1、 本科毕业论文 （ 20 届） 海芙蓉口服液的制备工艺研究 所在学院 专业班级 药学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 目录 摘要 . 错误 !未定义书签。 ABSTRACT . 错误 !未定义书签。 1 前言 . 2 1.1 概述 . 3 1.2 目前关于 海芙蓉的研究 . 3 1.2.1 海芙蓉的药理活性 . 3 1.2.2 海芙蓉的结构基础 . 3 1.3 海芙蓉口服液的研发价值 . 4 2 实验材料、主要仪器与试剂 . 4 2.1 实验材料 . 4 2.2 主要仪器 . 错误 !未定义书签。 2.3 主要试剂 . 5 3 实验方法 . 5 3.1 黄酮含量测定方法 .
2、5 3.1.1 芦丁标准品的制备 . 5 3.1.2 芦丁标准曲线的绘制 . 5 3.1.3 样品溶液的制备 . 5 3.1.4 样品溶液的测定 . 6 3.2 提取工艺研究 . 6 3.2.1 影响总黄 酮得率的单因素分析 . 6 3.2.1.1 乙醇浓度对总黄酮得率的影响 . 6 2 3.2.1.2 超声时间对总黄酮得率的影响 . 6 3.2.1.3 配料比对总黄酮得率的影响 . 6 3.2.1.4 超声功率对总黄酮得率的影响 . 6 3.2.2 正交试验确定最佳提取方案 . 7 3.3 提取液的旋蒸 . 7 3.4 澄清工艺研究 . 7 3.4.1 壳聚糖澄清剂的配置 . 8 3.4.2
3、 澄清率的测定 . 8 3.4.3 总黄酮含量的测定 . 8 3.4.4 对澄清工艺的单因素分析 . 8 3.4.4.1 壳聚糖加入量对澄清效果的影响 .8 3.4.4.2 温度对澄清效果的影响 . 8 3.4. 4.3 pH 对澄清效果的影响 .9 3.4.5 对澄清工艺的正交试验 . 9 4 实验结果与讨论 . 9 4.1 芦丁标准曲线的绘制 . 9 4.2 乙醇浓度与黄酮提取率的关系 . 错误 !未定义书签。 4.3 超声时间与总黄酮得率的关系 . 错误 !未定义书签。 4.4 配料比与总黄酮得率的关系 . 错误 !未定义书签。 4.5 超声功率与黄酮提取率的关系 . 错误 !未定义书签
4、。 4.6 提取工艺的优选 . 错误 !未定义书签。 4.7 壳 聚糖添加量对澄清效果的影响 . 错误 !未定义 书签。 3 4.8 温度对澄清效果的影响 . 错误 !未定义书签。 4.9 pH 对澄清效果的影响 . 错误 !未定义书签。 4.10 澄清工艺的优选 . 错误 !未定义书签。 4.11 口服液的制备 . 错误 !未定义书签。 5 小结 . 错误 !未定义书签。 参考文献 . 错误 !未定义书签。 致 谢 . 错误 !未定义书签。 摘要 目的：制备澄清、质量稳定的海芙蓉口服液。方法： 以口服液中总黄酮含量为测量指标， 在单因素分析的基础上应用正交实验设计优选 超声波提取黄酮的提取工
5、艺和壳聚糖澄清剂的澄清工艺。结果：最佳提取工艺：用 8倍体积 75%的乙醇浸泡后用 200w功率的超声波处理30min后所得的提取液黄酮提取率最高。最佳澄清工艺： 稀释提取液的料液比为 1:8，调节 pH值为 4，使壳聚糖的浓度为 1.1g/L。结论：用超声波乙醇浸提并以壳聚糖澄清的海 芙蓉口服液有良好的稳定性及澄清度。 关键词 海芙蓉；总黄酮；提取工艺；澄清工艺 2 Study on preparation procedure for Crossostephium chinense (L. )Mak. ex Cham. et Schltr oral liquid Abstract Objec
6、tions: To prepare clear oral liquid of Crossostephium chinense (L. )Mak. ex Cham. et Schltr with stable quality. Methods: By determining the contents of total flavones in oral liquid, on the basis of the effects of some single factors, the orthogonal design was selected to choose the best ultrasonic
