1、 本科毕业论文 （ 20 届） 微波超声波辅助提取蜈蚣藻多糖工艺研究 所在学院 专业班级 药学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 目录 摘要 . 错误 !未定义书签。 Abstract . 错误 !未定义书签。 1 前言 . 3 1.1 蜈蚣藻及其多糖 . 3 1.2 微波、超声波浸提特征 . 3 1.2.1 微波 . 3 1.2.2 超声波 . 3 1.2.3 伴随着生物效应 . 3 1.3 水提醇沉法 . 4 2 实验材料、主要仪器与试剂 . 4 2.1 实验材料 与试剂 . 4 2.2 主要仪器 . 4 3 实验方法 . 5 3.1 蜈蚣藻多糖的提取 . 5 3.1.1
2、蜈蚣藻的处理 . 5 3.1.2 葡糖糖标准曲线的制作 . 5 3.1.3 多糖 提取率的测定 . 5 3.1.4 单因素实验 . 5 4 实验结果 . 6 4.1 葡萄糖标准曲线的 绘制 . 6 4.2.1 微波功率对多糖提取率的影响 . 6 4.2.2 超声波功率对多糖提取率的影响 . 7 4.2.2 温度对多糖提取率的影响 . 7 4.2.3 提取时间对多糖提取率的影响 . 7 4.2.4 料液比对多糖提取率的影响 . 7 4.3 正交试验 . 8 4.3.1 实验安排 . 8 4.3.2 直观分析 . 8 4.3.3 方差分析 . 9 5 讨论 . 10 6 结论 .11 参考文献 .
3、 错误 !未定义书签。 致 谢 . 错误 !未定义书签。 1 摘要 目的：在水提醇沉法提取蜈蚣藻多糖工艺的基础上，利用微波、超声波作为辅助，并通过正交试验优选出一组提取率最高的实验方案。方法：以温度、固液比、提取时间、微波功率、超声波功率为单因素，采用正交试 验分组进行试验获得多糖，并测定每组多糖溶液的吸光度，通过对照葡萄糖溶液标准曲线得到多糖溶液的浓度。实验结果： 在 微波、 微波辅助提取蜈蚣藻多糖的实验中，在微波功率 600w， 超声波功率 900w 浸提时间 10min，温度 100。C，液固比为 1:70 时提取率最大。 结论 :该工艺条件稳定可行 ,可以作为 蜈蚣藻 多糖的提取工艺参
4、考。 关键词 蜈蚣藻；多糖；微波；超声波；提取率 2 Abstract Objective: The extraction of water extraction and alcohol precipitation process centipede polysaccharide, based on the use of microwave and ultrasound as a supplement, and adopted a set of orthogonal design extraction rate was highest in the experimental program.M
5、ethods: temperature, solid to liquid ratio, extraction time and microwave power, ultrasonic power for the single-factor test used to obtain orthogonal group polysaccharides, and absorbance measured each polysaccharide solution, glucose solution through the standard curve were obtained polysaccharide
6、 solution concentration.Results: In the microwave, microwave assisted extraction experiments centipede polysaccharide, in the microwave power 600w, 900w power ultrasonic extraction time 10min, the temperature 100.C, liquid to solid ratio of 1:70 when the maximum extraction rate.Conclusion: The techn
