1、 本科毕业论文 （ 20 届） 青鲨软骨血管生成抑制因子的制备 所在学院 专业班级 药学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 目 录 摘要 . 1 Abstract . 2 1 前言 . 3 2 实验材料与仪器 . 3 2.1 实验材料 . 3 2.2 主要 试剂 . 3 2.3 仪器 . 4 3 实验方法 . 4 3.1 分离提取 青鲨软骨 总蛋白 . 4 3.2 (NH4)2SO4 分级沉淀 . 4 3.3 抗氧化活性测定 . 5 3.4 鸡胚绒毛尿囊膜实验 . 5 3.5 离子交换层析 . 6 3.6 电泳实验 . 7 3.7 Sephadex G-75 凝胶过滤层析 .
2、8 4 实验 结果与讨论 . 9 4.1(NH4)2SO4 分级沉淀结果 . 9 4.2 抗氧化活性测定结果 . 10 4.3 鸡胚绒毛尿囊膜实验结果 . 10 4.4 离子交换层析 .11 4.5 电泳实验 . 12 4.6 Sephadex G-75 凝胶过滤层析 . 13 5 实验 小结 . 15 5.1 硫酸铵分级沉淀 . 15 5.2 柱层析方法 . 15 5.3 抗氧化活性研究 . 16 5.4 新生血管生成抑制因子 . 16 参考文献 . 16 致谢 . 18 1 摘要 目的：软骨鱼软骨具有 显著 的血管生成抑制作用， 是抗肿瘤新药研发的重要资源 。 因此，本课题 从青鲨软骨中分
3、离纯化出具有较强抗氧化活性的蛋白， 并对其 抑制新生血管的能力 进行了比较分析 。方法：青鲨软骨 组织破碎后于 PBS 浸提，低温离心 ， (NH4)2SO4 分级沉淀得粗蛋白 。通过离子交换层析（ IEC）和凝胶层析（ GFC）进行分离纯化 获得活性蛋白组分及单体 ， 采用 SDS-PAGE 电泳检测蛋白分子量。 利用 DPPH 清除率、羟自由基清除率、还原力三种体外抗氧化实验 测定分段部位和单体 的抗氧化 活性 。结果： SDS-PAGE 电泳结果所示，考马斯亮蓝染色显示为单一条带，证明 已 达到电泳纯，根据标准蛋白质的迁移率，测得其分子量为 95.9 kDa。运用 鸡胚绒毛尿囊膜（ CA
4、M） 活性抑制模型进行药理学研究分析发现， 8 g 青鲨软骨血管生成抑制因子（ BSFN） 对新生血管的抑制率已 经高达 80.9%。实验表明它能显著抑制 CAM 膜新生血管生成 ， 并且抑制效果具有一定的浓度依赖性。 DPPH 自由基 清除率、羟自由基清除率、还原力三种体外抗氧化实验显示 ， BSFN 在 10 mg/mL 时 DPPH 清除率、羟自由基清除率、还原力分别为 82.68%、 78.15%、 0.398。 结论： 高纯度的鲨鱼软骨血管生成抑制因子在治疗肿瘤中的显著作用使其应用前景被广泛看好。研究结果对于新药源开发具有重要意义，也为 软骨资源 的 高值化利用开辟一条新的途径。 关
5、键词 青鲨 软骨 ；血管 生成 抑制因子；抗氧化 活性 2 The Preparation of angiogenesis inhibitor in Blue shark Cartilage Abstract: Objective: Preparation and activity evaluation of angiogenesis inhibitor from Blue shark Cartilage. Method: Break the organization of Blue shark Cartilage, and taking it as raw materials, and we
6、 can extract it with PBS. Centrifuging, we can get the crude protein by Precipitating (NH4)2SO4. In this way, we could obtain activitive protein components and Monomer by separating and puring through IEC and GFC. Evaluate the molecular weight with SDS-PAGE electrophoresis. Make use of DPPH clearanc