7、 extraction procedure and the the best clarification process of chitosan used on crataegus pinnatifida bge. Results :The best condition of extraction process was: add 8 times the amount of 75% alcohol and ultrasonic extract for 30 min in the power of 200w. The optimal clarification process condition
8、s were： merging the extract solution condense to 1 8 (hurb:the hurb), the pH is 4.0,the flocculation temperature was 35 , the optimun amount of chitosan was 1.1g/L.Conclusion: Crossostephium chinense (L. )Mak. ex Cham. et Schltr oral liquid ultrasonic extracted by alcohol and clarified with chitosan
9、 had stable quality and clarity. Key words Crossostephium chinense (L. )Mak. ex Cham. et Schltr , total flavones , extraction process , clarification process 1 前言 3 1.1 概述 中药口服液作为一项研究热点是近数年来开发的剂型，是汤剂、糖 浆剂和注射剂三种剂型相结合的一种新剂型。它以中药汤剂为基础，提取中药内的有效成分，加入矫味剂、抑菌剂等附加剂，并基本按照糖浆剂的生产工艺、质控标准合成的一种无菌或半无菌口服液体制剂。早在约 20世
10、纪 60年代初，已有将竹沥水等灌于安瓿中制成的口服安瓿剂。由于其具有服用量小、吸收快、味道好、奏效迅速、便于携带、质量稳定、易于保存等优点，从而使得其迅速发展。目前，中药口服液新上市产品如雨后春笋般迅速增长。其中较多适用于慢性疾病或久病体虚者，常具有滋补强壮、防病治病、增强人体抵抗力等作用，如人参蜂王浆口服液等。同时， 由于其服用方便、吸收快、奏效迅速，有时也用于急性病，如四逆汤口服液、生脉饮口服液等。 虽然目前海芙蓉口服液尚未上市，但随着对民间草药海芙蓉的研究不断深入，将其开发为口服液已经是水到渠成。 1.2 目前关于海芙蓉的研究 海芙蓉是一味民间草药 ， 为菊科植物芙蓉菊 Crossost
11、ephium chinense (L. )Mak. ex Cham. et Schltr的全草， 又名芙蓉菊、玉芙蓉、蕲艾、千年艾等 1。 为常绿亚灌木，高 30至 90厘米，直立，多分枝。叶互生，密生于枝顶、质柔，叶片匙形或刀披针形，长 2至 4厘米 ，具有芳香气味。由于叶片两面密被白色绒毛，使植株银装素裹，为绿色植物类群中少有的 “ 白叶植物 ” 。秋至冬季开花，头状花序，直径生于上部叶腋内，具柄。分布于我国台湾等沿海地区，在舟山群岛的朱家尖岛、普陀山、桃花岛及其他悬水小岛等也有一定分布。 其叶可用于治疗疔疮、风寒感冒、痈疽 ； 其根则能祛风湿 ， 用于治疗风湿关节痛、胃脘冷痛 2；全草具
12、有散结消肿、祛风除湿、镇惊、解毒的功效 3；岭南、广东等地区亦有用水煎服芙蓉菊治疗糖尿病的传统民间疗法4。因此将海芙蓉开发为口服液有很好的可行性并根据目前对海芙蓉的化学成分研究 表明该口服液将具有乐观的开发前景。 1.2.1 海芙蓉的药理活性 首先，北京大学吴琦、杨秀伟以及中国科学院邹磊、傅德贤 5采用体外 -葡萄糖苷酶抑制活性跟踪法发现海芙蓉 70%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部分和水溶性部分对 -葡萄糖苷酶活性具有明显的抑制作用。由于 -葡萄糖苷酶活性在机体多种代谢功能中起着关键的作用，而糖尿病与代谢紊乱失调密切相关 6，因此抑制 -葡萄糖苷酶活性将有利于糖尿病的治疗。其次，多项研究表明 7-