7、ological condition was stable and feasible, can be used as the extraction process centipede polysaccharide reference. Key words Grateloupia filicna； polysaccharide； microwave； ultrasonic； extraction rate. 3 1 前言 1.1 蜈蚣藻及其多糖 蜈蚣藻 (Grateloupia filicina C.Ag)为一种红藻海膜科 (Halymeniaceae)蜈蚣藻 (Grate2loupia)藻类。
8、蜈蚣藻是我国东南海域常见的大型藻类， 生长在低潮线， 我国沿海地区均有分布，可以进行规模化的人工养殖。自古以来就被作为一种海洋中药，具有清热解毒和驱虫之功效，并且资源丰富，在我国的山东青岛、大连等沿海地区有着广泛的分布，并被当地人所食用。蜈蚣藻含有 4-羟基 -3-甲氧基苯甲醛 (1), 4-羟基 -3, 5-二甲氧基苯甲醛 (2)、 3-溴 -4, 5-二羟基苯甲醛 (3)、 2-溴 -4, 5-二羟基苯甲醛 (4)等 15个化合物。蜈蚣藻多糖是蜈蚣藻的重要组成成分， 是一种硫酸化多糖， 具有提高机体免疫、抗病毒、抗肿瘤、抗突变等多种功效。近年来受到国内外广泛关注。 1.2 微波、超声波浸提
9、特征 微波超声波辅助提取作为一种优良的提取方法，具有提取时间短、提取率高、提取物结构未被破坏等特点，己广泛应用在生物活性物质的提取方面 1.2.1 微波 在高频微波的作用下，溶剂和溶质中的偶极分子产 生偶极涡流，离子传导和高频率摩擦，从而在极短时间内产生极大的热量。偶极分子旋转导致的弱氢键破裂，离子迁移等还加速了溶剂分子对样品机体的渗透，使待提物很快溶剂化，这种现象吧可使微波萃取时间显著缩短。 1.2.2 超声波 超声波提取就是利用超声波具有的机械效应， 空化效应及热效应，通过增加介质分子的运动速 度，增大介质的穿透力以提取有效成分的方法 。 主要是通过压电换能器产生的快 速机械振动波来减少目
10、标萃取物与样品基体之间的作用力从而实现固 -液萃取分离。 （ 1） 加速介质质点运动。高于 20 KHz声波频率的 超声波的连续介质（例如水）中传播时，根据惠更斯波动原理，在其传播的波阵面上将引起介质质点（包括药材重要效成分的质点）的运动，使介质质点运动获行巨大的加速度和动能。质点的加速度经计算一般可达重力加速度的二千倍以上。 （ 2）空化作用。超声波在液体介质中传播产生特殊 的 “ 空化效应 ” ， “ 空化效应 ” 不断产生无数内部压力达到上千个大气压的微气穴并不断 “爆破 ”产 生微观上的强大冲击波作用在中药材上，使其中药材成分物质被 “ 轰击 ” 逸出，并使得药材基体被不 断剥蚀，其中
11、不属于植物结构的药效成分不断被分 离出来。 （ 3）超声波的振动匀化（ Sonication）使样品介质内各点受到的作用一致，使整个样品萃取更均匀。 1.2.3 伴随着生物效应 微波 、超声波 加热过程中除热效应之外，还有生物效应。由于物体内部的水份是极性分子，在微波的变交电磁场作用下引起强烈的极性震荡，导致细胞分子的间氢键松弛，细胞膜结构电击穿破裂，加速了溶质对机体的渗透和待提取成分的溶剂化。 1.3 水提醇沉法 水提醇沉法（水醇法）系指在中药水提浓缩液中，加入乙醇使达不同含醇量，某些药4 物成分在醇溶液中溶解度降低析出沉淀，固 液分离后使水提液得以精制的方法。一般操作过程是：将中药水提液浓
12、缩至 1 1 1 2（ ml g），药液放冷后，边搅拌边缓慢加入乙醇使达规定含醇量，密闭冷藏 12h，滤过，滤液回收乙醇，得到精制液。 2 实验材料、主要仪器与试剂 2.1 材料与试剂 试剂 规格 蜈蚣藻 二苯代苦味酰基自由基 (DPPH) 分析纯 AP 磷酸二氢钠 分析纯 AP 磷酸氢二钠 分析纯 AP 盐酸 分析纯 AP 三羟甲基氨基甲烷 (tris) 分析纯 AP 硫酸亚铁 分析纯 AP 邻二氮菲； H2O2 分析纯 AP 邻苯三酚 分析纯 AP 氯仿 分析纯 AP 正丁醇 分析纯 AP 95%乙醇 分析纯 AP 无水乙醇 分析纯 AP 葡萄糖 分析纯 AP 苯酚 分析纯 AP 浓硫酸