7、e, OH clearance and reducing power in vitro to evaluate the antioxidant activity of sub parts and monomer. Detecting the inhibition of neovascularization of the Cartilage protein extracts, sub parts and the monomer with CAM. Result: The purified BSFN was homogeneous as a single band on a coomasie br
8、illiant blue-stained 12 % SDS-PAGE gel electrophresis. According to the migration rate of standard protein, the molecular weights of BSFN is 95.9 kDa. With CAM activity inhibition model, the inhibition rate of BSFN was up to 80.9% at the concentration of 8g. Moreover, the dosages of the angiogenesis
9、 inhibitors correlated with the inhibitory effect of angiogenesis in the CAM. Through DPPH、 hydroxyl radical-scavenging activity and reducing power, the in vitro antioxidant activities of BSFN were 82.68%、 78.15% and 0.398. Conclusion: Angiogenesis Inhibitor of Shark Cartilage has a significant effe
10、ct on treatment of cancer, so the prospect is favored widely. The finding was significant for resource protection and development of new drug source. Key words: Blue shark Cartilage; Angiogenesis inhibitor; Antioxidant activity 3 1 前言 我国蕴藏着丰富的海洋生物资源。现已证实，不少海洋生物活性物质具有抗肿瘤、抗病毒、抗真菌、抗艾滋病、抗心脑血管疾病、抗老年痴呆症以及
11、抗疲劳、增 强免疫、延缓衰老等功效。由此引起世界各国对开发海洋生物的极大兴趣，它已成为现代医药保健品开发研究的热点 1。 近年来，肿瘤严重威胁着人类的生命和健康，是仅次于心脑血管疾病危害人类健康的第二大杀手 2。目前，已 经 有许多抗肿瘤药物应用于临床，但多因其副作用大而在应用上受到限制。因此，人们逐渐将注意力转向从动植物中提取副作用小的抗肿瘤有效成分。近 20 年来发现鲨鱼的整个内骨骼几乎全由软骨组成， 并 且鲨鱼不长肿瘤，推论鲨鱼体内 应该 存在某种抑制肿瘤生长的物质 3。 推测 抑制肿瘤生长的物质 的作用主要包括： 对肿瘤细 胞的杀伤作用 ： 鲨鱼软骨中存在的 抗肿瘤因子 可以 直接杀伤
12、肿瘤细胞 、 抑制细胞骨架的形成或使细胞骨架发生凝聚和固缩，破坏其结构完整性 4。 对新生血管生长的抑制作用 ： 鲨鱼软骨蛋白 不仅可以 抑制鸡胚胎血管化和基质胶诱导的血管生成， 而且还能 抑制乳腺癌和人恶性胶质瘤的生长 并 阻止乳腺癌 和Lewis 肺癌的转移 5。 抗氧化作用 ：从 鲨鱼软骨中提取 得到 的一种水溶性组分具有抗炎和止痛 的 作用 ，其 能清除活性氧自由基 、 保护细胞不发生突变，间接起到抗肿瘤作用 6。 增强机体免疫力 ： 鲨鱼软骨活性物质可激活机体的免疫系统，活化 自然杀伤 细胞 及巨噬细胞以增强攻击癌细胞的能力 7。 而且 鲨鱼软骨多糖对胸腺和脾脏具有刺激作用，能同时活
