1、 本科毕业论文 （ 20 届） 蜈蚣藻多糖的制备工艺及抗肿瘤活性的研究 所在学院 专业班级 药学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 1 目录 摘要 .2 ABSTRACT. .3 1 前言 .4 2 实验材料、试剂与器材 .4 2.1 材料 .4 2.2 试剂 .4 2.3 主要仪器 .5 3 实验方法 .5 3.1 蜈蚣藻多糖的提取 .5 3.2 葡萄糖标准曲线制定 .5 3.3 样品的测定 .6 3.4 单因素试验 .6 3.5 正交试验 .6 3.6 蜈蚣藻多糖的分离纯化研究 .7 3.7 细胞培养 .7 3.8 细胞增殖抑制率的测定 (采用 MTT 法 ) .7 4 实
2、验结果与分析 .8 4.1 葡萄糖标准曲线的制 备 .8 4.2 单因素试验 .9 4.3 正交试验 .10 4.4 离子交换纤维素 DEAE-52 纯化蜈蚣藻多糖 . 11 4.5 多糖抗肿瘤研究 .12 5讨论与小结 .12 参考文献 .13 2 摘要 目的： 蜈蚣藻多糖制备 工艺的最佳参数组合的影响因素 与 抗肿瘤活性的研究 。方法：用水作为溶剂，利用微波辅助加热提取蜈蚣藻多糖；用苯酚 -硫酸法测定含量； 采用正交试验法蜈蚣藻的制备工艺及抗肿瘤活性的研究方法 。 结论： 在微波辅助提取蜈蚣藻多糖的实验中，在微波功率 600W，浸提时间 10min，温度 90 ，料液比 （ g： ml）
3、为 1： 80 时提取率最大。蜈蚣藻多糖具有一定的抗肿瘤能力，且随 时间与 多糖浓度的增加而对 肿瘤细胞抑制作用 增强。 关键词 蜈蚣藻；多糖； 正交试验 ； 抗肿瘤 3 Abstract Objective: The best preparation technology of Grateloupia filicna influence factors of parameters combination with antitumor activity of research. Methods： The experiment use industrial methanol to immerse
4、 and ethyl acetate to extract and D101 macroporous adsorption resin Grateloupia filicina polysaccharide. With sulfuric acid - phenol content determination; orthogonal experimental method Grateloupia filicna production process and antitumor activity research methods. Results ： In microwave-assisted e
5、xtraction Grateloupia filicna experiments, in microwave power 600W, Immersion mention time for 10 minutes , temperature 90 , Liquid materials for 1:80 for extraction is the largest. The centipede alga has certain antitumor ability, and over time increases with polysaccharide concentration of tumor c