13、分析纯 AP HPLC 甲醇 分析纯 AP 实验用水均为自制超纯水 2.2 主要仪器 仪器名称 型号 厂家 高速万能粉碎机 FW100 天津市泰斯特仪器有限公司 电热 恒温 水浴锅 HWS12 上海一恒科学仪器有限公司 超声波 清洗 器 SK5200H 上海科导超声仪器有限公司 旋转蒸发 器 RE-52 上海亚荣生化仪器厂 循环水式多用真空泵 SHB-IIIA 河南省太康科教器材厂 电子天平 BSA323S 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司 超纯水器 UPWS-I-20T 杭州永洁达净科技有限公司 离心机 TDL-40B 上海安亭科技仪器厂 电脑微波催化合成萃取仪 LIV-1100 北京祥鸽科
14、技发展有限公司 紫外可见分光光度计 U-2800 日本日立紫外可见分光光度计有限公司 3 实 验方法 5 3.1 蜈蚣藻多糖的提取 基本步骤：将蜈蚣藻样品处理微波辅助提取过滤利用氯仿正丁醇萃取离心机中离心去蛋白利用乙醇醇沉出多糖减压浓缩醇沉滤渣复溶减压浓缩干燥粗多糖14-15 3.1.1 蜈蚣藻的处理 将 晒干的 蚣藻蜈蚣藻剪碎，并用高速万能粉碎机粉碎。 准确称取 1.000 g 的蜈蚣藻粉末于三颈瓶中，加入蒸馏水，采用微波提取。先用纱布过滤，滤渣加入适量的水洗涤，洗涤三次，再用滤纸过滤，取滤液，旋转浓缩至原体积的 1/4，加入 saveg 试剂，振摇 30 min，置于分液漏斗中静置 3 h
15、，取上层溶 液，加入 4 倍体积的无水乙醇，静置 24 h，离心，取沉淀，真空冷冻干燥后得多糖粗品。取粗多糖粉末加蒸馏水定容至 100 mL 待用。 3.1.2 葡糖糖标准曲线的制作 准确称取 100 mg 干燥恒重的葡萄糖，用蒸馏水溶解、定容、稀释到 100 mL，分别吸取0.2 mL、 0.3 mL、 0.4 mL、 0.5 mL、 0.6 mL 稀释液于具塞试管中，补水至 4 mL，精密加入 5 %苯酚溶液 1.0 mL，再迅速加浓硫酸 5.0 mL，在 90 水浴中反应 15 min 后取出，自来水冷却至室温，用分光光度计在 490 nm 处测定其吸光值 ，结果 见图 4-1。 3.1
16、.3 多糖提取率的测定 取制备好的蜈蚣藻多糖溶液 0.3 mL，补水到 3 mL。加入 6 %苯酚 1 mL，混匀后加入浓硫酸 5 mL， 90 水浴中反应 15 min 后取出，流水冷却，在 490 nm 下测定其吸光度，各浓度平行测定三次，以水为空白按上述方法操作。根据葡萄糖标准曲线得出 蜈蚣藻 多糖溶液的浓度。 3.1.4 单因素实验 在保持其他因素相同条件下，分别考察不同提取功率 （微波、超声波） 、提取温度、提取时间、液固比各因素对 蜈蚣藻 粗多糖得率的影响，为正交试验设计各因素水平提供保证。 首先固定微 波功率为 600W、超声波功率 900W、温度 90 、提取时间为 10 分钟
17、，以固液比为因素，分别以料液比为 1:70、 1:80、 1:90 进行多糖的提取实验，将获得的提取率最高的料液比作为作为正交试验的参考数据，同样的方法再以微波功率为因素进行实验。以此类推。 微波功率对多糖提取 率 的影响：准确称取 1 g 蜈蚣藻粉末 5 份，分别置于三颈瓶中，加入 80 mL 的蒸馏水，温度 70 ，分别设置微波功率 500 W、 600 W、 700 W、 800 W、 900 W，提取 10 min。然后按照 3.1.1 项下方法进行操作，用苯酚 硫酸法 测定多糖含量，计算 多糖提取率 ，结果见图 4-2。 超声波功率对多糖提取率的影响：准确称取蜈蚣藻粉末 5 份，每份