13、9，从海芙蓉全草水提取物的正丁醇萃取物、残留水层及海芙蓉多糖经部分水解后得到的寡糖 、 5%乙醇洗脱组分均 有一定的促胰岛素分泌活性。因此海芙蓉有防治糖尿病的作用。 除此之外， 临床研究中也发现 10, 海芙蓉能护肝利胆、调节免疫， 通过抑制 HSC cyclin D1 mRNA及其蛋白的表达来发挥对 HSC 细胞周期的调控， 使细胞复制停滞于 G0/G1期，抑制细胞增殖， 从而 可以改善肝功能甚至有抗肝纤维化作用。 同时，有文献报道 11，经口给予小鼠海芙蓉挥发油 30 d 后，能显著延长小鼠负重游泳时间；降低运动时血清尿素氮的水平；明显抑制小鼠运动后血浆乳酸的升高；促进运动后血浆乳酸的消除
14、；减少肝糖原的消耗 。因此海芙蓉挥发油可通过以上几个方面起到抗疲劳的作用。 4 1.2.2 海芙蓉降糖的结构基础 相关文献表明 5，海芙蓉的 -葡萄糖苷酶抑制活性主要是由于其内含有的东莨菪素、粗毛豚草素、柯伊利素、万寿菊黄素 -3, 6, 7-三甲基醚、石杉黄素和槲皮万寿菊素 -3, 6-二甲醚，经测量得其 IC50 ( mol L - 1 )值分别为 (34136 2106)， (146128 12144)， (246126 8173)，(74106 3183)， (42119 5125)， (136120 25173)强于相 同条件下的阳性对照药阿卡波糖（一种已上市的 -葡萄糖苷酶抑制剂）
15、 IC50 = (489125 38155) mol L - 1 。 邹磊 ,吴琦 ,杨秀伟等人 12则研究了海芙蓉的化学成分 5-O-甲基 -myo-肌醇、艾菊素、万寿菊黄素 -3, 6, 7-三甲醚、东莨菪苷以及东莨菪素对对胰岛分泌胰岛素的作用。结果显示： 5-O-甲基 -myo-肌醇对胰岛分泌胰岛素有促进作用，并且文献 13也报道从红豆杉分离得到的 5-O-甲基 -myo-肌醇能显著降低糖尿病模型的高血糖、抑制葡萄糖的吸收和肝糖原分解 ,保护胰岛 细胞，但不降低正常小鼠的血糖，且毒性极低，因此可用于糖尿病及其相关并发症的防治，还可用于改善自由基代谢以及与糖代谢紊乱有关的 疾病 (如高血脂
16、、脂肪肝和肥胖症等 )的 防治；万寿菊黄素 -3, 6, 7-三甲醚对于胰岛分泌胰岛素的促进作用介于格列苯脲和二甲双胍之间，在 5个化合物中作用是最强的；但是，东莨菪苷和东莨菪素抑制胰岛分泌胰岛素。因此东莨菪苷和东莨菪素在糖尿病的防治中尚需慎重考虑，虽然有研究表明其可以 抑制 -葡萄糖苷酶活性，但同时他们也抑制了胰岛分泌胰岛素。 1.3 海芙蓉口服液的研发价值 糖尿病已成为全球关注 性健康问题 ,全球糖尿病患者总量已超过 2 亿。根据世界卫生组织有关资料 , 20 世纪 80 年代中期 ,糖尿病患者总量在 3 000 万左右 ,至 90 年代中期的 10 年间 ,达到112 亿 , 2000
17、年达到 1171 亿 ,预计到 2030 年全球糖尿病患者总量将达到 314 亿人 ,年平均增长率10%左右 14 。因此 ,糖尿病防治药物的研究与开发已成为国际热点问题之一。 将海芙蓉的降糖成分粗提后制成口服液用于糖尿病的治疗将会有良好的开发前景，这是由于其不仅具有降糖的 药理活性，同时 海芙蓉作为一味中药还有护肝利胆、提高免疫力等作用，毒副作用低，适 于终生服用并且口服液无需注射，对于糖尿病患者特别是胰岛素分泌不足的患者无疑是一个久久期待的佳音； 并且随着海芙蓉栽培技术的提高，使得该口服液原料充足、来源方便，可见一旦开发成功，将具有良好的市场应用前景。 2 实验材料、主要仪器与试剂 2.1
18、 实验材料 海芙蓉 (采自东极岛 ) 2.2 主要仪器 仪器名称 型号 厂家 5 电子天平 超声波清洗器 可见分光光度计 电热恒温水浴锅 旋转蒸发仪 循环水式多用真空泵 台式离心机 BSA124S SK5200HP UV-1100 HWS-12 RE-2000 SHB- A TDL-40B 德国， Sartorius AG 公司 上海科导超声仪器有限公司 上海恒平科学仪器有限公司 上海一恒科技仪器有限公司 上海亚荣生化仪器厂 河南省太康科教仪器有限公司 上海安亭科学仪器厂 2.3 主要试剂 试剂（规格） 厂家 芦丁（ 100mg） 壳聚糖 无水乙醇（分析纯 AP） 亚硝酸钠 （分析纯 AP）