13、化巨噬细胞，使其表面伸出较粗大的伪足，提高机体的免疫力，刺激白细胞分泌 肿瘤坏死因子 8。 国内外 越 来 越 多的研究证实，鲨鱼软骨 还 含有能阻止病理性血管生长的特殊物质，从而断绝肿瘤的血液供应，使肿瘤生长减缓 、 萎缩甚至消失，抗癌作用 明显。 而且对类风湿性关节炎等顽疾也有效 9。 因此为推动软骨鱼海洋药物的基础研究，更为从海洋软骨鱼资源宝库中开发新型抗肿瘤药物。本课题选择海洋资源丰富的青鲨为研究对象，利用硫酸铵分级沉淀法、离子 交换柱层析和凝胶柱层析等技术，提取分离活性蛋白 ， 并分析比较其 在 体外 的 抗氧化 活性 。同时以近年来颇受关注的抑制鸡胚绒毛尿囊膜 （ CAM） 血管生
14、成模型，进行高效抗肿瘤血管生成抑制剂的体外活性评价 。 本课题的研究，将为海洋资源丰富的软骨资源高值化利用开辟一条新的途径，为后续开发高效低毒保健的海洋抗肿瘤新药奠定基础。 2 实验材料与仪器 2.1 实验材料 青鲨购买于浙江省舟山市定海区南珍水产市场，种属由浙江海洋学院赵盛龙教授鉴定。标本存放于浙江海洋学院食品与药学学院生药学实验室。 2.2 主要 试剂 DEAE-52 和 Sephadex G-75 由 Pharmacia 进口分装； DPPH、乙醇、磷酸氢钠、磷酸氢二钠、铁氰化钾、三氯乙酸（ TCA）、三氯化铁、邻二氮菲、硫酸亚铁、 H2O2、丙 烯 酰胺、甲叉双丙 烯 酰胺、甘氨酸、三
15、羟甲基氨基甲烷（ Tris）、 SDS、过硫酸铵、 TEMED(甲基乙二胺，4 N， N， N， N-tetramethyl ethylenediamine)、蔗糖、琉基乙醇、 溴 酚蓝、盐酸、氯化钠、硫酸铵、氢氧化钠均为国产分析纯 。低相对分子质量标准蛋白质含有 6 种已知相对分子质量的蛋白质组合试剂购 买 于上海生物化学研究所；试验用水均为自 制 Millipore 超纯水。 2.3 仪器 仪器名称 厂家 BT 1-100 恒流泵 上海琪特分析仪器有限公司 BSZ-100-LCD 自动部份收集器 上海琪特分析仪器有限公司 TH-1000A 梯度混合器 上海琪特分析仪器有限公司 U-2800
16、 紫外可见分光光度计 日本日立紫外可见分光光度计有限公司 SK5200H 超声波清洗器 上海科技超声仪器有限公司 DS-1 高速组织捣碎机 上海标本模型厂 ZHJH-C1209C 型超净工作台 上海智诚分析仪器制造有限公司 041BR 型电泳仪 美国 Bio-rad 公司 Agilent-1200 高效液相 美国 Agilent 公司 HWS12 型电热恒温水浴锅 上海一恒科技仪器有限公司 TP320 电子天平 上海民桥精密科学仪器有限公司 CR21G 低温 高 速离心机 日本日立 SC-15 超级恒温槽 宁波江南仪器厂 DZF-6050 型真空干燥箱 上海精宏实验设备有限公司 GNP-908
17、0 型隔水式恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司 YSQ 手提式压力蒸汽灭菌锅 上海华线医用仪器有限公司 Milli-Q50 超纯水系统 美国 Millipore 公司 FD-1000 冷冻干燥机 上海爱朗仪器有限公司 3 实验方法 3.1 分离提取青鲨软骨总蛋白 用手术刀剔除青鲨鱼肉，取出青鲨软骨，洗净，将软骨剪碎，称重 2600 g，加少量 浓度 0.02 mol/L PBS（ pH 7.4）缓冲溶液（以下简称 PBS） ， 用组织捣碎机捣碎 ，再 加入两倍体积 (W/V)的 PBS 浸泡提取 ，缓慢搅拌 30 min， 4 时 提取 24 h（每 2 h 搅拌一次）。低温高速离心机（温度