6、ells inhibition enhanced. Key words Grateloupia filicna Polysaccharide Orthogonal test Antitumor 4 1 前言 1.1 蜈蚣藻 中国海藻志 1报道中国分布的蜈蚣藻为 Grateloupia filicina(Lamouroux) C.Ag.属于红藻门、真红藻纲、隐 丝藻目、海膜科、蜈蚣藻属，藻体紫红色，粘滑，丛生，线形或略扁压，单一及顶，主干明显，规则或不规则的羽状分枝，生长在低潮带附近岩石和贻贝养殖架上，为世界性的暖温带型海藻。多可食用或作制胶原料，广东潮阳等地居民常用作驱蛔虫药 2。在我国的青岛
7、、大连等地沿海有着广泛的分布，并被当地人所食用。中国蜈蚣藻属共报道 32 种。蜈蚣藻属海藻种类的外部形态各种各样，变异很大，如带形蜈蚣藻为黏滑的叶片状，而繁枝蜈蚣藻为硬的革质的线形，同一种类的形态也因生态环境、地域的不同变化很大，种的区分、鉴定非常困难 3。 1.2 多糖 多糖是指由 10 个以上单糖分子缩合而成的多聚物。最初被认为是无任何生理效应的纯粹的结构物质，然而随着进一步的研究，人们惊奇地发现多糖及其缀合物在免疫调节 4、抗肿瘤、抗炎、抗溃疡、降低胆固醇、降血糖 5以及抗血栓等多方面具有良好的药理活性 6，其中免疫调节和抗肿瘤活性最引人注目。多糖在自然界分布很广，尤其是高等植物多糖和食
8、用真菌多糖具有疾病治疗范围广和相对毒性较低的特点，在医学领域引起广泛的注意 7，已经成为国内外专家学者关注的研究热点，且人参、黄芪、灵芝、茯苓和香菇多糖在增强癌症患者免疫力、改善临 床症状、提高生活质量、延长生存时间等方面，已被广泛用于各种肿瘤的治疗 8-9。 1.3 抗肿瘤 随着现代社会的发展 ,生存环境的恶化以及社会压力的加大使现代人的健康受到严重的威胁 ,导致机体各种疾病产生 ,已经引起人们强烈的重视。而 肿瘤仍是当今世界直接危及人类生命的一种最常 见 、最严重的疾 病 。 据世界卫生组织报告 :全世界现有肿瘤 患者 约 7600 万 ,每年新增 700 万 ,因癌症死亡 的达 600
9、万 ,占总死亡人数的 12 % ; 在我 国 ,肿瘤在前 十名主要疾病排名中列第二位 ,死亡率为 8 . 58/ 10 万 ,占 死亡总人数的 21 . 58 % 。近几年来 ,肿瘤化疗取得了一定的进展 ,肿瘤患者的生存时间明显延长 ,尤其是在对白血 病 、恶性淋巴瘤 方 面 。 但仍没有 取得令人满意的疗 效 ,尤其是在致 命性最强的实体瘤方 面 10-11。 海藻中提取的多糖抗肿瘤活性显著 , 来源广泛且无毒副作用 , 有望成为新型的抗肿瘤药用成分 12。 因此蜈蚣藻中多糖物的提取与研究，对开发海藻利用、开发活性海洋天然药物具有重要意义。 2 实验 材料、试剂与器材 2.1 材料 蜈蚣藻于
10、 2009 年 12 月 购于江苏昆山一弘藻业有限公司 ，由浙 江海洋学院王斌博士鉴定为蜈蚣藻 Grateloupia filicina (Lamouroux) C.Ag.蜈蚣藻 购买后 晒干 、 粉碎备用。 2.2 试剂 5 石油醚、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇、 浓硫酸、乙醇、 三氯化铁、铁氰化钾 、 硫酸、苯酚、葡萄糖对照品、 二苯代苦味酰基自由基 (DPPH)、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、 三羟甲基氨基甲烷 (tris)、 硫酸亚铁、邻二氮菲、 双氧水均为国产分析纯 ； 试验用水均为自制超纯水；薄层层析硅胶 GF254购于青岛海洋化工公司；柱色谱用硅胶 200300目购于青岛海洋化工公司； HP
11、LC甲醇购于上海豪 恩化工有限公司，色谱纯 ； 胎牛血清购于杭州四季青生物工程有限公司；胰蛋白酶、 F12 粉末培养基和 MTT 均购于美国 SIGMA 公司；二四基亚砜购于美国 AMRESCO公司；人前列腺癌细胞 DU145 与 PC-3 原购于中科院上海细胞库。 2.3 主要仪器 仪器名称 型号 厂家 高速万能粉碎机 FW100 天津市泰斯特仪器有限公司 电热 恒温 水浴锅 HWS12 上海一恒科学仪器有限公司 超声波 清洗 器 SK5200H 上海科导超声仪器有限公司 旋转蒸发 器 RE-52 上海亚荣生化仪器厂 循环水式多用真空泵 SHB-IIIA 河南省太康科教器材厂 电子天平 BS
