1、 本科毕业论文 （ 20 届） 酶解制备海蜇多肽工艺条件优化 所在学院 专业班级 药学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 目录 摘 要 . 1 Abstract . 2 1 前言 . 3 2 材料与试剂 . 4 2.1 材料 . 4 2.2 试剂 . 4 2.3 主要设备与仪器 . 4 3 试验方法 . 5 3.1 预处理 . 5 3.2 水解酶选取 . 5 3.3 甲醛滴定法 . 5 3.4 单酶水解条件的优化 . 6 3.5 抗肿瘤活性的测定 . 6 3.5.1 酶解液的分离、提纯 . 6 3.5.2 细胞增殖抑制率的测定 . 6 4 结果 与讨论 . 6 4.1 水解酶的
2、筛选 . 6 4.2 正交试验 . 7 4.3 抗肿瘤活性测定 . 9 5 结 论 . 11 参考文献 . 11 致 谢 . 13 附录 英文翻译 . 14 附录 英文原文 . 21 1 摘 要 目的：优化海蜇的酶解制备工艺；方法： 以海 蜇 为材料， 采用 碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶 三种蛋白酶分别 在各自的酶解条件下对海蜇 蛋白 进行酶解 ，确定最佳蛋白酶，再 经正交试验确定最佳酶解条件 。 结果：海蜇酶解的最佳 匀 浆为碱性蛋白酶在 pH 为 10.0， 温度为 55 ，料液比为 1:2，加酶量为 1000 U/g，时间为 4h 的酶解条件下对海蜇进行酶解 ， 酶解液中的氨基氮含量
3、为 41.3mg/100ml；结论：碱性蛋白酶酶解效果最佳， 且具有良好的肿瘤抑制效果。 关键词 海蜇； 酶解 ；活性肽；工艺优化 2 Enzymatic Hydrolysis Process Optimization of peptide jellyfish 【 Abstract】 Objective： Optimization of enzymatic preparation of jellyfish. Methods: The jellyfish as materials, alkaline protease, papain and protease trypsin were three
4、 conditions in their respective enzymatic hydrolysis of the jellyfish protein, to determine the optimal protease, and then the orthogonal test to determine the optimum hydrolysis conditions. Results： The best jellyfish enzyme homogenate to pH 10.0 alkaline protease, the temperature is 55 , liquid ra
5、tio of 1:2, enzyme amount of 1000 U / g, 4h of hydrolysis time under the condition jellyfish were digested hydrolyzate amino nitrogen content in the 41.3mg/100ml; Conclusion： The best alkaline protease enzyme, and has good tumor suppression. 【 Key words 】 Rhopilem aesculentum； Hydrolysate； Active Pe
