1、 本科毕业论文 （ 20 届） 微波法提取蜈蚣藻多糖工艺及抗氧化活性的研究 所在学院 专业班级 药学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 目录 摘 要 1 ABSTRACT 2 1 前言 3 2 实验材料、试剂与器材 4 3 实验方法 4 3.1 蜈蚣藻多糖的提取 4 3.2 蜈蚣藻多糖抗氧化活性测定 5 4 实验结果 6 4.1 葡 萄糖标准曲线制作 6 4.2 单因素实验 6 4.3 正交实验 8 4.4 多糖抗氧化研究 9 5 讨论 9 6 结论 10 参考文献 10 致谢 12 附录 英 文 翻译 13 附录 英 文 原 文 19 1 摘要 目的 ：提取蜈蚣藻中的多糖并测
2、定其抗氧化能力。方法：利用微波辅助提取蜈蚣藻多糖；用苯酚 -硫酸法测定含量； 利用 DPPH 法、清除羟自由基法和 清除 超氧阴离子 自由基的能力 测定 法进行抗氧化实验。结果 ：微波功率为 600W，当提取温度为 90，提取时间为 10min，液料比为 70 时提取率最大，为 18.13%。蜈蚣藻多糖对 DPPH，羟自由基都具有一定的去除作用，并随浓度的增加其活性增强。 关键词 蜈蚣藻 ；抗氧化； DPPH ；羟自由基 2 Study on Microwave-assisted extraction and the antioxidant activity of water-soluble
3、polysaccharide from Grateloupia filicna Abstract Objective:extract water-soluble polysaccharide by Microwave-assisted extraction and determine its antioxidant activity.Methods: Methods： Microwave-assisted extraction;The content of polysaccharide was determined by phenol-sulphuric acid methed;The ant
4、i-oxidation was measured by DPPH method and free radical scavenging action of OH ( the self oxidation method of pyrogallol Fenton system) Results:Under the optimum parameters of microwave power of 600W,extraction temperature of 90 ,extraction time of 10min and liquid-to-solid ratio of 70,the yield o
5、f crude polysaccharides reached to 18.13%.The microwave power is the biggest effect factors.Conclusion: Grateloupia filicna polysaccharide has the effects of DPPH and OH. scavenging the elimination rate of the production have some connection with the concentration of polysaccharide. Key words Gratel
6、oupia filicna,Antioxidant,DPPH,Hydroxyl radical,Superoxide radical 3 1 前言 1.1 蜈蚣藻和多糖 蜈蚣藻 (Grateloupia filicina C. Ag.)，别名海赤菜、冬家烂、膏菜。属于红藻门、真红藻纲、隐丝藻目、海膜科、蜈蚣藻属 1。藻体呈紫红色，胶 质粘滑，丛生，主干单一至顶，亚圆柱形略扁，不规则地羽状分枝 1-3 次，互生、对生或偏生。体表有时可见颗粒状囊果 2。 多糖具有广泛的的生物活性与功能 , 如降血糖 3、抗氧化作用、免疫调节活性 4、抗突变、抗病毒及抗肿瘤等 5, 而且对正常的细胞没有毒副作用 ,