12、A323S 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司 超纯水器 UPWS-I-20T 杭州永洁达净科技有限公司 紫外可见分光光度计 U-2800 日本日立紫外可见分光光度计有限公司 冷却水循环装置 CA-111 上海爱朗仪器有限公司 高效液相色谱 P1201 大连伊利特科技有限公司 微波催化合成萃取仪 LIV-1100 北京祥鸽科技发展有限公司 离心机 TDL-40B 上海安亭科技仪器厂 真空干燥箱 DZF-605 上海精宏实验设备有限公司 超净工作台 C-1209 上海智诚分析仪器制造有限公司 CO2 培养箱 Forma 3111 美国 Thermo 公司 酶标仪 680 美国 Bio-Rad 公司
13、 3 实验方法 3.1 蜈蚣藻多糖的提取 13-15 准确称取 1.000 g 的蜈蚣藻粉末于三颈瓶中，加入蒸馏水，采用微波提取。先用纱布过滤，滤渣加入适量的水洗涤，洗涤三次，再用滤纸过滤，取滤液，旋转浓缩至原体积的 1/4，加入 saveg 试剂 （ 氯仿：正丁醇 3： 1 混合摇匀 ） ，振摇 30 min，置于分液漏斗中静置 3 h，取上层溶液，加入 4 倍体积的无水乙醇，静置 24 h，离 心，取沉淀，真空冷冻干燥后得多糖粗品。取粗多糖粉末加蒸馏水定容至 100 mL 待用。 基本步骤：将蜈蚣藻样品处理 微波提取 过滤 旋转浓缩 萃取 醇沉 离心 取渣真空冷冻干燥 粗多糖 加蒸馏水定容
14、 3.2 葡萄糖标准曲线制定 6 准确称取 10 mg 干燥恒重的葡萄糖，用蒸馏水溶解、定容、稀释到 100 mL， 精密吸取0.0， 0.1， 0.2， 0.4， 0.6， 0.8， 1.0 mL， 稀释液于具塞试管中，补水至 4 mL，精密加入 6 %苯酚溶液 1.0 mL，再迅速加浓硫酸 5.0 mL，在 90 水浴中反应 15 min 后取出，自 来水冷却至室温，用分光光度计在 490 nm 处测定其吸光值 ， 以蒸馏水为空白 。 以吸光度为纵坐标，多糖的浓度为横坐标，得标准曲线计算回归方程， 结果 见图 3-1。 3.3 样品的测定 取制备好的蜈蚣藻多糖溶液 4 mL。 加入 6%苯
15、酚 1 .0mL，混匀后加入浓硫酸 5 mL， 90 水浴中反应 15 min 后取出，流水冷却，在 490 nm 下测定其吸光度 ， 同样处理蒸馏水为空白 。根据葡萄糖标准曲线得出 蜈蚣藻 多糖溶液的浓度 16-18。 3.4 单因素试验 通过单因素试验方法探索蜈蚣藻多糖制备工艺的最佳参数组合的影响因素，主要包括水、提取时间、微波功率、固液比等因素对蜈蚣藻提取率的影响 。 微波功率对多糖提取 率 的影响：准确称取 1.000 g 蜈蚣藻粉末 6 份，分别置于三颈瓶中，加入 80 mL 的蒸馏水，温度 90 ，分别设置微波功率 400 W、 500 W、 600 W、 700 W、 800 W
16、、900W，提取 10 min。然后按照 3.1 项下方法进行操作， 用苯酚 硫酸法测定多糖含量，计算多糖 提取率 ，结果见图 3-2。 提取 温度对多糖提取 率 的影响：准确称取 1.000 g 蜈蚣藻粉末 6 份，分别置于三颈瓶中，加入 80 mL 的蒸馏水，微波功率 600 W，设置温度分别为 60 、 70 、 80 、 90 、 100 、110 ，提取时间 10 min，然后按照 3.1 项下方法进行操作， 用苯酚 硫酸法测定多糖含量，计算 多糖 提取率 ， 结果见图 3-3。 提取时间对多糖提 取 率 的影响：准确称取 1.000g 蜈蚣藻粉末 6 份，分别置于三颈瓶中，加入 8