6、ptide； Process optimization 3 1 前言 海蜇 （ Rhopilem aesculentum） 俗称 “ 鮓鱼 ” ，隶属于腔肠动物门 （ Coelentera） 、钵水母纲 （ Scyphozoa)、 根口水母目 （ Rhizostomeae） 、 根口水母科 （ Rhizostomatidae） ， 海蜇属 （ Rhopilema)的无缘膜动物。 海蜇蜇体呈伞盖状 ， 通体半透明 ， 青色 、 白色或微黄色 ， 伞径可超过 45 cm，最大可达 1 m， 呈半球形 ， 上伞隆起 ， 中胶层发达 ； 下伞较薄 ， 边缘具发达环肌 ， 能收缩 、 运动 1。 世界已
7、记录的海蜇属只有海蜇（ R. esculentum）、黄斑海蜇（ R. hispidum）、棒状海蜇（ R. rhopalophorum）和疣突海蜇（ R. verrilli）四种。前三种在我国已有记录。棒状海蜇个体小（ 40100mm），伞部的中胶层薄、数量稀少，所以没有捕捞价值。作为渔业生产的主要为海蜇和黄斑海蜇两种 2。 海蜇 对高血压、慢性气管炎、哮喘、热痰咳嗽、胃溃疡、单纯性甲状腺肿和颈淋巴结肿等有一定疗效 3。 药理研究证明 ， 海蜇头原液有类似乙酰胆碱的作用，能降低兔的血压，并可使兔的体表（耳廓）血管及蛙的周身血管舒张，因此能够扩张血管 ，降低血压 4。美国 Auburn 大学报
8、道 ， 用低剂量海蜇胶原质喂养实验鼠可显著减少抗原引起的关节炎发生和减轻症状 5。 民间以海蜇皮、海带和海藻等量炖服有抑制癌细胞扩散作用。海蜇皮和鲜猪血炖服，可治哮喘。海蜇皮外贴还可以治疗痛风等症 6-7。 海蜇的蛋白占其干重的 50，其氨基酸成分种类齐全，必须氨基酸含量丰富。生长在海洋这一特殊环境（高盐、高压、缺少光照等）中的海洋生物，在其生长和代谢过程中，产生并积累了大量具有特殊化学结构的 蛋白氨基酸序列 ， 在这些种类繁多的海洋蛋白氨基酸序列中，潜在着许多具有生物活性 的氨基酸序列，用特异的蛋白酶水解，就能释放出有活性的肽段。肽与蛋白质都是由氨基酸通过肽键连接起来的大分子聚合物，肽的氨基
9、酸聚合度小，而蛋白质的聚合度相对大一些。在结构上，肽处于氨基酸和蛋白质的中间位置，而生物活性肽(Bioaetivepeptides)是指那些有特殊的生理活性的肽类 8-9。 生物活性肽 (Bioaetivepeptides)是蛋白质中 20 多个天然氨基酸以不同组成和排列方式构成的从二肽到复杂的线性、环形结构的不同肽类的总称，是源于蛋白质的多功能化合物。近年来，国际科学界研究发现，蛋白质经消化 道酶促水解后，主要以小肽的形式吸收，比完全游离氨基酸更易、更快被机体吸收利用，改变了过去认为的人体吸收的蛋白质主要是以氨基酸的形式吸收的理论，这是“肽”研究理论和实践的重大突破。肽是涉及生物体内多种细胞
10、功能的生物活性物质，生物体内已发现几百种肽，是机体完成各种复杂的生理活性必不可少的参与者，人体的激素、神经、细胞生长和生殖等功能活动也受多肽的调节 10。目前研究的海洋活性肽主要包括来源于海鞘、海葵、海绵、芋螺、海星、海兔、海藻、鱼类、贝类等的活性肽。肽 类不但在生物学方面具有多种生物活性，而且在食品感官方面 及加工性能也起着重要作用 11。在生物学方面，多肽具有免疫调节、激素调节、酶抑制、抗菌以及抗病毒等的功效 ； 在食品加工方面，多肽可以产生四种基本味觉 （ 甜、苦、酸和咸 ）， 可以为各种加工食品提供特殊风味和口感 ， 同时多肽还可以为食品加工提供抗氧化、抗菌以及乳化稳定的作用12。因此
11、，多肽不仅在保健药物中起着重要的作用，而且在食品工业中也有着广泛应用。 海蜇作为一种医食兼用的海洋生物， 其营养与药效功能已被大量文献记载。但是，国4 内外关于海蛰食品或药物的深加工技术与理论尚少有研究， 本实验应用 碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶 和胰蛋白酶 ， 通过单因素实验和正交实验 ， 优化海蜇蛋白质酶解工艺，以期为海蜇保健食品、功能食品或药物的深度开发和资源的科学利用提供试验依据。 2 材料与试剂 2.1 材料 新鲜海蜇购自舟山市南珍水产品市场； 2.2 试剂 试剂（规格） 厂家 胰蛋白酶 北京亚太恒信生物科技有限公司 碱性蛋白酶 北京亚太恒信生物科技有限公司 木瓜蛋白酶 北京亚太恒信生物科