18、 4 ） 离心两次，转 速 分别为 5000 r/min， 10000 r/min，时间分别 为 15 min， 20 min。取 离心 上清液，即为青鲨软骨粗提 液，测量体积。 3.2 (NH4)2SO4 分级沉淀 10 取 青鲨软骨粗提液 5000 mL，在冰浴条件下，缓慢 地 加入 60%(NH4)2SO4 细颗粒 ， 边加边搅拌。待 (NH4)2SO4 完全溶解，静置 4 h， 低温高速离心 机离心， 转速为 10000 r/min， 得 到 青鲨软骨 60 % (NH4)2SO4 沉淀蛋白，保留上清液。测上清液体积， 再 加入 100 %的 (NH4)2SO4，方法如上， 制备 10
19、0 %的 (NH4)2SO4 沉淀蛋白。 得到的两种 沉淀 蛋白分别 用 2 倍体积 (W/V)的PBS 溶解 ， 低温高速离心 机离心 20 min， 转速 为 10000 r/min， 得上清液 ， 透析过夜，冷冻干5 燥成粉。 计算提取率。结果见表 2。采用 Bradford 法 11， 用 牛血清白蛋白作标准曲线，测定蛋白含量。结果见表 2。 3.3 抗氧化活性测定 3.3.1 样品溶液的制备 将青鲨软骨 60 %与 100 % (NH4)2SO4 沉淀蛋白，稀释成浓度为 2 mg/mL、 4 mg/mL、 6 mg/mL、 8 mg/mL、 10 mg/mL 的样品溶液作抗氧化实验，
20、选择抗氧化 活性 强的样品溶液上离子交换层析。 3.3.2 DPPH 自由基清除能力 DPPH 自由基 清除能力测定按照 Bersuder（ 1998）等 12描述的方法进行。取一份 1mL 样品与 1mL 的 99.5%乙醇混合，加入浓度为 0.02% 的 DPPH 99.5%乙醇液 250 L 于同一具塞试管中摇匀。将混合物在暗室室温下放置 60 min， 于 517nm 处测定吸光 度 。 结果见 表 3。 (以上述所配置的溶液按照下述的方法每个实验平行进行三次，取其平均值，计算相对标准偏差RSD。 ) 自由基清除率按照下面公式计算：清除率 %=(对照 +空白 -样品 )/对照。 对照：
21、 1 mL 蒸馏水 +1 mL 乙醇 +250 L 浓度为 0.02 % DPPH 99.5 %乙醇溶液； 样品： 1 mL 样品 +1 mL 乙醇 +250 L 浓度为 0.02 % DPPH 99.5 %乙醇溶液； 空白： 1 mL 样品 +1 mL 乙醇 +250 L 乙醇。 3.3.3 还原力 水解液还原力测定按照 1988 年 Oyaizu13使用方法进行。取 2mL 样品溶液于试管中，依次加入 2 mL0.2 mol/L (pH6.6) 磷酸盐缓冲液 、 2 mL的 1 %铁氰化钾溶液 ， 充分混 匀后 在 50 保温 20 min， 接着 再 加入 2 mL10 % 的三氯乙酸（
22、 TCA）溶液，离心，取出 2mL 上清液 于另一试管中，再 加入 2 mL 蒸馏水和 0.4 mL 0.1 %三氯化铁溶液进行反应， 10 min 后 于 700 nm 处测定吸光 度 ，吸光值越高表明还原力越高。 结果见 表 4。 (以上述配置的溶液每个实验做三 个平行组，取平均值，计算相对标准偏差 RSD。 ) 3.3.4 羟自由基清除能力 14-16 取 1 mL 浓度为 0.75 mmol/L 邻二氮菲装于试管中， 再 加入 2 mL PBS(pH 7.4)， 1 mL 蒸馏水，完全混匀后，加入浓度为 0.75 mmol/L 的硫酸亚铁 1mL，混匀，加 1 mL 质量分数为 0.1
23、2%的 H2O2， 37 水浴反应 90 min，于 536 nm 处测其吸光度，为 Ap；用蒸馏水 1 mL 代替 1 mL H2O2，为 Ab；用样品代替 1mL 的蒸馏水，为 As。结果见表 5。 (以上述配置的溶液每个实验做三 个 平行组，取平均值，计算其相对标准偏差 RSD。 ) 样品对羟自由基清除率按照下面公式计算 ： 样品对羟自由基清除率 =(As-Ap)/(Ab-Ap)100% 3.4 鸡胚绒毛尿囊膜实验 17 3.4.1 实验材料 6 待测的 样品 由 本 实验室制备；鸡胚种蛋购 买于 萧山鸡场；定性滤纸、透明胶、新洁尔灭、75%乙醇 等为本实验室日常用品。 3.4.2 待测