7、 已逐渐发展成为一种免疫疗法 , 越来越受到研究人员的重视 6。 天然多糖主要是从自然界中的植物或农副产品中提取分离得到的，其提取基本过程如下：原料烘干粉碎浸提浓缩脱蛋白脱色透析去小分子乙醇沉淀得粗多糖。多糖的提取方法主要有溶剂浸提法、 酶提取法、微波提取法、超声波提取法、超临界流体萃取法等。目前多糖的提取一般采用热水、酸、碱、乙醇等作为溶剂，并且多数采用热水浸提法进行粗提。 1.2 微波浸提的特征 1.2.1 瞬间产生高温，浸提时间短 在高频微波的作用下，溶剂和溶质中的偶极分子产生偶极涡流，离子传导和高频率摩擦，从而在极短时间内产生极大的热量。偶极分子旋转导致的弱氢键破裂，离子迁移等还加速了
8、溶剂分子对样品机体的渗透，使待提物很快溶剂化，这种现象吧可使微波萃取时间显著缩短 7。 1.2.2 加热均匀 传统加热是由外部热源通过传导和对流方式由表及 里对物体加热。而微波加热则是物体在电磁场中由介质损耗而引起的体加热，其能量是通过空间或媒质以电磁波的形式来传递，与物质的内部分子的极化有密切的关系。透入物体内部的微波能量被物体吸收转换成热能对物体加热，此时物体的表里温升均匀 8。 1.2.3 伴随着生物效应 微波加热过程中除热效应之外，还有生物效应。由于物体内部的水份是极性分子，在微波的变交电磁场作用下引起强烈的极性震荡，导致细胞分子的间氢键松弛，细胞膜结构电击穿破裂，加速了溶质对机体的渗
9、透和待提取成分的溶剂化 9。 1.3 抗氧化 氧化是衰老的最大威胁， 压力、环境污染等都能让体内自由基泛滥，从而产生氧化现象 10。 研究证明，人体的抗氧化系统是一个可与免疫系统相比拟的、具有完善和复杂的功能的系统，机体抗氧化的能力越强，就越健康，生命也越长。因此研究和开发合适的抗氧化剂对人类的健康发展有很大的影响 11。 目前 , 常用抗氧化剂有丁基羟基茴香醚 (BHA)、二丁基羟基甲苯 (BHT)、没食子酸丙酯 (PG) 和叔丁基对苯二酚 (TBHQ)。但有资料表明 , BHA 和 BHT 可能会致癌并造成肝脏的损害 12 。 4 海藻中提取的多糖抗氧化活性显著 , 来源广泛且无毒副作用
10、, 有望成为新型的抗氧化药用成分 13。 因此蜈蚣藻中多糖物的提取与研究，对开发海藻利用、开发活性海洋天然药物具有重要意义。 2 实验材料、试剂与器材 2.1 材料与试剂 蜈蚣藻；二苯代苦味酰基自由基 (DPPH)；磷酸二氢钠；磷酸氢二钠；盐酸； 三羟甲基氨基甲烷 (tris)；硫酸亚铁；邻二氮菲； H2O2；邻苯三酚；氯仿；正丁醇； 95%乙醇；无水乙醇；葡萄糖；苯酚；浓硫酸； HPLC 甲醇（以上试剂均为分析纯；实验用水均为自制超纯水）。 2.2 主要仪器 仪器名称 型号 厂家 高速万能粉碎机 FW100 天津市泰 斯特仪器有限公司 电热 恒温 水浴锅 HWS12 上海一恒科学仪器有限公司
11、 超声波 清洗 器 SK5200H 上海科导超声仪器有限公司 旋转蒸发 器 RE-52 上海亚荣生化仪器厂 循环水式多用真空泵 SHB-IIIA 河南省太康科教器材厂 电子天平 BSA323S 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司 超纯水器 UPWS-I-20T 杭州永洁达净科技有限公司 离心机 TDL-40B 上海安亭科技仪器厂 电脑微波催化合成萃取仪 LIV-1100 北京祥鸽科技发展有限公司 紫外可见分光光度计 U-2800 日本日立紫外可见分光光度计有限公司 3 实验方法 3.1 蜈蚣藻多糖的提取 基本步骤：处理蜈蚣藻样品微波辅助提取过滤利用氯仿正丁醇萃取离心机中离心去蛋白利用乙醇醇沉出多
12、糖减压浓缩醇沉滤渣复溶减压浓缩干燥粗多糖 14-15 3.1.1 蜈蚣藻的处理 将蚣藻蜈蚣藻剪碎，并用高速万能粉碎机粉碎。 准确称取 1.000 g 的蜈蚣藻粉末于三颈瓶中，加入蒸馏水，采用微波提取。先用纱布过滤，滤渣加入适量的水洗涤，洗涤三次，再用滤纸过滤，取滤液，旋转浓缩至原体积的 1/4，加入 saveg 试剂 （氯仿正丁醇 1： 40） ，振摇 30 min，置于分液漏斗中静置 3 h，取上层溶液，加入 4 倍体积的无水乙醇，静置 24 h，离心，取沉淀， 减压浓缩 后得多糖粗品。取粗多糖粉末加蒸馏水定容至 100 mL 待用 16-17。 3.1.2 葡糖糖标准曲线的制作 准确称取
13、100 mg 干燥恒重的葡萄糖，用蒸馏水溶解、定容、稀释到 100 mL，分别吸取5 0.2 mL、 0.3 mL、 0.4 mL、 0.5 mL、 0.6 mL 稀释液于具塞试管中，补水至 4 mL，精密加入 5 %苯酚溶液 1.0 mL，再迅速加浓硫酸 5.0 mL，在 90 水浴中反应 15 min 后取出，自来水冷却至室温，用分光光度计在 490 nm 处测定其吸光值 ，结果 见图 3-1。 3.1.3 多糖提取率的测定 取制备好的蜈蚣藻多糖溶液 0.3 mL，补水到 3 mL。加入 6 %苯酚 1 mL，混匀后加入浓硫酸 5 mL， 90 水浴中反应 15 min 后取出，流水冷却，