12、技有限公司 F12 粉末培养基 美国 SIGMA 公司 MTT 美国 SIGMA 公司 Sephadex G-15 上海如吉生物科技发展有限公司 二甲基亚砜 美国 AMRESCO 公司 前列腺癌细胞 PC-3 中科院上海细胞库，由本实验室传代保存 肺癌 细胞 H1299 中科院上海细胞库，由本实验室传代保存 胎牛血清 杭州四季青生物工程有限公司 其余试剂均为 分析纯 A.R 国药集团化学试剂有限公司 2.3 主要设备与仪器 仪器名称 型号 厂家 高速组织捣碎机 DS-1 上海标本模型厂 电子天平 BSA124S 德国 Sartorius AG 公司 高速冷冻离心机 CF16RXII 日立 HI
13、TACHI 公司 微电脑电热恒温槽 SSW 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 酸度计 PHS-25C 上海理达仪器厂 恒温磁力搅拌器 85-2 常州国华电器有限公司 可见分光光度计 722S 上海恒平科学仪器有限公 司 5 超净工作台 ZHJH-C1209C 上海智诚分析仪器制造有限公司 CO2 培养箱 Forma 3111 美国 Thermo 公司 倒置显微镜 日本 OLYMPUS 公司 膜过滤装置 上海摩速仪器有限公司 旋转蒸发仪 RE-2000A 上海亚荣生化仪器厂 酶标仪 购自 美国 Bio-Rad 公司 3 试验方法 3.1 预处理 将市售海蜇用温水浸泡洗涤以除去明矾和盐分并沥干，切成
14、条状，再于温水中浸泡 12h，取出沥干，放入 DS-1 高速组织捣拌机中捣碎匀浆， -20冷藏备用； 3.2 水解酶选取 采用 碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶 三种蛋白酶分别 在各自的酶解条件下对海蜇 蛋白 进行酶解，酶解条件见表 1。 酶 水解 完成 后， 取出酶解液，迅速放置于 90 100 沸水中 灭酶 15min， 取出酶解液，使用 CF16RXII 高速冷冻离心机 在 4 下 以 6000r /min 离心 25 min 取上清液。 使用 甲醛滴定法测定氨基氮含量，选取最佳酶。 表 1 酶的 作用 条件 酶种类 酶量（ U/g) 温度 （ ） pH 酶解时间（ h） 料水比 碱性蛋
15、白酶 600 40 10 3 1： 3 木瓜蛋白酶 600 55 5.7 3 1： 3 胰蛋白酶 600 37 8.1 3 1： 3 3.3 甲醛滴定法 采用甲醛滴定法 13-14测定氨基氮含量， 吸 取 5.0ml 酶解液，定容至 100ml，取 20.00ml 酶解液稀释液置于 200ml 烧杯中，加水 60 ml，开动磁力 搅拌器，用 0.05 mol/L 氢氧化钠标准液滴定至 pH 为 8.2。加入 10.00 ml 甲醛溶液混匀，再用 0.05 mol/L 氢氧化钠溶液继续滴定至 pH为 9.2，记下消耗氢氧化钠标准液的毫升数，同时取水 80 ml 做试剂空白试验。按下列公式计算氨基
16、氮 (ANN)含量： ）V5（/1 0 00 1 4.0C）VV（X 21 6 X：为样品中氨基氮的含量（ g/100 ml）； V1：为测定用样品加入甲醛稀释后消耗氢氧化钠标准液（ ml）； V2：为试剂空白试验加入甲醛后消耗氢氧化钠标准溶液的体 积（ ml）； V：为样品液取用量（ ml）； C：为氢氧化钠标准液的浓度（ mol/L）； 0.014 为氮的毫摩尔质量（ g/mmol）。 3.4 单酶水解条件的优化 根据单酶水解试验结果，选出水解效果最好的蛋白酶，根据酶作用的条件，对酶水解作用的最适条件进行优化。蛋白酶水解的进程和效果主要受水解温度、底物浓度、加酶量、水解时间等因素的影响 1
