），并以 DPPH 清除率为考察指标，做 L9（ 34） 正交试验（见表 2）。 如表 2 所示，由极差 R 值可以看出，各因素对木瓜蛋白酶酶解孔鳐鱼肉蛋白的影响程度依次为 D A C B，即 PH 是优化条
22、件中影响程度最大的因素，酶用量的影响最小。 故最佳酶解工艺条件为 A1 B2 C3 D3,即酶解时间 2h，酶用量 0.8%，酶解温度 60 ，酶解液 pH 值为7.0。 表 2 木瓜蛋白酶酶解孔鳐蛋白制备抗氧化 多肽的正交试验结果 Table 2 Orthogonal experiment results of papain enzymatic hydrolysis raja porosa for preparing antioxidation peptides 试验号 因素 DPPH 清除率 (%) A 酶解时间 (h) B 酶用量 (%) C 酶解温度 ( ) D pH 值 1 2 0.
23、6 50 5 14.667 2 2 0.8 55 6 22.667 3 2 1.0 60 7 28.727 4 3 0.6 55 7 21.455 5 3 0.8 60 5 14.182 6 3 1.0 50 6 11.273 7 4 0.6 60 6 18.061 8 4 0.8 50 7 18.789 9 4 1.0 55 5 10.545 k1 66.061 54.183 44.729 39.394 k2 46.910 55.638 54.667 52.001 10 k3 47.395 50.545 60.970 68.971 最优 水平 A1 B2 C3 D3 K1 22.020 18
24、.061 14.910 13.131 K2 15.637 18.546 18.222 17.334 K3 15.798 16.848 20.323 22.990 R 6.383 1.698 5.413 9.859 R order D A C B 方差分析见表 3，结果显示， pH 值对孔鳐酶解物的抗氧化活性具有显著影响，酶解时间与酶解温度对孔鳐鱼肉酶解物的抗氧化性无显著影响，且酶解时间对其影响较酶解温度更小，这与表 2 显示的结果相符。 表 3 正交设计方差分析表 Table 3 ANOVA table for the orthogonal design 来源 平方和 d.f. 均方 F P
25、显著性 A 79.491 2 39.745 17.326 P0.05 不显著 B 4.588 2 2.294 C 44.696 2 22.348 9.742 P0.05 不显著 D 146.857 2 73.429 32.010 P0.05 显著 4 小结 试验结果证明：木瓜蛋白酶酶解孔鳐鱼肉蛋白的最佳酶解条件是：酶用量 0.8%，酶解温度 60 ，酶解时间 2h，酶解液 pH7.0。孔鳐鱼肉的酶解产物在 0.2g/ml 时对 DPPH 清除率为28.42%，明显高于鱼肉粗蛋白的抗氧化能力。说明酶解过程产生了具有较强抗氧化能力的肽段。 目前，很多研究表明自由基与生物机体的很多疾病有关，如肿瘤、
26、心血管疾病、糖尿病、炎症等，随着自由基理论的研究发展，越来越多的疾病与自由基反应的关系将被逐步揭示。具有自由基清除能力的抗氧化肽也越来越受到人们的重视，并将广泛应用于食品、药品及化妆品等行业。研制开发孔鳐的深加工制品、功能食品及海洋药物等具有广阔的应用开发前景。 参考文献 1 李婷菲 , 叶斌 . 药用 海洋活性物质的研究进展 J. 海峡药学 , 2009, 21(9): 12-14. 2 郑慧娜 , 章超桦 , 曹文红 . 海洋蛋白酶解制备生物活性肽的研究进展 J. 水产科学 , 2008, 27(7): 370-373. 3 裴小平 , 唐道邦 , 肖更生 , 蒋爱民 . 抗氧化肽制备的应用现状及趋势 J. 食品工业科技，2009, 30(2): 319-322. 4 李志忠 . 大豆多肽抗氧化研究 D . 兰州 : 兰州大学 , 2007. 5 陈美珍 , 余杰 , 郭慧敏 . 大豆分离蛋白酶解物清除羟基 自由基作用的研究 J . 食品科学 , 2002, 23 (3): 43-471. 6 郭瑶 . 罗非鱼皮胶肽的制备及其抗氧化活性的研究 D. 青岛 : 中国海洋大学 , 2006. 7 胡文婷 , 张凯 . 酶解海洋生物源蛋白制备活性肽研究进展 J. 海洋科学 , 2010, 34(5): 83-88.