14、在 490 nm 下测定其吸光度，各浓度平行测定三次，以水为空白按上述方法操作。根据葡萄糖标准曲线得出 蜈蚣藻 多糖溶液的浓度。 3.1.4 单因素实验 在保持其他因素相同条件下，分别考察不同提取功率、提取温度、提取时间、液固比各因素对 蜈蚣藻 粗多糖得率的 影响，为正交试验设计各因素水平提供保证。 微波功率对多糖提取 率 的影响：准确称取 1 g 蜈蚣藻粉末 5 份，分别置于三颈瓶中，加入80 mL 的蒸馏水，温度 70 ，分别设置微波功率 500 W、 600 W、 700 W、 800 W、 900 W，提取 10 min。然后按照 3.1.1 项下方法进行操作，用苯酚 硫酸法测定多糖含
15、量，计算 多糖 提取率 ，结果见图 3-2。 提取 温度对多糖提取 率 的影响：准确称取 1 g 蜈蚣藻粉末 5 份，分别置于三颈瓶中，加入80 mL 的蒸馏水，微波功率 600 W，设置温度分别为 60 、 70 、 80 、 90 、 100 ，提取时间 10 min，然后按照 3.1.1 项下方法进行操作，用苯酚 硫酸法测定多糖含量，计算 多糖提取率 ，结果见图 3-3。 提取时间对多糖提取 率 的影响：准确称取 1 g 蜈蚣藻粉末 5 份，分别置于三颈瓶中，加入80 mL 的蒸馏水，微波功率 600 W，温度 90 ，分别提取 6 min、 8 min、 10 min、 12 min、
16、 14 min。然后按照 3.1.1 项下方法进行操作，用苯酚 硫酸法测定多糖含量，计算 多糖 提取率 ，结果见图 3-4。 料液比对多糖提取 率 的影响：准确称取 1 g 蜈蚣藻粉末 5 份，分别置于 三颈瓶中，微波功率 600 W，温度 90 ，分别加入 60 mL、 70 mL、 80 mL、 90 mL、 100 mL 的蒸馏水，提取 10 min。然后按照 3.1.1 项下方法进行操作，用苯酚 硫酸法测定多糖含量，计算 多糖 提取率 ，结果见图 3-5。 3.2 蜈蚣藻多糖抗氧化活性测定 3.2.1 清除 DPPH 自由基的能力测定（ DPPH 法） 18 精密量取 3 mL 乙醇，
17、再取 3 mL DPPH 溶液 （ 0.2 mmol mL-1 临用时配 ） ，充分振摇。 室温暗处静置 30 min，于 517 nm 处测吸光度 Ac 值。分别取 50 g mL-1（ 100 g mL-1、200 g mL-1、 300 g mL-1、 400 g mL-1、 500 g mL-1） 的样品溶液 3 mL，再取 3 mL 乙醇，充分振摇，室温暗处静置 30 min，于 517 nm 处测吸光度 Aj 值。分别取 50 g mL-1（ 100 g mL-1、 200 g mL-1、 300 g mL-1、 400 g mL-1、 500 g mL-1） 的样品液 3 mL，
18、再取 3 mL DPPH 溶液，充分振荡。室温暗处静置 30 min，测吸光度 Ai 值。平行测定 3 次取平均值，计算清除 率 ，结果见图 3-6。 清除率公式为： K(%)=(Ac+Aj-Ai)/Ac 100% 3.2.2 清除 OH 自由基能力的测定（ H2O2 /Fe 体系法） 19 6 取浓度为 0.75 mmol L-1 邻二氮菲 1 mL 于具塞试管中，依次加入 PBS（ pH 值为 7.40 磷酸盐缓冲液） 2 mL，充分混匀后加入浓度为 0.75 mmol L-1 的硫酸亚铁 1 mL，混匀，加 H2O2 1 mL，蒸馏水定容到 7 mL，于 37 水浴 60 min，于 5
19、36 nm 处测其吸光度为 Ap。用 1 mL 蒸馏水代替 1 mL H2O2 为 Ab。用 1 mL 样品 50 g mL-1（ 100 g mL-1、 200 g mL-1、 300 g mL-1、 400 g mL-1 、 500 g mL-1） 代替 1 mL 的蒸馏水为 As；平行测 3 次取平均值，计算清除率 ，结果见图 3-7。 清除率公式为： K(%)=(As-Ap) / (Ab-Ap)100%。 4 实验结果 4.1 葡萄糖标准曲线的制备 图 3-1 葡萄糖标准曲线 以吸光度为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。回归方程 y=12.432x + 0.027，R2 =0.