19、硝酸铝（分析纯 AP） 氢氧化钠（分析纯 AP） 氯化氢（分析纯 AP） 乙酸（分析纯 AP） 宁波市哈迈仪器有限公司 浙江国兴生物有限责任公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国 药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 3 实验内容 3.1 总黄酮含量测定方法 3.1.1 芦丁标准品的制备 准确称取 l0 mg 芦丁标准品 ， 用 60%乙醇定容至 25 mL， 摇匀。用移液管精密吸取 5.00 mL， 置于 50mL 容量瓶中 ， 并以 60%乙醇定容 ， 摇匀 ， 得芦丁标准溶液 ， 浓度为 0.04g/L
20、。 3.1.2 芦丁标准曲线的绘制 【 15】 分别用移液管精密吸取芦丁对照液 (0.10g/L) 0. 00、 1.25、 2.50、 5.00、 7.50、 10.00、 12.5 mL于 25 mL 容量瓶中 ， 并分别加入 5% 亚硝酸钠溶液 0.75 mL， 摇匀 ， 静置 6 min； 再加 10 % 硝酸铝溶液 0.75 mL， 摇匀 ， 静置 6min； 再加 4%氢氧化钠溶液 10.00 mL， 用 60%乙醇稀释至刻度 ， 摇匀 ， 静置 12 min， 于 510 nm 处测吸光度 。 吸光度测定结果见表 4-1。 3.1.3 样品溶液的制备 精密称取 2.000g 左右
21、的海芙蓉粉末 ， 加入 75%乙醇 150mL 浸泡 后 在功率 200 W 超声波条件下 ， 将样品溶液进行超声提取 30 min， 减压抽滤 ， 作为待 测液。 3.1.4 样品溶液的测定 按 3.1.2 中的方法测样品溶液在 510 nm处 的吸光度并按照回归方程计算其总黄酮含量。 6 3.2 提取工艺研究 在海芙蓉粉碎度一定的条件下 ， 所用的溶剂以及其用量、浓度、萃取方式、浸泡时间、萃取时间等因素对黄酮含量均有影响。若仅用水浸提 ， 提取物杂质多 ， 后处理比较麻烦。若用甲醇、丙酮等作为提取剂 ， 虽然提取效果较好 ， 但二者均有毒。乙醇浸提的渗透性强 ， 选择性好 ，浸出率较高。本
22、实验使用一定体积分数的乙醇溶液作为提取剂。同时为了提高有效成分的浸出 ，减少加热提取时水解产物的产生 ， 本实验利 用超声辅助萃取。 超声提取的机制包括机械机制、热学机制及空化机制 16。 经文献 17报道 ， 超声波辅助萃取不会破坏黄酮的成分结构。 因而，超声波乙醇浸提海芙蓉黄酮， 操作简单、快速、方便，是一条较好的提取黄酮类物质的途径。 3.2.1 影响总黄酮得率的单因素分析 由于 乙醇浓度、超声时间、配料比和超声功率都会影响提取效果，因此以提取液中总黄酮的含量为指标 ， 分别考察其对提取效果的影响程度。并通过单因素试验为正交试验选择最佳的实验范围。 3.2.1.1 乙醇浓度对总黄酮得率的
23、影响 精密称取 2.000g 左右的海芙蓉粉末 ， 分别加入 150mL 45%、 60%、 75%、 90%乙醇 150ml，在超声波功率 200w 的条件下，萃取 30min，抽滤后测量其体积并测定相应吸光度值，计算总黄酮得率，得总黄酮得率与乙醇浓度的关系图。结果见表 4-2。 3.2.1.2 超声时间对总黄酮得率的影响 精密称取 2.000g 左右的海芙蓉粉末 ，加入 60%乙醇溶液 150mL， 在超声波功率 200w 的条件下，分别用超声波辅助萃取 15min、 30min、 45min、 60min， 抽滤测提取液体积及其吸光度值，计算总黄酮得率， 得总黄酮得率与超声时间的关系图。
24、结果 见表 4-3。 3.2.1.3 配料比对总黄酮得率的影响 精密称取 2.000g 左右的海芙蓉粉末 ， 分别加入 75%的乙醇溶液 40ml、 80ml、 120ml、 160ml，在超声波功率为 200w 的条件下，用超声波萃取 30min，抽滤测提取液体积及其吸光度值，得总黄酮得率与乙醇体积的关系图。结果见表 4-4。 3.2.1.4 超声功率对总黄酮得率的影响 精密称取 2.000g 左右的海芙蓉粉末， 加入 60%乙醇溶液 150mL，分别在超声波功率 140w 160w 180w 200w 的条件下，用超声波萃取 30min，抽滤后测提取液 体积及其吸光度值，得总黄酮得率与乙醇体积的关系图。结果见表 4-5。 3.2.2 正交试验确定最佳提取方案 以总黄酮的含量为指标，同时考虑成本因素，选择料液比、乙醇的浓度、超声时间和超声功率 4 个因素， 每个因素选择 3 个水平， 如表 3-1 所示。 表 3-1 因素水平表