18、 1.0g，分别置于三颈瓶中，加入 80ml 蒸馏水， 控制温度为 80 ，分别设置超声波的功率 600w、 700 W、 800 W、900 W、 1000W，提取 10min， 然后按照 3.1.1 项下方法进行操作，用苯酚 硫酸法测定多糖含量，计算 多糖 提取率 ，结果见图 4-3。 提取 温度对多糖提取 率 的影响：准确称取 1 g 蜈蚣藻粉末 5 份，分别置于三颈瓶中，加入 80 mL 的蒸馏水，微波功率 600 W，设置温度分别为 60 、 70 、 80 、 90 、 100 ，提取时间 10 min，然后按照 3.1.1 项下方法进行操作，用苯酚 硫酸法测定多糖含量，计算6 多
19、糖 提取率 ，结果见图 4-4。 提取时间对多糖提取 率 的影响：准确称取 1 g 蜈蚣藻粉末 5 份，分别置于三颈瓶中，加入 80 mL 的蒸馏水，微波功率 600 W，温度 90 ，分别提取 6 min、 8 min、 10 min、 12 min、14 min。然后按照 3.1.1 项下方法进行操作，用苯酚 硫酸法测定多糖含量，计算 多糖 提取率 ，结果见图 4-5。 料液比对多糖提取 率 的影响：准确称取 1 g 蜈蚣藻粉 末 5 份，分别置于三颈瓶中，微波功率 600 W，温度 90 ，分别加入 60 mL、 70 mL、 80 mL、 90 mL、 100 mL 的蒸馏水，提取 1
20、0 min。然后按照 3.1.1 项下方法进行操作，用苯酚 硫酸法测定多糖含量，计算 多糖 提取率 ，结果见图 4-6。 4 实验结果 4.1 葡萄糖标准曲线的 绘制 图 4-1 葡萄糖标准曲线 以吸光度为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。回归方程 y=12.432x + 0.027，R2 =0.9992，结果表明葡萄糖质量浓度在 10 60 g mL-1范围 内与其吸光度值呈现良好的线性关系。 4.2.1 微波功率对多糖提取率的影响 图 4-2 微波功率对提取率的影响 4.2.2 超声波功率对多糖提取率的影响 7 图 4-3 微波温度对提取率的影响 4.2.2 温度对多糖提取率的影响
21、 图 4-4 微波温度对提取率的影响 4.2.3 提取时间对多糖提取率的影响 图 3-4 微波提取时间对提取率的影响 图 4-5 提取时间 对提取率的影响 4.2.4 料液比对多糖提取率的影响 图 4-6 不同料液比对提取率的影响 8 4.3 正交试验 4.3.1 实验安排 在单因素实验的基础上，以微波、超声波、料液比、提取温度提取时间为因素，设计L16(45)(5 因素 4 水平 )正交试验表。其中各个因素的水平值取单因素实验结果中提取率最高值以及其最近的 3 个值。 表 1 因素水平设置表 水平 因素 微波功率 /W 超声波功率 /W 提取时间（ min） 提取温度（ 。 C） 固液比（
22、g： ml） 1 500 700 6 70 1： 60 2 600 800 8 80 1： 70 3 700 900 10 90 1： 80 4 800 1000 12 100 1:90 表 2正交试验设计 实验号 微波功 率 超声波功率 时间 温度 液固比 多糖提取率（ %） 1 1 1 1 1 1 15.13 2 1 2 2 2 2 14.91 3 1 3 3 3 3 16.21 4 1 4 4 4 4 17.42 5 2 1 2 3 4 13.21 6 2 2 1 4 3 14.56 7 2 3 4 1 2 17.22 8 2 4 3 2 1 16.39 9 3 1 3 4 2 18.1
23、1 10 3 2 4 3 1 14.32 11 3 3 1 2 4 16.57 12 3 4 2 1 3 15.82 13 4 1 4 2 3 14.3 14 4 2 3 1 4 16.38 15 4 3 2 4 1 13.56 16 4 4 1 3 2 14.98 K1 15.92 15.19 15.31 16.14 14.85 K2 15.35 15.04 14.38 15.54 16.31 K3 16.20 15.89 16.77 14.68 15.22 K4 14.81 16.15 16.15 15.82 15.90 Rj 1.39 1.11 2.39 1.46 1.46 4.3.2 直观分析 比较各因素的极差可知 R3R4=R5R1R2，因此各个因素对多糖提取率影响大小排序为时间、温度、固液比、微波、超声波。为考察各因素与实验指标间的关系，先以因素作为横