20、9992， 结果表明葡萄糖质量浓度在 10 60 g mL-1 范围内与其吸光度值呈现良好的线性关系。 4.2 单因素试验 4.2.1 微波功率对多糖提取率的影响 图 3-2 微波功率对提取率的影响 由图 3-2 可知微波功率有明显的最佳点，功率在 500W 时提取率较低，这可能是由于功率较低时微波对细胞膜的破碎作用比较小，分子运动也不剧烈，故多糖的提取率不高。随着功率的增大，分子运动加剧，细胞膜破碎程度加大，另外，微波的选择性加热的性能起到了一定的作用，多糖的提取率也随之增大。但当微波的功率太大时，细胞膜并不会无限 制的破碎，7 而微波对细胞内物质的选择性加热性能差异则减少，一些易溶于水的物
21、质先被溶解，造成多糖的提取率降低 20。 4.2.2 温度对多糖提取率的影响 图 3-3 微波温度对提取率的影响 由图 3-3 可知随温度的升高多糖的提取率也随之增加。当温度达到 90 时，多糖的浸出率增幅变缓。这是因为在低温时，水对有效成分的溶解度低，尽管在微波的作用下，细胞膜破裂使有效成分易溶出，但溶解度低使得多糖仍然不能很好的被提取。升温后，溶解度增大，多糖的得率也就提高了。但到一定程度，溶解度达到饱和就不再继续上 升了。 4.2.3 提取时间对多糖提取率的影响 图 3-4 微波提取时间对提取率的影响 由图 3-4 可知在微波辅助的情况下，提取率随提取时间的延长而先增加后下降。这可能是因
22、为多糖在微波处理后，多糖成分还未完全溶解充分，需要有一定的浸提时间来溶解 21。但时间过长，会使其他成分溶出而使多糖的溶解率降低从而使提取率降低。 4.2.4 料液比对多糖提取率的影响 8 图 3-5 不同料液比对提取率的影响 由图 3-5 可知液料比增加会使提取率增加，这是因为溶液越多溶解的溶质 越多。 4.3 正交试验 在单因素试验基础上，考虑实验条件，在 90条件下，以水为提取剂，选取料液比、浸提时间、微波功率为影响因素，采用正交试验确定各因素不同水平对蜈蚣藻多糖提取率的影响，其因素水平设置见表 1，选用 L9(3 3)正交表试验方案设计。结果见表 2，表 3。 表 1 因素水平设置表
23、水平 因素 提取时间（ min） 功率（ W） 料液比（ g： ml） 1 6 400 1： 70 2 8 500 1： 80 3 10 600 1： 90 表 2 正交试验数据 因素 时间 功率 液固比 提取率（ %） 实 验 1 1 1 1 14.33 实验 2 1 2 2 16.24 实验 3 1 3 3 17.23 实验 4 2 1 3 14.67 实验 5 2 2 1 16.79 实验 6 2 3 2 17.81 实验 7 3 1 2 14.11 实验 8 3 2 3 16.99 实验 9 3 3 1 18.13 k1 15.933 14.370 16.377 k2 16.423 16.673 16.347 k3 16.410 17.723 16.043