17、0 mL 的蒸馏水，微波功率 600 W，温度 90 ，分别提取 4 min、 6min、 8min、 10 min、12 min、 14 min。然后按照 3.1 项下方法进行操作，用苯酚 硫酸法测定多糖含量，计算 多糖提取率 ，结果见图 3-4。 料液比对多糖提取 率 的影响：准确称取 1.000 g 蜈蚣藻粉末 6 份，分别置于三颈瓶中，微波功率 600 W，温度 90 ，分别加入 50 mL、 60 mL、 70 mL、 80 mL、 90 mL、 100 mL 的蒸馏水，提取 10 min。然后按照 3.1 项下方法进行操作，用苯酚 硫酸法测定多糖含量，计算 多糖 提取率 ，结果见图
18、 3-5。 3.5 正交试验 在单因素试验基础上，考虑实验条件，在 600w微波功率条件下，以水为提取剂，选取固液比、浸提时间、功率为影响因素，采用正交试验确定各因素不同水平对蜈蚣藻多糖提取率的影响，结果见表 3、表 4、表 5。 编号 1 2 3 4 5 6 7 葡萄糖 0.0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水 4.0 3.9 3.8 3.6 3.4 3.2 3.0 6%苯酚 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 浓硫酸 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 7 3.6 蜈蚣藻多糖的分离纯化研究 3.6.1 D101 大孔吸附树脂的预
19、处理 D101 大孔树脂使用前要经过预处理除杂，用 2 倍体积 95%乙醇将大孔吸附树脂浸泡过夜，处理数次，直到取乙醇和水 1:5 混合 无白色浑浊为止，然后用蒸馏水洗涤树脂至无醇味，之后分别用 2% HCl 溶液 和 2% NaOH 溶液 浸泡树脂 30 min 后 用蒸馏水洗至中性。最后将 D101 大孔树脂浸泡于蒸馏水中，备用。 3.6.2 D101 大孔吸附树脂除色素 取粗多糖溶液 100 mL 置于 烧杯 中，向其中加入经预处理的树脂 10 g，在磁力搅拌下吸附2 h，然后过滤，收集滤液。 3.6.3 离子交换纤维素 DEAE-52 纯化蜈蚣藻多糖 离子交换纤维素 DEAE-52 的
20、处理：称取 50 g DEAE-52 加入 2 倍量的水，浸泡 24 h，使纤维素 DEAE-52 颗粒充 分膨胀，去除悬浮的细颗粒。然后再加 2 倍量的 0.5 molL-1 HCL 浸泡搅拌 0.5 h，滤去酸液，反复用水洗至中性，再加 2 倍量的 0.5 molL-1 NaOH 浸泡搅拌 0.5 h，滤去碱液，反复用水洗至中性。如此酸碱反复洗涤，直至洗出液无色澄清为止，最后再用蒸馏水浸泡。 纤维素层析柱制备：先将纤维素层析柱垂直架好连接到层析系统上，用适量的蒸馏水排走其中的空气，将上述处理的 DEAE-52 填料加蒸馏水搅拌均匀后，立即连续倾入柱中，同时打开柱下端旋塞，让溶剂慢慢流出，使
21、柱内端 DEAE-52 填料不再沉降，最后用 3 倍体积的蒸馏水充分淋洗，使层析柱达到平衡状态。 上样：取粗多糖溶液 10 mL，过滤后将多糖溶液用胶头滴管沿柱内壁缓慢均匀加入多糖溶液，当多糖溶液几乎全部进入柱床后，沿柱内壁缓慢加入洗脱液稍高于柱上端，旋紧层析柱旋塞，打开层析系统。 洗脱：依次用蒸馏水， 0.05molL-1、 0.1molL-1、 0.25molL-1、 0.5molL-1、 1.0molL-1的 Nacl 溶液相继进行梯度洗脱。用自动收集器收集 流出液 ，控制流速为 0.5 mLmin-1，每 10 mL收集 1 管。将收集液按试管顺序采用苯酚一硫酸 法测吸光度值。以试管号