17、5。因此 以酶解温度 A、料水比 B、加酶量 C、时间 D 为 四 因素，设计L9(34)正交实验 ，以电位 滴定法测定 所得的 氨基氮含量 为指标 ，通过实验数据最终确定 单酶的最佳酶解条件。 3.5 抗肿瘤活性的测定 3.5.1 酶解液的分离、提纯 将最佳条件下得到的酶解液通过 超滤及 SephadexG-15 凝胶柱分离，将分离组分进行抗肿瘤实验，确定海蜇活性肽的抗肿瘤作用。 3.5.2 细胞增殖抑制率的测定 选取人前列腺癌细胞 PC-3，肺癌细胞 H1299，用含 10%胎牛血清的 RPMI1640完全培养基于 37 ， 5% CO2培养箱中培养至对数生长期。 采用 MTT 法 16进
18、行检测，配制浓度分别为 1 mg/mL， 5 mg/mL， 10 ml/mL， 15 mg/mL， 20mg/mL 的 海蜇酶解溶液 。取 对数生长 期的细胞制成悬液 细胞浓度为 105， 接种至 96孔板 ，每孔 200 L，于 5% CO2， 37 贴壁 24 h，然后分别加入不同浓度的海蜇酶解溶液，每个浓度设 3个平行孔，同时设不加药对照组 ， 重复 3次， 置5% CO2， 37 培养箱中 孵育 48 h， 培养结束加 MTT 继续培养 4 h， 吸弃 MTT， 加入二甲基亚砜 150L，震荡 10min， 置 酶联免疫检测仪在 490nm 测吸光度 ， 计算细胞增殖抑制指数（ IR）
19、，按下列公式计算。 IR=(对照组 A 值 -加药组 A 值 )/对照组 A 值 100% 4 结果与讨论 4.1 水解酶的筛选 在料 水比 为 1： 3、 加酶量 为 600 U/g、酶解时间为 3h 的相同酶解条件下， 胰蛋白酶 酶解温度为 37， pH 为 8.1； 木瓜蛋白酶 酶解温度为 55， pH 为 5.7； 碱性蛋白酶 酶解温度为 40，pH 为 10.0 的条件下对 海蜇进行酶解， 酶解所得的 每 100ml 的酶解液中氨基氮的含量 如 图 1 所示 。 7 010203040506070碱性蛋白酶 木瓜蛋白酶 胰蛋白酶氨基氮含量(mg/100ml)图 1 单酶水解的氨基氮含
20、量 海蜇经 3 种蛋白酶酶解后，胰 蛋白酶、木瓜蛋白酶 和 碱性蛋白酶 酶解所得的氨基氮含量分别为 14 mg/100ml、 32 mg/100ml 和 63 mg/100ml。 胰 蛋白酶和 木瓜 蛋白酶的水解效果远低于碱性 蛋白酶， 且碱性蛋白酶水解液清澈，呈金黄色， 因此本实验选择 碱性 蛋白酶进行单酶水解条件优化试验。 4.2 正交试验 结果 在单水解试验的基础上，以酶解 pH 值 10.0 为固定酶解条件，以酶解温度 A、料水比 B、加酶量 C、时间 D 为考察因素， 每个因素各取 3 个水平 （ 表 2），并 以氨基氮含量 为指标， 采用 L9(34)正交实验 优化 碱性蛋白酶 的
21、水解工艺 结果如表 3 所示。 表 2 因素水平表 水平 A 温度 （ ） B 料水比 C 加酶量 (U/g) D 时间（ h) 1 35 1:2 600 3 2 45 1:3 800 4 3 55 1:4 1000 5 8 表 3 碱性蛋白酶正交试验 编号 A 温度 （ ） B 料水比 C 加酶量 (U/g) D 时间 （ h） 氨基氮含量 (mg/100ml) 1 1 1 1 1 24.5 2 1 2 2 2 14.0 3 1 3 3 3 10.5 4 2 1 2 3 11.9 5 2 2 3 1 23.1 6 2 3 1 2 10.5 7 3 1 3 2 41.3 8 3 2 1 3 1
22、8.9 9 3 3 2 1 29.4 16.3 25.9 18.0 25.7 15.2 18.7 17.3 21.9 29.9 16.8 25.0 13.8 R 14.7 9.1 7.7 11.9 注：表中 A 列 1、 2、 3 分别表示温度为 35 、 45 、 55 ， B 列 1、 2、 3 分别表示料水比为 1:2、 1:3、1:4， C 列 1、 2、 3 分别表示加酶量为 600U/g、 800U/g、 1000 U/g， D 列 1、 2、 3 分别表示时间为 3h、 4h、5h。 根据电位滴定法对正交试验中各条件下所得氨基氮含量 的测定结果，计算出 、 、及 R 值，同时 依据正交实验的因素和作为指标的氨基氮含量，做出两者的关系图，结果如图 2所示。