24、样品制备 灭菌 的定性滤纸 作 为样品载体，滤纸先剪成大小约为 4 mm 4 mm 的方块，灭菌 ， 冷却后在无菌环境下滴加 不同浓度 的待测 样品 ，风干放在洁净区待用。 3.4.3 蛋胚孵育 在 室温下 ， 将鸡胚种蛋浸 没 于新洁尔灭水溶液 10 min，擦干后将鸡蛋气室向上，在 温度为 (37.6 士 0.2) ， 相对湿度为 60 %的孵化箱孵化 72 h。 3.4.4 蛋胚气室的去除 在 孵化箱中孵育 的 第 4 天，将蛋胚放在超净台上用 75 %乙醇 消毒，用镊子 轻轻地 在蛋胚顶端戳一小口，然后小心地去掉周围的蛋壳和壳膜，使开口约为 l5 mm l5 mm 大小。此时 看到 的
25、 气室凹陷部隔着一层气室膜就是 CAM 膜，同时 也 清楚地看到 CAM 膜上网状血管的大小和分布位置。在血管分叉较少 的 部位，用注射针头慢慢地从气室同卵黄分隔处挑破气室膜，滴 入 1-2 滴无菌水，将气室膜与 CAM 膜分开，然后用镊子小心夹去上层的气室膜，暴露出下层的 CAM 膜。 3.4.5 加样 将 3.4.2 制备好的 载样滤纸置于 CAM 膜 和卵黄囊膜处血管稀少的部位，然后用灭菌透明胶带封严蛋口，继续孵育约 48 h。 样品组为 待测的 不同浓度的样品 ， 阴性对照组为 PBS，阳性对照组为 4 g 的硫酸软骨素 （ CS） 。 3.4.6 观察 孵育结 束后，用剪刀和镊子轻轻
26、地除去封严蛋口的透明胶，轻轻滴入甲醇 /丙酮等体积混合液 lmL，室温下固定 10min，慢慢地用镊子将蛋壳从气室端周围揭去，最大程度的暴露鸡胚绒毛尿囊膜，以加样点为中心，以半径 5mm 间隔将 CAM 划分为 3 个区域，拍照记录实验结果，结果如图 2，计数各区域的血管数，进行数据分析比较各剂量组与对照组之间的差异。结果如表 6。 3.5 离子交换层析 18 3.5.1 填料 DEAE cellulose DE-52 的处理 取配制好 的 0.5 mol/L 氢氧化钠溶液 500 mL， 撒入 30g DEAE cellulose DE-52， 用玻璃棒搅拌混 匀，室温 下 放置 2h（间歇
27、轻微搅拌），倒去上清液，重复操作 1 次 ， 水洗 2 次至中性 ，再用 500mL 0.5mol/L 盐酸溶液 处理 2 次（方法同上） ， 水洗 2 次至中性。 3.5.2 安装和洗脱层析柱 7 选择规格为 2100cm 的层析柱，将柱顶端与恒流泵相连，柱底部与自动收集器相连，垂直安装在铁架台上。将处理好的 DEAE cellulose DE-52 和 PBS 充分搅匀，用玻璃棒引流沿壁连续缓缓注入填料，最后用 PBS 灌满柱剩下容积。启动泵， PBS 以 2mL/min 冲压柱子直至柱体积恒定， 用 约 2 倍柱体积 的 PBS 冲洗 以平衡填料，流速为 1mL/min。取 500mg
28、青鲨软骨60%(NH4)2SO4 沉淀蛋白样品，溶解在 10mL 的 PBS 中， 低温高速离心机离心 10min， 转速为10000 r/min， 得上清液， 约 9mL 上样。分别以 0.1mol/L 和 0.5mol/L NaCl(PBS)溶液 ， 分步 洗脱 2 倍柱体积，流速 1mL/min。每 10mL 收集一管。用紫外分光光度计在 280nm 处检测，按峰合并。结果如图 3。将所得样品 4 下 透析过夜，冷冻干燥 成粉 ，保存。计算洗脱率和蛋白产率，结果如表 7。 3.5.3 抗氧化活性测定 将冷冻干燥好的各洗脱峰样品用 PBS 稀释成浓度为 5mg/mL 的蛋白溶液。 方法 参
29、照 3.3，比较各洗脱峰的抗氧化 活性 ，选择抗氧化能力强的洗脱峰蛋白做下一步纯化。结果见表 8。 3.5.4 鸡胚绒毛尿囊膜实验 方法 参照 3.4。结果见图 4，表 9。 3.6 电泳实验 19 3.6.1 制备电泳试剂 （ 1）低相对分子质量标准蛋白质含有 6 种已知相对分子质量的蛋白质组合试剂 (上海生物化学研究所 )：按说明书要求开管分装，即每个包装加入 200L 水充分溶解，然后分装于 20个小塑料离心管， -20 保存。分装后每份体积 10L，每种标准 蛋白的含量为 2g，用时按下述待侧样品的加热变性处理。 （ 2）待测蛋白质样品：取蛋白样品 0.5mg，加入 0.01 mol/