22、为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制洗脱曲线，分别 合并 各单一峰的 流出液 。 实验结果见图 3-6。 多糖中小分子杂质的去除：将收集液置于半透膜透析袋中，扎紧袋口，将其放入盛有蒸馏水的水槽中，不断用流水透析，透析 24 h，以除去 Nacl 等无机盐及低聚糖等小分子杂质。最后，将收集液真空冷冻干燥，低温贮存，备用。 3.7 细胞培养 选取人前列腺癌细胞 DU145与 PC-3，用含 10%小牛血清的 RPMI1640完全培养基于 37 ，5% CO2 培养箱中培养至对数生长期 。 3.8 细胞增殖抑制率的测定 (采用 MTT 法 ) 配制 PBS 溶液 (pH 值为 7.2)和实验所需浓度的多
23、糖溶液 。取 对数生长期的前列腺癌细胞DU-145 和 PC-3 分别制成悬液 ， 接种至 96 孔板 ，每孔 200 L，于 5% CO2， 37 贴壁 4 h，8 吸 取 培养液，然后分别加入不同浓度的蜈蚣藻多糖溶液，每个浓度设 3 个平行孔，同时设不加多糖溶液的对照组 ， 置 5% CO2， 37 培养箱中孵育实验所需时间 ， 培养结束加入 20 L 的MTT 和 180 L的 PBS 继续培养 4 h， 吸弃 96 孔板的液体，加入 150 L的 DMSO，振荡 10 min。置酶联免疫检测仪在 490 nm 测吸光度 ， 计算细胞增殖抑制指数，按下列公式计算： 细胞增殖抑制指数 =(
24、对照组 A 值 -药物组 A 值 )/对照组 A 值 100% 将 GFP-1与 GFP-2 配置成浓度分别为 0.5 mgmL-1， 1.0 mgmL-1， 1.5 mgmL-1， 2.0 mgmL-1，2.5 mgmL-1 五个浓度组，分别测定作用 24 h、 48 h 和 72 h 后，对 DU-145 和 PC-3 细胞增殖的影响 ，实验结果见表 3-5 与表 3-6。 4 实验结果与分析 4.1 葡萄糖标准曲线的制备 根据 3.1 所示步骤得吸光度值如下表 1 表 1 葡萄 糖标准溶液浓度与吸光度值 编号 1 2 3 4 5 6 7 葡萄糖浓度 ( g/mL) 0.0 2.5 5.0
25、 10.0 15.0 20.0 25.0 吸光度 A 0.000 0.015 0.036 0.076 0.106 0.158 0.190 以吸光度为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线，见图 1。回归方程y=0.0077x-0.0026,R2=0.9968，结果表明葡萄糖质量浓度在 0 25 g/mL 范围内与其吸光度值呈现良好的线性关系。 按 3.1 项下的操作步骤测定样品吸光度。实验结果见表 2 表 2 含量测定实验结果 样品 1 2 3 平均值 吸光度 (A) 0.069 0.071 0.070 0.070 根据 标准曲线方程 计算 蜈蚣藻 多糖溶液的浓度 C( g/mL)为 9.4
26、3 g/mL。 y = 0.0077x - 0.0026R2= 0.9968-0.0500.050.10.150.20.250 5 10 15 20 25 30葡萄糖浓度 ( g/mL)吸光度A图 3-1 葡萄糖的标准曲线 9 4.2 单因素试验 4.2.1 微波功率对多糖提取率的影响 048121620400 500 600 700 800 900 1000微波功率 W多糖提取率%图 3-2 微波功率对多糖提取率的影响 由图 3-2 微波功率对多糖提取率的影响可知微波功率在 600W 时，多糖的提取率是最大的。 4.2.2 温度对多糖提取率的影响 0510152060 70 80 90 100 110 120温度 多糖提取率%图 3-3 温度对多糖提取率的影响 由图 3-3 温度对多糖提取率的影响可知提 取温度在 90 时，多糖的提取率是最大的。 4.2.3.提取时间对多糖提取率的影响 051015204 6 8 10 12 14 16时间（min)多糖提取率%图 3-4 提取时间对多糖提取率的影响 由图 3-4 提取时间对多糖提取率的影响可知提取时间在 10min 时，多糖的提取率是最大的。