30、L 磷酸缓冲液 (pH=7.0)1mL 溶解。以下同标准蛋白质一样，加入等体积的样品缓冲液，混匀，在沸水浴中加热 3 min，待电泳时用于上样。 （ 3） 30%丙烯酰胺 凝胶贮液：称取 29g 无结块的 丙烯酰胺 和 1g 甲叉双丙烯 酰 胺 ， 37 水溶解，定容到 100mL，滤去不溶物，装入棕色瓶中，于 4 保存。 （ 4） 1.5mol/L Tris(pH8.8) （ 5） 1.0mol/L Tris(pH6.8) （ 6） 100g/L SDS：称取 SDS 10g，用 50mL 水溶解，加水至 l00mL。 （ 7）电泳缓冲液 (pH8.3) 5：称取 Tris 3.78g、 G
31、ly 23.50g、 SDS 1.25g，加水 定容 至 250 mL，溶解，用时稀释 5 倍。 （ 8） 100g/L 过硫酸 铵 溶液：取 1g 过硫酸铵，加水溶解，并定容至 10 mL，置 4 保存。 （ 9） TEMED(甲基乙二胺 ) （ 10）样品缓冲液：称取蔗糖 2.5g、 SDS 0.46g、 Tris 0.15g、 2-琉基乙醇 1 mL，用水定容至 10 mL，加 溴 酚蓝 0.01g，使完全溶解 。 （ 11）染色液配制： 1mol/L 盐酸溶液 (A)、 1g/L 考马斯亮蓝 G250 溶液 (B)，应用时用 1 mL A 液和 15 mL B 液混合加水至 1000m
32、L，搅拌混匀。 8 （ 12）脱色液 1mmol 盐酸 3.6.2 安装灌胶架和配制电泳胶 按 041BR 型电泳仪说明书中描述的 方法 安装灌胶架。取一个小锥形瓶配制分离胶溶液，按 表 1 配制 分离 胶溶液。加入过硫酸铵后迅速、连续地灌注在两块玻板的间隙中，高度距玻璃板上出口处约 2cm。用带有针头的注射器小心地在丙烯酰胺溶液上部覆盖一层水，在 50下垂直放置 15min 左右，使其充分 聚合凝固。倾去覆盖层溶液，再用水轻轻冲洗顶部 2 次，弃去多余溶液。另用一个锥形瓶，按 表 1 配制浓缩胶溶液，同样一旦加入过硫酸铵，迅速灌在已聚合的分离胶的上端。随即插入干净的塑料梳子，赶去气泡，梳齿前
33、沿与分离胶间距离约为 0.5cm。在 50 下使其完全凝固约 10min。 表 1 电泳胶的制备 试剂 /mL 分离胶 浓缩胶 H2O 1.63 1.43 30%丙烯酰胺凝胶贮液 2.03 0.333 1.5mol/L Tris(pH8.8) 1.33 0.253 100g/L SDS 0.053 0.023 100g/L 过硫酸铵 0.053 0.023 TEMED 0.0023 0.0023 3.6.3 加样 轻轻将灌好胶的胶板从灌胶架上取下，放入电泳槽中，加入稀释过的电泳缓冲液 (pH8.3)至高出内侧玻板上缘约 0.4cm。小心移出梳子不要破坏梳孔。用微量进样器抽取已处理好的标准蛋白和
34、待测软骨蛋白样品液 5L，按顺序，通过电泳缓冲液小心地把样品加在每个梳孔的底部凝胶面上。 3.6.4 电泳 盖好电泳槽盖，接通电泳仪电源，电压调至 50V，样品开始 进入浓缩胶中，逐渐被浓缩。当溴酚蓝指示剂刚要进入分离胶时，迅速将电压调至 120V，继续电泳直至指示剂接近分离胶底部，调电压为零，切断电源，电泳完毕。卸下电泳玻璃胶板，将胶板浸没于水中，用铲子小心撬开玻璃板，使两者分离，小心刮下分离胶。取出分离胶浸泡于 5mmol/L 盐酸溶液中，振荡约 1h，进行固定；弃去盐酸溶液，将胶置于染色液中，连续振荡染色约 30 分钟 ；弃去染色液，小心的将胶置于 1mmol/L 盐酸溶液中脱色 10 小时 (换液 35 次 )。最后轻轻取出凝胶进行观察和拍照，并将凝胶保存于 1mmol/L 盐酸溶液中。应用 Quantity One System 对凝胶进行拍照，并作蛋白质条带染色强度分析，如图 5。 3.7 Sephadex G-75 凝胶过滤层析 20 3.7.1 填料 Sephadex G-75 凝胶的处理 称取适量 Sephadex G-75，用大量水溶解，浸泡 24h 充分溶胀 。
